Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2019; 34(2): 114-119
Published online June 30, 2019 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.2.114
Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.
Gun He Nam1, Kyung Jo Jo1, Ye Seul Park1, Hye Won Kawk1, Ji Hyang Wee2, Ju Hwan Kim3, Ji Hun Kim4, and Young Min Kim1,*
1Department of Biological Science and Biotechnology, Hannam University, Daejeon 34054, Korea
Correspondence to:*Department of Biological Science and Biotechnology, Hannam University, Daejeon 34054, Korea Tel:
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대장암은 전체 암중에서 발생률이 2~3위를 차지할 정도로 높은 발생률을 보이고 있다 [1]. 또한, 국제 암 연구소 보고에 따르면 2015년 국내 대장암 발생률은 인구 10만 명 당 45명으로 발생률 세계 1위를 기록하고 있다고 보고되고 있다 [2]. 이러한 대장암은 스트레스, 비만, 유전, 음주 등 유전적, 환경적 요인이 복합적으로 작용해 발생한다. 현재 대표적인 암 치료법은 외과적 수술, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 표적항암요법 등이 있다 [3]. 이 중에서 화학요법과 방사선요법은 부작용이 심해 보통 종양 자체보다도 환자의 정상 조직에 더욱 심각한 손상을 가하는 경우가 많다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 화학요법과 방사선요법에 부작용을 줄여주어 전반적인 암 환자의 삶의 질과 생존율을 높여줄 수 있는 천연물 소재를 이용한 항암치료가 각광을 받고 있다 [4]. 그 중 녹나무 (
대표적인 항암기전으로 알려진 세포사멸 (Apoptosis)은 프로그램 된 세포죽음으로 세포수축, 핵의 응축 및 세포막 기포 형성의 특징을 갖으며, 세포가 제대로 사멸하지 않으면 몇몇 세포들의 돌연변이가 암으로 진행될 수 있기 때문에 매우 중요한 과정이다 [6]. Apoptosis의 경로에는 extrinsic pathway와 intrinsic pathway로 구분된다. 특히 미토콘드리아는 Apoptosis의 경로 중 intrinsic pathway에서 중요한 역할을 수행하며, Anti-apopototic 단백질인 Bcl-2와 Pro-apoptotic 단백질인 Bax 단백질의 상대적인 비율에 영향을 받는다. 여러 가지 신호나 자극에 의해 Pro-apoptotic 단백질인 Bax 단백질 발현이 상대적으로 증가하게 되면 미토콘드리아 외막의 투과성이 증가하여 미토콘드리아 막 사이의 공간에서부터 cytochrome C가 방출되어 caspase complex를 만드는데, 이것은 최종적으로 pro-caspase 3을 cleaved-caspase 3 상태로 만들어 Apoptosis의 최종적인 단계인 caspase cascade를 촉진시킨다 [7]. 이러한 apoptosis의 선행 단계로 자가소화작용 (Autophagy)가 일어나는데, 일반적으로 Autophagy는 Apoptosis의 유도를 막으며 caspase 활성을 멈추게 한다고 알려져 있다. 하지만, Autophagy가 과도하게 세포질을 분해시킬 경우에는 Apoptosis과 더불어 세포 죽음을 일으킨다. p62에 의해 ubiquitination된 세포소 기관들은 LC3-I, II complex와 함께 Autophagosome 을 형성하여 세포질을 분해시킨다 [8]. 따라서 본 연구는 Apoptosis와 Autophagy를 조절하며 암세포 활성에 중추적인 역할을 하고 있는 mTOR 단백질의 발현에 의한 세포사멸 및 자가소화작용 관련 단백질의 발현 결과를 확인하여 녹나무 에탄올 추출물 (
실험에 사용된 녹나무의 원산지는 대한민국 제주도이며, 갑당약초에서 2018년 6월경에 구입하였다. 녹나무 100 g에 94.5% 에탄올 800 mL를 가하여 72시간 동안 교반기를 이용해 상온에서 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 녹나무를 감압농축기를 이용하여 감압 농축시켜 0.864 g의 농축된 추출물은 −86°C에서 보관하였다. 농도별 녹나무 에탄올 추출물 (50~150 μg/mL)을 동일 용량의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 만들었으며 −4℃에서 냉동 보관하여 사용하였다. Rapamycin은 Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, USA)에서 구입하였다.
