아미노산은 무수히 많이 존재하지만 실제로 세포 내에서 단백질을 구성하는 것은 20개의 아미노산이다. 하지만 자연적으로 유기체의 유전자 코드로부터 발견되지 않고, 화학적으로 합성되어 번역과정 동안 사용되는 아미노산이 있는데 이를 비천연 아미노산(non-canonical amino acids)이라고 한다[1-3] 최근에는, 세포 내에서 특정한 작용기를 가지고 있는 비천연 아미노산을 genetic code expansion 기술을 이용하여 단백질에 결합시켜, 기능성과 생체 안정성이 증가된 재조합단백질을 생산하는 기술이 개발이 되고 있다 [4-7]. 이렇게 단백질 내에서 선택된 아미노산의 변화를 줌으로써 단백질의 구조나 기능의 변화를 관찰할 수 있으며, 확장된 유전 코드는 다양한 목적으로 단백질을 이해하고 진화시키는 데에 도움이 될 수 있다.

일반적으로, 단백질을 합성하는 과정에서 하나의 아미노산이 단백질 내에 결합하는 과정은 그 아미노산을 지정하는 codon과 이에 상보적인 결합을 하는 anti-codon을 가지는 tRNA, 그리고 이 tRNA와 아미노산을 연결시켜주는 aminoacyl-tRNA synthetase 효소에 의하여 이루어진다. 자연계에서는 비천연 아미노산을 지정하는 codon이 존재하지 않기 때문에, 단백질 내에 비천연 아미노산을 결합시키기 위해서는 amber codon에 결합할 수 있는 orthogonal tRNA와 비천연 아미노산을 결합시켜 줄 수 있는 돌연변이 amber-suppression tRNA synthethase를 이용한다 [3]. 대장균에서 특정 위치에 비천연아미노산이 결합된 재조합 단백질을 생합성하기 위하여, 대장균 내의 stop codon들 중에서 가장 낮은 빈도를 갖는 amber codon을 비천연 아미노산이 결합하는 위치에 도입하고, 대장균 세포 내에서 교차활성을 가지지 않는 돌연변이 tRNA와 amber-suppression tRNA synthethase를 도입한다 [2,3]. 이렇게 비천연 아미노산이 첨가된 재조합 단백질은 발현 이후의 화학적 반응을 통하여 구성 아미노산으로만 이루어진 일반적인 단백질보다 높은 활성과 체내 지속성을 가질 수 있기 때문에, 의료용 단백질 시장에서 바이오 베타로 주목을 받고있다 [6,8].

지금까지 다양한 비천연 아미노산과 이를 결합시킬 수 있는 돌연변이 amber-suppression tRNA synthethase에 관한 연구결과들이 발표되었지만 [4,9], 숙주로 사용되고 있는 대장균 종에 따른 비천연 아미노산의 재조합 단백질내 결합에 관한 연구는 제대로 이루어지지 않았다 [10]. 비천연 아미노산을 결합시키기 위하여 사용된 돌연변이 amber-suppression tRNA synthethase는 재조합 단백질의 특정 위치에 비천연 아미노산을 삽입할 뿐 만 아니라, 대장균 게놈에 존재하는 amber codon 에도 영향을 주게 된다. 이에 본 연구에서는 다양한 대장균 종에서 orthogonal tRNA와 돌연변이 amber-suppression tRNA synthethase를 이용하여 비천연 아미노산이 결합된 재조합 단백질의 발현과 세포 성장을 비교하였다. 이를 위하여 형광 단백질 (superfolder-green fluorescence protein)의 특정 위치에 amber codon을 삽입하였고, 비천연 아미노산이 첨가되어 발현되면 얻어지는 형광값과 세포 성장을 측정하여 대장균 종류에 따른 영향을 비교하였다.

