실험에 사용한 암라 (Phyllanthus emblica L.)는 2018년 Kailasam international (인도산)에서 구입하여 추출에 사용하였다. 1차 추출시 무게 대비 8배, 2차 추출시 6배 부피의 70% EtOH을 첨가한 후 환류냉각관을 부착한 70°C의 heating mantle (HM250C, Sercrim Lab Tech, Seoul, Korea)에서 각 3시간 추출시켜 여과 (No. 2, Whatman, Maidstone, England)하였다. 이렇게 1, 2차 추출액을 얻어 모두 혼합한 후 rotatory vacuum evaporator (HS-2005S-N, Hahn Shin Scientific Co., Kyounggi, Korea)로 용매를 증발시켜 농축하여 시료로 사용하였다.

암라 추출물 200 mg에 10 mL 가수분해 용액 (EtOH : DW : HCl = 50:20:30)을 가하고 100°C 환류냉각 수욕상에서 1시간 동안 가수분해한 후 방냉하고, 이를 50 mL 정용플라스크에 넣어 메탄올로 정용한 후 0.45 μm PTFE syringe filter 로 여과한 용액을 시험용액으로 사용하였다. 표준물질로는 ellagic acid (Aldrich Co., USA)를 적정한 농도로 희석 조제하여 표준곡선을 작성하였다. Ellagic acid 분석은 액체크로마토그래피 (HPLC, Agilent 1260 Infinity, USA)를 사용하였다. 분석용 컬럼은 Capcellpak C18 UG120 (250 mm×4.6 mm, 5 μm; Shiseido, Kyoto, Japan), 검출파장은 370 nm, 이동상으로는 용매 A - 1% phosphoric acid in DW와 용매 B - methanol을 이용하여 Table 1의 기울기 용매조건으로 분석하였으며, column 온도는 30°C, 유속은 1.0 mL/min 속도로 유지시켰고, 시료주입량은 10 μL로 하였다 (Table 1).

Table 1 . Mobile Phase of HPLC conditions for ellagic acid analysis

Time (min)	1 % Phosphoric acid in DW (%)	MeOH (%)
0.0	70	30
15.0	30	70
23.0	30	70
25.0	70	30
30.0	70	30

The analytical column was Capcellpak C18 UG120 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm; Shiseido, Kyoto, Japan), the detection wavelength was 370 nm and the mobile phase was 1% phosphoric acid in DW and methanol. The column temperature was maintained at 30oC, the flow rate was 1.0 mL / min, and the sample injection volume was 10 μL.

인간모유두세포 (Human dermal papilla cell(HDPC)는 (주)영사이언스로부터 구입하여 사용하였고, 세포 배양에 사용한 배지는 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium; Hyclone, Dallas, TX, USA) 배지에 10% FBS (fetal bovine serum; Hyclone)와 1% penicillin-streptomycin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 기본 배지로 사용하였고, 37°C, 5% CO₂조건 하에서 배양하였다. 모유두 세포를 96 well-plate에 한 well당 1×10⁴개로 분주하여 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 10% FBS가 들어있는 배지에서 약 24시간 배양하였다. 배양세포에 테스토스테론 (2 nM)처리에 따른 탈모조건을 형성시킨 후 암라 추출물을 농도별로 처리하여 72시간 배양하였으며 세포의 증식 및 사멸은 MTT (tetrazole; Sigma Aldrich) assay에 의해 관찰하였다. MTT 용액 (20 μL of 5 mg/mL)을 각 well에 첨가하고 4시간 배양 후 DMSO를 넣어 발색하고 540 nm에서 흡광도 값을 측정하여 비교하였다.

