최근 웰빙 문화에 대한 관심과 기대수명이 증가함에 따라 건강한 노후 생활에 대한 중요도가 급상승하고 있으며, 화장품과 같은 생활용품에 다량으로 포함되어 있는 화학성분에 대한 안전성 논란이 대두되고 있다. 이에 따라 천연물에 대한가치 인식이 증가되고 있으며, 천연화장품 및 의약품, 건강기능 식품, 생물 유래 신소재 개발 등 다양한 분야의 연구도 활발하게 이루어지고 있다. 식물자원에는 다양한 폴리페놀 화합물이 존재하는데 페놀기를 가지고 있어, 체내에서 산화의 주범인 ROS (reactive oxygen species)를 제거하고 라디칼(radical)환원 성질을 이용하여 항산화제 역할을 한다 [1]. 국내 대표적인 식물 자원의 일종인 난대성 수종은 농가 및 임산업의 신규한 소재화 수익 작물로써 주목을 받고 있다. 난대성 수종은 사철 웅장한 경관을 이루어 관광자원으로써 주목받고 있으며 환경오염에 대한 내성이 강하고 생물유전자원 보전, 경제림 조성과 함께 약리작용 등의 특수기능이 밝혀지며 새로운 가치와 중요성이 인식되고 있다 [2]. 난대성수종 중에 하나인 구실잣밤나무 (Castanopsis cuspidata var. sieboldii)는 탄소저장 및 흡수량이 우수해 한반도 전 지역에 널리 분포되어 있으며, 주로 전라남도 남해안 (완도 수목원, 나주산림자원연구소)지역에 서식하고 있다. 참나무과 (Fagaceae), 메밀잣밤 나무속 (Castanopsis)에 속하는 상록활엽교목으로서, 한반도 이외에 일본, 중국, 대만 등에 분포되어 있다. 구실잣밤 나무는 높이가 15 m, 지름이 1m에 이르며, 나무껍질은 검은 회색이고 잎은 피침형, 도피침형 또는 장타원형으로 끝은 물결 모양의 톱니가 있는 것이 특징이다 [3]. 구실잣밤나무 추출물에서 galloyl shikimic acids, hydrolyzable tannins, terpenoids, castanopsinins, ellagitannins, dehydrodiallic acid, cretanin, chesnatin, chestanin, galloyl ester triterpenoid, hexahy-dorxydiphenic acid conjugated triterpenoid를 함유하는 것으로 보고되었으며, 항산화, 항균 효과 등 다양한 생리활성이 보고되었다 [4]. 그러나 현재 구실잣밤나무 잎 (leaves)의 폴리페놀 화합물의 종류를 분리, 분석, 분취하여 단일 물질에 대한 보고는 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 구실잣밤나무 잎 추출물과 용매 분획물의 항산화 활성을 탐색하고, 유효 성분의 분리 및 구조 동정을 통해 안전한 건강기능식품 및 기능성 화장품 관련 천연 소재로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.

2.1. 구실잣밤나무 잎 추출물 및 용매 분획물 제조

본 연구에 사용된 구실잣밤나무 (Castanopsis cuspidata var. sieboldii) 잎은 2020년도 4월경에 채취되었으며, 전라남도완도수목원 (Wando-gun, Jeollanam-do, Korea)으로 부터 공급받아 세척 후 열풍 건조하여 보관한 후에 분쇄하여 사용하였다. 구실잣밤나무 잎의 용매분획별 항산화 활성을 확인하기 위해 건조 및 분쇄된 구실잣밤나무 잎 1.5 kg을 70%EtOH (v/v) 15.0 L에 넣고 상온에서 2주간 침지 하여 추출하였다. 침지 시킨 시료는 감압 여과 장치와 Whatman No. 1을이용해 여과한 후, 이와 같은 방법으로 분리한 잔사에 대하여 동일한 조건으로 1회 반복 실시하였다. 여과하여 얻은 여액은 37~40°C에서 회전 감압 농축기 (rotary vacuum evaporator)로 농축 후 동결건조 하여 사용하였다. 70% EtOH 추출물269.03 g을 증류수에 현탁 시키고 분별 깔때기를 이용해 극성 순서에 따라 순차적으로 분획하여 n-hexane, chloroform, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH), water fraction을 각각 13.03 g, 5.27 g, 51.22 g, 44.74 g, 15.93 g 얻었다. 각 분획은 위와 같은 방법으로 농축 후 동결건조 하여 사용하였으며, 추출 수율은 아래의 식에 의해 계산하였다.