2.1. 균주, plasmid 및 배양 조건

본 연구에서는 대장균 종에 따른 세포 성장과 비천연 아미노산이 결합된 형광 단백질의 발현 영향을 비교하기 위하여 10개의 대장균 종(Escherichia coli B, W, BL21(DE3), DH5α, DH10B, EPI300, TOP10, W3110, XL1-Blue, XL10-Gold)들을 사용하였다 (Table 1). 형광 단백질에 결합되는 비천연아미노산으로 4-Azido-L-phenylalanine (AzF, Sigma-Aldrich, Burlington, MA)을 사용하였으며 [11], 형광 단백질 내에 비천연 아미노산의 결합을 위하여 변형된 tRNA synthetase와tRNACUA 유전자가 포함된 플라스미드인 pEVOL_pAzF (Addgene Watertown, MA)로 형질 전환하였다 [11]. 또한, pSEVA631 벡터 [12]에 amber codon을 가지고 있는 형광 단백질을 클로닝하여 형광 단백질의 발현양을 측정하였다. 이를 위하여, 형광 단백질에 amber codon을 삽입하기 위하여 형광 단백질의 204번째 아미노산 위치에 amber codon이 삽입된 돌연변이 sfGFP204amb를 제작하였다 [4,13]. 제작된 돌연변이 sfGFP204amb는 pSEVA631pt의 EcoRI과 KpnI 위치에 삽입하여 pSEVA631pt-sfGFP204amb를 제작하였다.

Table 1 Genotypes of Escherichia coli strains used in this study

Strains	Genotypes	Resources
B	ATCC 11303	American Type Culture Collection, Manassas, VA
W	ATCC 9637	American Type Culture Collection
BL21(DE3)	E. coli str. B F–ompT gal dcm lon hsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7nin5]) [malB+]K-12(λS)	Thermofisher, Waltham, MA
DH5α	F– endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG purB20 φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK+), λ–	Takara, Kyoto, Japan
DH10B	str. K-12 F–Δ(ara-leu)7697[Δ(rapA'-cra' )] Δ(lac)X74[Δ('yahH-mhpE)] duplication(514341-627601) [nmpC-gltI] galK16 galE15 e14–(icdWTmcrA) φ80dlacZΔM15 recA1 relA1 endA1 Tn10.10 nupG rpsL150(StrR) rph+ spoT1 Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ– Missense(dnaA glmS glyQ lpxK mreC murA) Nonsense(chiA gatZ fhuA? yigA ygcG) Frameshift(flhC mglA fruB)	Invitrogen, Waltham, MA
EPI300	F– λ–mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 Δ(lac)X74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupG' trfA dhfr	Lucigen, Middleton, WI
TOP 10	F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(araleu) 7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-	Invitrogen
W3110	F- λ- rph-1 INV(rrnD, rrnE)
XL1-Blue	endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK-mK+)	Stratagene, La Jolla, CA
XL10-Gold	endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMRmrr)173 tetR F'[proAB lacIqZΔM15 Tn10(TetRAmy CmR)]	Stratagene

10가지 대장균 균주를 competent cell로 제작하여 pEVOL-pAzF와 pSEVA631pt-sfGFP204amb 플라즈미드들을 각각 1 mL씩 분주 후 electroporation을 통해 형질전환 시켜 주었다. 이때 재조합 균주의 선별을 위하여 10 g/L yeast extract, 5 g/L tryptone, 10 g/L NaCl의 조성을 갖는 Luria-Bertani (LB) 배지에 12.5 mg/mL chloramphenicol (Sigma-Aldrich)과 15 mg/mL gentamicin (Thermofisher, Waltham, MA)을 첨가하였다. 18시간 동안 stationary incubator에서 배양 이후, 성장한 colony들 중에서 선별하여 이후 실험을 진행하였다.

재조합 대장균은 LB 배지에 chloramphenicol과 gentamicin을 첨가하여 37°C에서 배양하였다. 형광 단백질의 발현을 위하여 0.2% Arabinose, 0.5 mM AzF를 배양액에 첨가하여37°C, 250 rpm에서 16시간 동안 배양하였다. 재조합 대장균에서 tRNA synthethase의 amber-suppression 활성 여부는 비천연 아미노산 AzF의 첨가에 따른 형광 단백질의 발현 여부로 확인하였다.

