본 연구에서는 전라남도 담양군 담양읍에서 2016년 4~6월경에 채취한 왕대 (Phyllostachys bambusoides) 및 솜대 (Phyllostachys nigra var. Enonis Stapf.) 줄기를 자연 건조하여 사용하였다. 대조군으로 사용한 실리카는 중국산 대나무에서 유래된 순도 70%의 상업용 대나무 실리카 (commercial bamboo silica)를 사용하였다 (Bamboo leaf organic silicon, Shaanxi Ciyuan Biotech Co., Ltd., China).

건조된 왕대와 솜대 줄기를 분쇄한 후 전기로 (FUW232PA, ADVANTEC, Japan)를 이용하여 900°C에서 7시간 동안 연소하였다. 연소된 왕대, 솜대 줄기 5 g을 6 N HCl을 사용하여 70°C에서 1.5시간 동안 교반하여 여과하고 pH 7.0이 되도록 세척 후 필터하였다 [12,13]. 고체 여과물을 중화시킨 후 2.5N NaOH로 80°C에서 2시간 동안 교반하여 액상의 조실리카 (Na2SiO3)를 추출하였다. 이 액체를 3,000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 상등액을 수거한 후 6 N H₂SO₄를 사용하여 pH 2.5로 맞추면 Si(OH)₄와 Na₂SO₄가 생성된다. 이를 원심분리하여 침전물을 증류수로 세척하면 Na₂SO₄는 용해되고 Si(OH)₄는 침전된다. 침전된 Si(OH)₄를 60°C에서 36시간 동안 건조시킨 후 450°C에서 2 시간 동안 하소 (calcination)시켜 H₂O를 제거하고 최종적으로 실리카를 수거하였다. 왕대 줄기에서 추출한 실리카는 PBS (P. bambusoides silica)로 솜대줄기에서 추출한 실리카는 PNS (P. nigra var. Enonis Stapf. silica)로 명명하였다 (Fig. 1).

Figure 1. Schematic representation of bamboo silica extraction from domestic bamboo stems (PNS: Phyllostachys nigra vqr. Enonis Stapf. silica, PBS : Phyllostachys bambusoides silica, *: After washing, **: SiO₂).

본 연구에서는 XRD를 사용하여 PBS, PNS의 결정구조를 분석하였으며, 결정구조는 다기능 X-선 회절분석기 (X'Pert PRO MPD, PANalytical, Nederland)를 사용하여 분석하였다. 분석조건은 40 Kv/30 mA, 10~60° 2θ 구간에서 주사간격 0.02°, 주사시간 1 s로 설정하였다.

본 연구에서는 PBS, PNS의 작용기와 순도를 분석하기 위해 Fourier transform infrared (IRAffinity-1S FT-IR, SHIMADZU, Japan)를 이용하여, 4000-400 cm^-1 범위의 파장에서 4 cm^-1의 분해능으로 스펙트럼을 기록하였다.

FE-SEM는 전자빔을 표면에 집중하여 표면에서 발생된 이차전자를 수집하여 그 신호를 형상화시키는 현미경으로 EDS 가 부착되어 있어 표면성분에 대한 연구를 수행할 수 있다. 본 연구에서는 PBS, PNS의 표면과 조성을 분석하기 위하여 주사전자현미경 (S-4800, Hitachi, Japan) 및 에너지분산분석기 (Energy dispersive X-ray spectroscopy, Oxford, England)를 이용하여 관찰하였다.

PBS, PNS의 피부 주름 억제 효과를 확인하기 위해 collagenase 저해 활성을 측정하였다 [14]. Collagenase 저해활성은 0.1M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-DArg (0.3 mg/mL)를 녹인 기질액 0.5 mL 및 시료용액 0.2 mL의 혼합액에 200 units/mL의 농도로 제조한 collagnease type I 효소 (C0130, Sigma, USA) 용액 0.3 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 5% citric acid 0.5 mL을 넣어 반응을 정지시킨 뒤, ethyl acetate 1 mL을 첨가하여 320 nm 에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

피부 주름 개선효과를 확인하기 위해 Kwak 등 [15]의 방법을 변형하여 실험하였으며, 기질로서 N-succinyl-(L-Aal)3-p-nitroanilide를 사용하여 37°C에서 30분간 p-nitroanilide의 생성량을 측정하였다. 각 시험용액을 100 μg/mL씩 시험관에 취하고 pancreatic solution (Type I: from porcine pancreas 유래, 0.6 unit/mL, Sigma Aldrich, USA)용액 50 μg/mL을 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(LAla) 3-p-nitroanilide(1mg/mL)을 100 μg/mL을 첨가하여 30분간 반응시키고 microplate reader를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

B16F10 cell line은 한국 세포주은행에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, USA), 0.2% sodium bicarbontate를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Sigma, USA)를 배지로 사용하였고, 37°C 온도에서 4% CO₂, 37°C 상태로 배양하였으며, 세포가 바닥 면적의 90% 정도까지 자란 상태에서 계대배양하여 실험을 진행하였다.