5α-reductase 활성의 측정은 Human 5α-reductase / SRD5A1 ELISA Kit (LS Bio, Seattle, USA)를 사용하였다. 96 well-plate에 한 well당 1×10⁴개로 분주하여 24시간 배양 후 테스토스테론 (2 nM) 및 암라 추출물 또는 양성대조군인 Minoxidil (1 μM)을 처리하였다. 다시 24시간 배양 후 상등액 100 μl의 샘플과 표준 시약 (5α-reductase)을 분주한 플레이트를 37°C에서 120분 동안 반응시켰다. 이후 용액을 제거한 플레이트에 100 μl의 detection reagent A를 첨가하여 37°C에서 60분간 반응시킨 후, 용액을 제거한 뒤 3차례 세척한 후 100 μl의 detection reagent B를 첨가하여 37°C에서 60분간 반응시켰다. 용액 제거 후 5차례 세척한 후 90 μl의 TMB 기질 용액을 넣고 37°C에서 30분간 반응시켰으며, stop 용액을 50 μl 첨가하고 450 nm에서 값을 측정하였다. 이렇게 측정한 흡광도를 이용하여 테스토스테론 (2 nM)을 처리한 군 대비 5α-reductase의 활성을 백분율로 계산하였다.

모유두세포의 성장억제인자로 알려져 있는 TGF-β1 및 DKK-1의 측정을 위하여 Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA) 및 Human DKK1-1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 테스토스테론 (2nM) 및 암라 추출물을 처리하여 24시간 배양한 후 세포상등액과 표준 시약 100 μl을 첨가한 플레이트를 상온에서 150분 동안 반응시켰다. TGF-β1의 검출을 위하여 biotinylated TGF-β1 detection antibody 100 μl를 처리하였으며, DKK-1의 검출은 biotinylated DKK1 detection antibody를 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 4차례 washing 후 각각 HRP-Streptavidin solution을 100 μl씩 첨가하고 45분 동안 반응시킨 후 세척하고 TMB 용액으로 30분간 반응시킨 후 stop 용액을 50 μl 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 테스토스테론 (2 nM)을 처리한 군 대비 TGF-β1과 DKK-1활성을 백분율로 계산하였다.

모유두세포의 성장인자로 알려져 있는 IGF-1 및 VEGF의 측정을 위하여 Human IGF-1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA) 및 Human VEGF Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA를 사용하였다. 테스토스테론 (2nM) 및 암라추출물을 처리하여 24시간 배양한 후 세포상등액과 표준 시약 100 μl을 첨가한 플레이트를 상온에서 150분 동안 반응시켰다. IGF-1의 검출을 위하여 biotinylated IGF-1 detection antibody 100 μl를 처리하였으며, VEGF의 검출은 biotinylated VEGF detection antibody를 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 4차례 washing 후 각각 HRP-Streptavidin solution을 100 μl씩 첨가하고 45분 동안 반응시킨 후 세척하고 TMB 용액으로 30분간 반응시킨 후 stop용액을 50 μl 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 테스토스테론 (2 nM)을 처리한 군 대비 IGF-1과 VEGF 활성을 백분율로 계산하였다.

본 연구에서 얻어진 모든 측정치는 Mean±SD로 나타내었고, 각 평균치 간 사이에 대한 유의성은 SPSS program (SPSS Inc. ver. 22.0)을 이용하여 ANOVA를 실시한 후, Duncan’s multiple range test로 각 군의 평균 차이에 대한 사후 검정을 실시하였으며, 통계적 유의성을 5% 수준에서 분석하였다.

암라 추출물의 ellagic acid를 분석한 결과는 Table 2에 나타내었으며, 암라 추출물의 총 ellagic aicd 함량은 8.9445 μg/mL이었다.

Table 2 . Ellagic acid content of amla extract

	Amount (mg/g)	Average (mg/g)	SD	RSD
1st	8.8528	8.9445	0.19	2.12
2nd	8.8179
3rd	9.1627

인도의 전승의학 (傳承醫學)인 아유르베다에서 오랫동안 사용되어져 온 암라는 비타민 C와 폴리페놀이 풍부하고 혈액순환을 원활하게 하는 효과가 있어 탈모를 예방하고 모발을 건강하게 하는 효과가 있다고 기록되어 있어 오래 전부터 탈모 예방에 사용되어져 왔다 [19].