2.2. 세포 농도와 형광 단백질 발현 측정

재조합 대장균들의 형광 단백질의 발현 유무는 형광 현미경(ZEISS Axio Scope.A1, ZEISS, Oberkochen, Germany)을 이용하여 확인하였다. 정량적인 측정은 마이크로 플레이트분석기 (Varioskan LUX multimode microplate reader, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 600 nm에서의 흡광값(OD600)으로 세포 농도를 측정하였으며, 형광 단백질의 발현양은 470 nm에서의 excitation, 510 nm에서의 emission 파장 값으로 측정하였다 [14,15]. 단위 세포당 형광 단백질의 발현량 (specific fluorescence intensity)은 형광 단백질의 발현량 (fluorescence intensity)을 흡광도 (optical density)로 나눈 값으로 정의하였다. 각 실험 결과는 각각의 재조합 대장균 별로 3개의 다른 colonies를 배양하여 측정한 평균값으로 표시하였다.

대장균 종에 따른 비천연 아미노산을 결합하고 있는 형광 단백질의 발현을 비교하기 위하여, 먼저 형광 단백질 내에 비천연 아미노산을 결합할 수 있도록 형광 단백질 유전자를 돌연변이 하였다. 형광 단백질의 아미노산 서열과 이전의 연구결과들로부터 204번 위치의 글루타민을 TAG amber codon으로 돌연변이화 하였다 [4]. 제작된 pSEVA631pt-sfGFP204amb와pEVOL-pAzF로 형질전환된 재조합 대장균을 항생제들과 AzF와 arabinose가 포함된 LB 배지에서 배양한 결과는 Fig. 1과같다. 10개의 대장균 종들 중에서 E. coli B와 W가 1.2 이상의 OD₆₀₀ 값으로 가장 높은 세포 농도를 가졌으며, XL1-Blue와 XL10-Gold 들이 0.6 부근의 OD₆₀₀ 값으로 가장 낮은 세포 농도 값을 보였다. 나머지 E. coli BL21(DE3), DH5α, DH10B, EPI300, TOP10, W3110들은 약 0.8 OD₆₀₀ 값 정도의 세포 농도를 보였다. E. coli W와 E. coli XL1-Blue의 OD₆₀₀ 값은 2배이상의 차이를 보였다. 이러한 결과는 XL1-Blue와 XL10-Gold는 형질전환 수율을 높이기 위하여 균주를 조작한 결과비천연 아미노산이 결합된 형광 단백질을 발현하는 숙주 대장균으로는 낮은 성장을 보인 것으로 판단된다. 본 실험에서 사용된 대부분의 대장균 종에서는 비천연 아미노산을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우 모두 비슷한 최종 세포 농도를 보였다. E. coli XL1-Blue의 경우에만 비천연 아미노산을 첨가하지 않은 경우 낮은 세포 농도 값을 가졌다.

Figure 1. Optical density (ODM_{600 nm}) of recombinant Escherichia coli strains with pSEVA631pt-sfGFP204amb and pEVOL-pAzF. Recombinant strains were cultivated for 18 hrs at 37°C in LB media with chloramphenicol, ampicillin, and arabinose with or without AzF, respectively.

Fig. 2와 Fig. 3에서는 다양한 재조합 대장균에서 돌연변이tRNA synthetase의 amber suppression을 비교하였다. 재조합대장균을 AzF가 첨가된 배지와 AzF가 첨가되지 않은 배지에 각각 배양하여 arabinose로 induction 시킬 경우, 돌연변이tRNA synthetase의 amber suppression이 일어난다면 AzF가첨가된 배지에서만 형광 단백질이 발현이 되어야한다. 즉, AzF의 첨가 유무에 따른 형광 단백질의 발현 차이가 amber suppression의 정도를 나타나게 된다. 먼저, 각 재조합 대장균에 따른 형광 단백질의 발현을 확인하기 위하여 형광 현미경을 이용하여 배양된 재조합 대장균을 관찰하였다 (Fig. 2). E. coli W, DH5α, EPI300, W3110에서 형광 단백질이 높게 발현된 것이 관찰되었다. 하지만, E. coli DH5α와 W3110의 경우AzF를 첨가하지 않을 경우에도 높은 형광 단백질이 관찰되었다.

Figure 2. Microscopic observation of recombinant E. coli strains with pSEVA631pt-sfGFP204amb and pEVOL-pAzF. Recombinant strains were cultivated for 18 hrs at 37°C in LB media with chloramphenicol, ampicillin, and arabinose. Recombinant strains were cultivated with AzF (left pictures) or without AzF(right pictures), respectively.