B16F10 cell suspension을 6 well에 1×10⁵ cells/well 농도로 200 μL씩 분주하여 배양기에서 24시간 동안 안정화를 시킨 후 시료를 농도별로 단독 혹은 다른 항산화제들과 함께 병용 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. Vistica의 방법 [16]에 따라 2.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 well당 100 μL씩 넣어 1시간 동안 배양기에 방치한다. 이후 상등액을 제거하고 DMSO를 well당 200 μL씩 가하고 1분간 shaking하여 formazan을 완전히 용해시킨 후 ELISA Bio-Tek instrument Inc. (Winooski, VT, USA)을 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에 사용한 MTT, DMSO는 Sigma-Aldrich (USA)사에서 구입하였다.

모든 결과값은 세 번 반복실험 후 통계처리하였으며, 실험에 의해 얻어진 값들의 평균±표준편차로 나타내었다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 SPSS 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 t-Test를 실시하였으며, p<0.05 이하 경우 유의하다고 판정하였다.

실리카의 추출 수율은 건조된 대나무 줄기를 분쇄하여 전기로에 연소한 후 재 (ash)의 무게를 기준으로 계산하였다. PBS와 PNS의 추출 수율은 각 각 32.54%, 30.81% 였다. 한편, 대나무 잎의 실리카 추출 수율은 약 50.20%로서 대나무 줄기의 추출 수율보다 높았다. 이는 대나무 줄기보다 잎에 실리카의 함량이 높다는 기존 연구 결과와 일치한다 [17,18]. 또한, 대나무의 종, 성장기간 및 환경 등에 따라서 구성성분의 차이가 발생하기 때문에 추출 수율에 차이가 발생한 것으로 보인다.

XRD 분석결과 PBS, PNS에서 2θ가 22°일 때 광범위한 피크 (peak)가 관찰되었는데 이는 추출된 실리카가 비정질 구조인 것을 의미한다 (Fig. 2). Palanivelu 등 [19]은 왕겨 (rice hull)를 산 처리 후 전기로에서 3시간동안 650, 700, 750°C에서 하소시켜 실리카를 추출하여 XRD로 구조 분석을 하였다. 그 결과 2θ가 22°일 때 광범위한 피크가 가지고 있었으며 추출한 실리카는 비정질 구조를 가지고 있는 것을 확인하였다 [20].

Figure 2. XRD patterns of commercial bamboo silica, Phyllostachys nigra vqr. Enonis Stapf. silica (PNS) and Phyllostachys bambusoides silica (PBS).

FT-IR의 흡수 스펙트럼으로 실리카의 작용기와 순도를 측정 할 수 있다. 대조군으로 사용된 상용 대나무 실리카, PBS, PNS 모두 약 1060, 802, 472 cm^-1에서 피크를 보였다. 이중에서 1060 cm^-1의 강하고 광범위한 피크는 Si-O-Si의 asymmetric stretching vibration을 의미하는데, 이는 Si와 O 원자의 결합 구조 배열이 입자크기 (particle size)가 더 작아지도록 변화했기 때문이다. 그리고 802 cm^-1의 sharp한 피크는 Si-O bending vibration을 의미하며 472 cm^-1의 피크는 Si-O-Si bending vibration을 의미한다 (Fig. 3). 선행 연구에서 인도 자생 대나무인 Dendrocalamus strictus (Roxb.) Nees의 잎에서 실리카를 추출하여 FT-IR 분석 결과 1093, 809, 467 cm^-1에서 피크를 가진다는 보고가 있었으며, 이는 본 연구 결과와 매우 유사하다 [21,22]. 한편 실리카의 추출과정에서 완벽한 정제과정이 이루어지지 않으면 –OH의 작용기를 가지는 silanol이 남아있거나, H₂O가 존재하여 3200~3600 cm^-1에서 광범위한 피크를 갖게된다. PNS, PBS의 FT-IR 측정결과 3200~3600 cm^-1에서 피크가 존재하지 않아 추출된 실리카의 순도가 높은 것으로 판단된다.