HCT116대장암세포 및 HT-29대장암세포는 American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA)에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 RPMI media (HyClone Laboratris Inc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였다. CCD841 정상 대장 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 DMEM media (Dulbecco's Modified Eagle Medium)로 48시간 마다 trypsin-EDTA (HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 1 × 106 cells/mL로 분주하고 계대배양하였다.
세포 배양용 12 well plate에 HCT116 및 HT-29대장암세포를 3.8×105 cells/mL로 분주하고 24시간 배양하였다. 동시에, CCD841정상 대장 세포를 3.8×105 cells/mL로 분주하고 24시간 동안 배양시킨 후 CCE (50~150 μg/mL)를 처리하였다. WST-1용액을 media volume의 1/10만큼 첨가하여 60분 동안 5% CO2, 37°C 조건에서 배양한 후, 96 well plate에 100 μL씩 분주하여 FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
6-well plate에 HCT116 및 HT-29대장암세포와 CCD841정상 대장 세포를 well당 1×10 cells/mL로 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 CCE (100 μg/mL)를 처리하였다. 24시간 동안 배양시킨 후 도립현미경 (X400 magnification, Axiovert 100, Zeiss, Germany)을 이용하여 cell morphology change를 관찰하였다.
세포 배양용 12 well plate에 HCT116 및 HT-29대장암세포를 1×106 cells/mL로 분주하고 암세포가 90% 이상 가득 찰 정도로 배양시킨다. 그 후에 pipette tip을 이용해 12 well plate에 scratch를 내준다. 그런 다음 CCE (100 μg/mL)를 처리하였다. 24시간 후, scratch 를 낸 부위에서 CCE에 의해 세포 이동성 및 증식 정도를 도립현미경 (X400 magnification, Axiovert 100, Zeiss, Germany)을 이용하여 측정하였다.
SPLinsert Hanging 24 well plate (pore size 8 μm)의 insert에 Corning Matrigel Matrix (Corning, USA)을 도포한 후에 HCT 116 및 HT-29대장암세포를 1×105 cells/mL로 분주하고 bottom에는 10% fetal bovine serum (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 RPMI media (HyClone Laboratris Inc.)를 분주하였다. 그런 다음 insert 부분에 CCE (100 μg/mL)를 처리하여 대장암세포의 전이성 및 이동성을 확인하였다. 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양한 후에 10% 포르말린으로 고정시켜 100% MeOH로 막 투과성을 증가시킨 후에 Wright-giemsa stain을 이용해 대장암세포를 염색시킨 후 도립현미경 (X400 magnification, Axiovert 100, Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
6 well plate에 HCT 116 및 HT-29대장암세포를 well당 1×10 cells/mL로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 CCE (100 μg/mL)를 처리하였다. Rapamycin처리시에는 Rapamycin (100 nM)을 60분 먼저 처리한 후 CCE를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 RIPA lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1% NP-40, 0.5% sodiumdeoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 각 well에 150 μl씩 첨가하여 단백질을 분리한 후, 14,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 추출한 단백질은 FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 그 다음에 8%, 12% acrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 5% Bovine serum albumin (BSA)을 이용해 1 시간 동안 blocking하고, 1 차 항체를 4℃에서 16 시간 처리한 후에 2차 항체를 결합시켜 1~2시간 동안 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence (ECL) solution (Thermo, USA)을 사용해 UVITEC Gel-imaging System (Philekorea, Korea)과 X-ray film을 이용해 관찰하였다.