Figure 3. Fluorescence intensity of recombinant E. coli strains with pSEVA631pt-sfGFP204amb and pEVOL-pAzF. Recombinant strains were cultivated for 18 hrs at 37°C in LB media with chloramphenicol, ampicillin, and arabinose with or without AzF, respectively.

정량적으로 발현량을 비교하기 위하여 마이크로 플레이트분석기를 이용하여 emission 파장에서의 흡광값을 측정하여 비교하였다 (Fig. 3). E. coli W, EPI300, DH10B 등에서 높은amber suppression이 나타났으며, E. coli B, DH5α, W3110에서는 amber suppression 낮은 것으로 나타났다. E. coli EPI300에서는 배지내에 AzF의 첨가 유무에 따라 8배 이상의 형광값의 차이를 보였다. E. coli DH10B에서는 7배 이상의 형광값의 차이를 보였다. E. coli B, W3110, DH5α에서는 배지내에 AzF의 첨가 유무에 따라 각각 3배, 3배, 1.5배의 차이를 보였다. 하지만, E. coli BL21(DE3), TOP10, XL1-Blue, XL10-Gold에서는 형광 단백질의 발현이 제대로 이루어지지 않았다. E. coli BL21(DE3)의 경우 4.7배의 형광 값의 차이를 보였지만, 절대적인 형광 값이 높지 않기 때문에 발현이 제대로 이루어지지 않은 것으로 판단하였다.

이러한 결과들로부터 단위 세포당 형광 단백질의 발현량(specific fluorescence intensity)을 계산하여 Fig. 4에 나타내었다. 본 연구에서 사용된 10 개의 대장균 종들 가운데서 E. coli W, DH10B, EPI300 등에서 높은 형광 단백질의 발현과amber suppression이 나타났다. E. coli DH5α에서도 높은 단위 세포당의 형광 단백질의 발현이 확인되어졌지만, 낮은amber suppression으로 발현을 위한 숙주 대장균으로는 적절하지 못한 것으로 예상된다. E. coli B와 W3110에서는 E. coli DH10B 정도의 단위 세포당 형광 단백질의 발현이 확인되어졌지만, DH10B 보다 낮은 amber suppression이 이루어졌다. 하지만, E. coli BL21(DE3), TOP10, XL1-Blue, XL10-Gold의 경우 형광 단백질의 발현량이 낮기 때문에 대장균 숙주로는 적절하지 못한 것으로 판단된다.

Figure 4. Specific fluorescence intensity of recombinant E. coli strains with pSEVA631pt-sfGFP204amb and pEVOL-pAzF. Recombinant strains were cultivated for 18 hrs at 37°C in LB media with chloramphenicol, ampicillin, and arabinose with or without AzF, respectively.

본 실험에서는 amber codon으로의 비천연 아미노산 도입에 대한 균주별 효율을 알아보기 위해 reporter gene 으로 쓰이는 형광 단백질을 이용하여 genetic code expansion을 진행하였다. AzF 유무에 따라 형광 발현 정도를 측정하는 과정에, 실험에 사용된 10가지 대장균 균주 중에서 E. coli EPI300의 경우 8배까지 차이가 발생하였으며, 발현이 매우 낮은 대장균 숙주도 확인되었다. 형광 단백질의 발현량과 amber suppression 들을 비교한 결과 본 연구에서 사용된 대장균 균주들 중에서 E. coli W, DH10B, EPI300 들이 비천연 아미노산이 결합된 재조합 형광 단백질의 발현에 효율적인 숙주로 판단되었다. 본 연구 결과는 향 후 새로운 비천연 아미노산을 결합시킬 수 있는 aminoacyl-tRNA synthetase의 개발과 개량에 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 비천연 아미노산이 결합된 재조합 의료용 단백질의 생산 숙주를 선정하는데도 활용될 수 있을 것이다 [16].

이 논문은 2018년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원(NRF-2018R1D1A1B07049359)과 과학기술일자리진흥원 고객수요대응연구 (’20)와 지역산업연계 대학OPEN-LAB 육성지원 사업에서 지원을 받아 수행된 연구입니다.