Figure 3. FT-IR spectra of commercial bamboo silica, Phyllostachys nigra vqr. Enonis Stapf. silica (PNS) and Phyllostachys bambusoides silica (PBS).

상용 대나무 실리카, PBS, PNS의 입자크기는 각각 80.17±45.38 μm, 53.94±30.22 μm, 70.77±48.92 μm였다 (Fig. 4). 이 입자들은 응집성을 가지는 것을 확인하였다. EDX 분석 결과 시중에서 판매되고 있는 대나무 실리카는 C, O, Si로 구성되어 있으며 O 함량은 55.85 wt%, Si 함량은 36.91 wt%이었다. PBS는 C, O, Si, S로 구성되어 있고 O 함량은 49.01 wt%, Si 함량은 40.58 wt%로 확인되었다. PNS는 O, Si로만 구성되어 있으며 O 함량은 52.55 wt%, Si 함량은 47.45 wt%로서 순도가 가장 높게 분석되었다 (Fig. 4).

Figure 4. SEM and EDX analysis of silica: (A, B) SEM and (C) EDX of commercial bamboo silica; (D, E) SEM and (F) EDX of Phyllostachys nigra vqr. Enonis Stapf. silica (PNS); (G, H) SEM and (I) EDX of Phyllostachys bambusoides silica (PBS).

주름개선의 효과는 콜라겐을 분해하는 collagenase, 젤라틴을 분해하는 gelatinase의 작용, 탄력섬유를 분해하는 elastase의 작용을 기본으로 한다 [23,24]. Collagen은 피부의 fibroblast에서 합성되며, 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도등의 기능이 알려져 있다 [25]. 본 연구의 결과 PBS의 collagenase 저해활성 실험결과 IC₅₀ 값은 292.60 μg/mL 확인되었으며 PNS의 IC₅₀ 값은 174.14 μg/mL 이었다. 한편 양성대조군으로 사용한 retinol과 tocopherol의 IC₅₀값은 각각 49.43 μg/mL, 63.70 μg/mL로 측정되었다. 또한 PBS의 elastase 저해활성 실험결과 IC₅₀ 값은 377.03 μg/mL으로 확인되었고 PNS의 IC₅₀ 값은 179.46 μg/mL이었다. 양성대조군으로 사용한 retinol과 tocopherol의 IC₅₀ 값은 각각 54.82 μg/mL, 89.44 μg/mL로 측정되었다 (Fig. 5). 이와 같은 결과로 보았을 때 대나무 줄기유래 실리카는 매우 높은 collagenase 저해 활성 및 elastase 저해활성이 있음을 알 수 있다. Jeon [26]의 연구에서는 대나무 죽여 추출물 3T3-L1 cell 에 처리하였을때 세포의 증식 및 분화 시 기저막 단백질인 type IV collagen 및 BM 40의 합성에 미치는 영향을 조사하였는데 죽여 추출물이 세포 증식을 촉진한다는 결과를 보고하였다. 추후 세포 수준에서 대나무 실리카의 콜라겐 합성 및 관련 단백질 발현에 관한 추가 연구가 필요하다고 사료된다.

Figure 5. (A) Collagenase inhibition activity and (B) elastase inhibition activity of Phyllostachys nigra vqr. Enonis Stapf. silica (PNS) and Phyllostachys bambusoides silica (PBS).

대나무 줄기 유래 실리카의 세포 독성을 측정하기 위해 각각 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 농도범위에서 세포 독성을 측정하였다. 실험한 농도 전체에서 24 시간이 지난 후 세포독성은 나타나지 않았다 (Fig. 6). 이와 같은 결과는 기존의 연구에서 간암 세포주 (HepG2)에 실리카를 처리했을 때, 200 μg/mL 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았던 연구 결과와 유사하다 [27]. 추후 실험시간을 각각 달리하거나 피부에 관련된 다양한 세포에서의 생존성도 조사할 필요가 있다고 판단된다. 대한화장품 산업연구원에서 제시한 화장품 성분중에서 생리 활성 성분의 기준은 5~8% 미만이며, 본 연구에서 실험한 실리카의 농도 기준으로 환산해 보았을 때, 0.01%이므로 화장품 소재 적용 시 매우 안전하다고 판단된다.

Figure 6. Cytotoxicity of (A) Phyllostachys nigra vqr. Enonis Stapf. silica (PNS) and (B) Phyllostachys bambusoides silica (PBS). MTT assay was performed using B16F10 cell line.