통계 프로그램인 SPSS (Statistical Package for the Social Science) 22.0 프로그램을 사용하였고 실험 설계에 대한 분산 분석은
CCE가 HCT 116 및 HT-29 대장암세포에 특이적으로 미치는 영향을 확인하기 위해 HCT116 및 HT-29 대장암세포와 CCD841 정상 대장 세포에 CCE를 농도별 (50~150 μg/mL)로 처리 후 WST-1 assay를 이용하여 세포독성을 조사하였다. 그 결과 CCE를 24시간 동안 처리하였을 때 농도 의존적으로 HCT 116 및 HT-29 대장암세포 증식이 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 1(a), 1(b)). 반면에, 정상 세포인 CCD 841 정상대장세포에 대한 CCE의 세포독성은 증식률이 90% 이상으로 유지되며, 미 처리군과 차이가 없는 것 (not significant)으로 보아 정상세포에서 CCE의 독성이 없음을 확인하였다 (Fig. 1(c)). Apoptosis가 유발되면 세포는 염색질의 응축과 원형질 막에 생기는 수포, 그리고 막으로 싸인 소체로 세포가 분열된다, 또한, 세포 이동에 중요한 역할을 하는 lamellipodia와 filopodia가 손실되어 세포가 부착력을 잃게된다. 따라서 CCE를 HCT 116 및 HT-29 대장암세포에 농도별로 처리했을 때 이러한 apoptosis의 형태학적 변화와 세포증식이 억제되는 것을 관찰하였다. 그 결과 Fig. 1(d)에 나타낸 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 control 군에서는 세포가 밀도가 비교적 높고 균일하며 정상적으로 부착되어 밀집되어 있는 모습을 볼 수 있었고, CCE 처리군에서는 세포의 모양이 불규칙하고 밀도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 그와 동시에 CCD 841 정상 대장세포에서는 형태학적 변화가 관찰되지 않았다. 결론적으로, CCE는 농도의존적으로 HCT 116 및 HT-29 대장암세포에 특이적으로 세포독성을 보이며, 차후 연구에서
앞서 확인한 CCE의 암세포 증식 억제 효과와 연관되어 암세포의 이동성과 전이성 억제효과를 알아보기 위해 HCT 116 및 HT-29 대장암세포에 CCE를 24시간 처리하여 Wound healing assay와 cell invasion assay를 이용해 암세포의 이동성과 전이성 억제 유무를 확인하였다 (Fig. 2(a), 2(b)). 그 결과, 미 처리군에 비해 scratched wound area가 상대적으로 더 적게 이동 및 회복 되는 것을 볼 수 있었고, CCE로 인해 암세포의 활성 및 이동성이 감소하여 Matrigel이 도포된 membrane을 통과하는 암세포의 수가 현저히 줄어드는 것을 관찰하였다.
미토콘드리아는 apoptosis intrinsic pathway에서 중요한 역할을 하며, 그 막 전위를 유지하는데 중요한 역할을 하는 단백질로는 Bcl-2 family가 있다. anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2는 미토콘드리아 막의 안정화를 유지하고 pro-apoptotic 단백질인 Bax는 미토콘드리아 막으로 이동하여 막 투과성을 증가시키는 역할을 한다. 미토콘드리아에서 apoptosis 과정이 활성화되면 caspase cade 과정에 핵심적인 caspase-3가 활성화되어 pro-caspase 3이 분절되어 cleaved-caspase 3이 개입하여 Apoptosis가 유발된다. 또한, Autophagy 관련 단백질인 p62에 의해 ubiquitination된 세포소기관들은 LC3-I, II complex와 함께 Autophagosome 을 형성하여 세포질을 분해시킨다. 따라서 본 연구에서는 Apoptosis 관련 단백질인 Bcl-2, Bax, Pro-caspase3 및 cleaved-caspase3의 발현률 뿐만 아니라 Autophagy 관련 단백질인 p62와 LC3-I, II의 발현률을 확인하기 위해 HCT 116 및 HT-29 대장암세포 단백질에 Western blotting을 실시하였다. Fig. 3(a), 3(b)에 나타난 바와 같이, CCE를 처리한 군은 미처리 군에 비해 Bcl-2의 발현이 감소하며 Bax의 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. Apoptosis의 inducer인 caspase-3의 활성 또한 pro- 단계에서 cleaved- 단계로 분절되는 caspase-3의 발현 정도가 증가하는 것을 관찰 하였다. 뿐만 아니라, Autophagy 관련 단백질인 p62의 발현 정도가 감소하면서 LC3-I, II의 발현이 증가하는 것을 관찰 하였다. 이상의 결과를 살펴볼 때, CCE는 Apoptosis 및 Autophagy 관련 단백질에 영향을 미치며 암세포에 특이적으로 독성을 갖기 때문에 CCE로 인한 항암효과는 Apoptosis와 Autophagy에 의한 것임을 확인하였다.