본 연구에서 암라 추출물이 모유두세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 테스토스테론을 처리하여 탈모조건을 형성시킨 후 암라 추출물을 농도별 (10, 30, 50, 100, 200 μg/ml)로 처리하여 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 암라 추출물의 모든 처리농도에서 모유두세포의 증식을 촉진시키는 양상이 관찰되었다. 특히 50 μg/ml 농도처리군에서 유의적으로 모유두세포의 증식능 (132±2.19)%을 확인하였으며, 이는 양성대조군인 MXD (1μM)의 123(±2.74)% 보다 높은 세포증식율을 나타내었다. 양성대조군으로 사용한 MXD은 모유두세포의 apoptosis저하를 통해 모유두세포를 증식함이 보고되고 있다 [20]. Li등 [21]은 미녹시딜에 의해 유도 된 모발 성장은 배양된 모유두세포에서 아데노신에 의해 매개되는 것으로 보고하였다.

Figure 1. The effect of amla extract on the cell proliferation in HDPC. The cells were treated with amla extract (10, 30, 50, 100, 200 μg/ml) and testosterone (2 nM) was performed after the establishment of the depilatory environment. Data are presented as the mean ± S.E. Values with different superscripts within the column are significantly at α=0.05 by Duncan’s multiple range test., ^NS: not significance.

5α-reductase는 testosterone을 dehydro-testosterone (DHT)으로 치환을 촉진시켜 탈모를 유발 시키는 주요 인자이다 [4]. 전환된 DHT는 전두부와 두정부에 있는 모유두 세포막의 안드로젠 수용체와 결합하면 모모 세포 (Hair mother cells)의 DNA에 세포파괴 신호가 전달되어 세포괴사인자인 BMP, DKK-1, TGF-β를 생성시킨다 [22,23]. 이렇게 생성된 세포괴사인자는 모모세포를 공격하여 파괴시키며, 모발의 생장기를 짧게 하고 이른 시기에 퇴행기가 오게 한다. 5α-reductase는 주로 피지선에 분비되는 제1형과 모낭의 외측모근초, 모유두에 분포하는 제2형이 있으며 탈모에는 제2형 효소가 주된 원인이다. 따라서 5α-reductase를 억제하거나 제거할 수 있다면 남성형 탈모와 같은 안드로젠성 탈모증을 예방하거나 치료할 수 있으므로 5α-reductase 억제능 평가는 탈모 방지 효과 유무를 알수 있는 중요한 지표라고 할 수 있다 [24].

테스토스테론을 처리하여 탈모 환경을 유발한 모유두세포에 암라 추출물을 다양한 농도로 처리하여 MXD와 비교한 5α-reductase의 활성을 Fig. 2에 나타내었다. 테스토스테론 단독처리군과 비교했을때, 암라 추출물 10 μg/ml처리시 81.73(±1.24)%, 30 μg/ml에서 63.55(±1.09)%, 50 μg/ml에서 44.08(±0.78)%, 100 μg/ml에서 47.03(±1.77)%의 활성을 나타내어, 5α-reductase 억제 효과는 암라추출물에 농도의존적인 것으로 나타났다. 50 μg/ml(44.08(±0.78)%)와 100 μg/ml(47.03(±1.77)%)의 두 농도가 농도 간 유의하지 않은 차이로 가장 높은 억제효과를 나타내었다.

Figure 2. The effect of amla extract on the 5α-reductase activity in HDPC. The cells were treated with amla extract (10, 30, 50, 100 μg/ml) and testosterone (2 nM) was performed after the establishment of the depilatory environment. Data are presented as the mean ± S.E. Values with different superscripts within the column are significantly at α=0.05 by Duncan’s multiple range test., ^NS: not significance.

TGF-β1은 outer root sheath (외모근초)에서 생성되어 정상적인 모낭의 성장기를 조기에 퇴행기로 촉진하는 역할을 하는것으로 알려진 인자이며 [25], DKK-1은 세포 괴사를 촉진하여 탈모를 유발하는 대표적인 negative cytokines 중의 하나로, 남성호르몬 (DHT) 유도물질인 DKK-1 단백질이 Wnt/β-catenin 신호 경로의 작용을 억제하여 탈모를 일으키는 것으로 알려져 있다 [26].