mTOR 단백질은 Apoptosis 뿐만 아니라 Autophagy의 상위 조절 인자로, CCE가 이러한 mTOR 단백질을 저해함으로써 Apoptosis 및 Autophagy를 유발한다는 것을 확인하기 위해 mTOR inhibitor인 Rapamycin을 이용하였다. CCE 및 mTOR inhibitor를 단독 혹은 병행 처리한 후에 WST-1 assay를 통해 암세포 억제 효과를 확인하였다 (Fig 4(a)), Fig. 4(b)에 나타난 바와 같이, Rapamycin 혹은 CCE를 단독 처리한 군에서 Apoptosis 및 Autophagy 관련 단백질들의 발현에 영향을 줬으며, Rapamycin과 CCE 병행 처리 군 또한 Apoptosis 및 Autophagy 관련 단백질들의 발현에 영향을 주었다. 이와 같은 결과로 보아, CCE는 mTOR Pathway를 통해 Apoptosis 및 Autophagy를 유발하여 항암효과를 가지고 있다.
녹나무는 항염증 및 항균의 효능을 지니고 있는 것으로 연구가 되어있지만 항암 작용 기작에 대한 연구는 많이 알려지지 않았다. 따라서 본 연구는 HCT 116 및 HT-29 대장암 세포에서 CCE에 의한 항암 효과를 Apoptosis와 Autophagy를 통해 일어나는지 확인하였다. HCT 116 및 HT-29 대장암 세포에 CCE를 농도별 (50~150 μg/mL)로 처리하였을 때 농도의존적으로 암세포의 증식률이 감소하였으며, CCD 841 정상 대장 세포에서도 같은 조건으로 CCE를 처리한 결과, 세포 독성은 나타나지 않았다. 이와 같은 결과를 통해 CCE는 대장암세포에 특이적으로 세포독성을 나타나며,
정상세포는 영향을 주지 않는 것을 관찰하였다. 또한, 이러한 항암효과는 암세포의 이동성과 전이성을 감소시켜서 혈관 등에 잔류하며 전이되는 암세포의 제거에도 효과적이라고 추측된다. 이러한 항암효과가 Apoptosis 및 Autophagy에 의해 유발된 것인지 확인하기 위해 Apoptosis 관련 단백질인 Bcl-2, Bax의 발현 정도를 확인하여 최종적으로 Apoptosis inducer인 caspase 3이 분절되어 활성을 갖는 것도 확인하였다. 또한, Autophagy 관련 단백질인 p62, LC3-I, II 발현 또한 확인하였다. 마지막으로, CCE가 mTOR 신호 경로를 통해 HCT 116 및 HT-29 대장암 세포에 Apoptosis 및 Autophagy를 유발하는지 확인하기 위해 mTOR 저해제인 Rapamycin과 CCE를 단독 혹은 병행 처리하여 CCE가 mTOR 단백질을 저해하여 Apoptosis 및 Autophagy를 유발하는 것을 확인하였다. 이러한 녹나무 항암 효과는 물론 구성성분에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 따라서 녹나무가 가진 항암 성분에 대한 연구가 필요하며 현재 녹나무의 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피 등을 이용해 잠재적 항암 물질을 분리 및 탐색에 대한 연구가 진행 중에 있다.
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