70% (v/v)의 에탄올 용액을 이용하여 추출한 암라 추출물을 testosterone을 처리하여 탈모 환경을 유발한 모유두세포에 농도별로 처리하여 TGF-β1 & DKK-1 활성을 측정한 결과는 Fig. 3(A)와 3(B)에 제시되었다. TGF-β1의 경우 암라 시료를 10, 30, 50, 100 μg/ml 농도로 처리시, 각각 102.68(±2.55)% 93.30(±1.37)%, 88.30(±1.82)%, 83.72(±0.78)%로 나타나 농도가 높아질수록 TGF-β1의 활성이 감소하는 경향을 보였으며, 양성대조군 (MXD(1μM))은 45.15(±1.63)%의 활성을 나타내었다. (Fig. 3(A)). 또한, DKK-1의 활성은 양성대조군인 MXD(1 μM)은 21.73(±0.49)%이었고, 암라의 농도별 (10, 30, 50, 100 μg/ml) 처리시 각각의 농도에서 116.14(±2.28)%, 101.27(±1.21)%, 96.53(±1.45)%, 99.26(±0.64)%로, 유의한 차이는 아니지만 다소 감소하는 경향을 나타내었다 (Fig. 3(B)). 이를 바탕으로 암라 추출물은 세포자살인자 (Cell Apoptosis Factor) 인 DKK-1, TGF-β1과 같은 모근세포 자살인자의 분비를 억제하여 탈모예방 효과가 있을 것이라 예상한다.

Figure 3. The effect of amla extract on the TGF-β1 (Transforming Growth Factor -β1 )(A) & DKK-1(Dickkopf-1) (B) activity in HDPC. The cells were treated with amla extract (10, 30, 50, 100 μg/ml) and testosterone(2 nM) was performed after the establishment of the depilatory environment. Data are presented as the mean ± S.E. Values with different superscripts within the column are significantly at α=0.05 by Duncan’s multiple range test., ^NS: not significance.

IGF-1은 모낭 및 상피세포의 성장을 촉진하는 대표적인 성장인자로 알려져 있다 [27]. 또한 모낭이 성장기에서 퇴행기로 이행할 때 IGF-1을 첨가하면 퇴행기로의 이행을 억제한다고 보고하였다 [28]. 모유두세포의 세포사멸을 방지하며, 모유두세포에서 IGF-1 생성에 남성호르몬이 직접적으로 영향을 미친다 [29].

VEGF는 혈관 내피를 성장시켜 혈액 순환을 개선하여 모발의 성장과 모근 세포의 분화를 유도시키는 인자로 알려져 있으며 모발 관련 연구에 적용되는 중요지표인자 중의 하나이다 [6].

Testosterone을 처리하여 탈모 환경을 유발한 모유두세포에 다양한 농도의 암라 추출물을 처리하여 IGF-1과 VEGF의 활성을 측정한 결과는 Fig. 4(A)와 4(B)에 제시되었다. 모낭 및 상피세포의 성장인자인 IGF-1의 활성은 암라 추출물 100 μg/ml을 처리하였을 때 132.14(±2.35)%로 가장 높은 IGF-1의 분비를 유도하였으며, 농도간의 유의차는 없었지만 모든 암라추출물 처리구간에서 IGF-1의 활성능을 나타내었다 (Fig. 4(A)). 또한 VEGF활성은 148.37(±1.19)%로 암라 추출물 50μg/ml 처리시 가장 우수한 활성을 보였다 (Fig. 4(B)).

Figure 4. The effect of amla extract on the IGF-1(Insulin-like growth factor-1) (a) & VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) (b) activity in HDPC. The cells were treated with amla extract (10, 30, 50, 100 μg/ml) and testosterone (2 nM) was performed after the establishment of the depilatory environment. Data are presented as the mean ± S.E. Values with different superscripts within the column are significantly at α=0.05 by Duncan’s multiple range test., ^NS: not significance.

IGF-1과 VEGF 활성은 농도의존적으로 암라 추출물은 상피세포의 성장 촉진을 유도하여 모발 성장 촉진 효과가 있는 것으로 사료된다.