Yield (%) = (동결 건조 후 시료의 무게(g) / 추출 전 시료의 무게(g)) × 100

2.3. DPPH free radical 소거능 측정

DPPH free radical 소거능 측정은 Blois의 방법을 변형하여 실시하였다 [5]. 각 농도 별 시료를 EP tube에 200 μL 넣고0.5 mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 시약 800 μL를 혼합하여 voltexing하고, 암실에서 15분간 반응시켰다. 흡광도는 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader (BIO-TEX, Winooski,

VT, USA)를 사용하여 517 nm 파장에서 측정하였다. 각 시료는 3회 반복 실험을 실시하여 평균값을 구하였으며 gallic acid는 양성 대조군으로 사용하여 비교 실험하였다. 각 용액의 radical 소거능은 다음 식에 의해 계산하여 백분율로 나타내었으며 각 시료의 radical 소거능 백분율이 50%일 때의 시료 농도 (IC₅₀)를 구하였다.

Radical scavenging activity (%) = (Abs_control – Abs_sample) / Abs_control × 100

Abs_control : 517 nm에서 DPPH 시약의 흡광도

Abs_sample : 517 nm에서 시료와 DPPH 반응액의 흡광도

2.4. ABTS cation radical 소거능 측정

ABTS cation radical 소거능은 Re 등의 방법을 변형하여 측정하였다 [6]. 14 mM ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 시약을 7 mM 농도로 제조한 후, 2.45 mM potassium persulfate와 1 : 1 비율로 혼합한 후에 암실에서 18 시간동안 반응시켜 ABTS 양이온 radical을 형성하여 준비하였다. 이 용액은 730 nm에서 흡광값이 0.90±0.02가 될 수 있도록 증류수로 희석하여 사용하였다. 각 농도 별 시료를 EP tube에 200 μL 넣고 10배 희석한 ABTS 용액 1,000 μL를 혼합하여 voltexing 하고, 암실에서 15분 동안반응시켰다. 흡광도는 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader (BIO-TEX, Winooski, VT, USA) 를 사용하여 730 nm 파장에서 측정하였다. 각 시료는 3회 반복 실험을 실시하여 평균값을 구하였으며 quercetin은 양성 대조군으로 사용하여 비교 실험하였다. 각 용액의 radical 소거능은 다음식에 의해 계산하여 백분율로 나타내었으며 각 시료의 radical 소거능 백분율이 50%일 때의 시료 농도 (IC₅₀)를 구하였다.

Radical scavenging activity (%) =(Abs_control – Abs_sample) / Abs_control × 100

Abs_control : 730 nm에서 ABTS 시약의 흡광도

Abs_sample : 730 nm에서 시료와 ABTS 반응액의 흡광도

2.5. 총 폴리페놀 함량 분석 (Total polyphenol contents (TPC))

총 폴리페놀 함량 분석은 Folin-Ciocalteu 방법을 활용하여 측정하였다 [7]. 정량을 위한 표준 검정 곡선 (standard calibration curve)은 gallic acid를 표준물질로 사용하였으며 표준 검정곡선의 R² 값은 0.99 이상이었다. 1 mg/mL 농도의 시료와 농도별로 희석한 gallic acid 표준 용액을 500 μL씩 취한 후 0.2 M Folin-Ciocalteu’s phenol 시약 500 μL, 2% sodium carbonate 수용액(w/v) 500 μL를 추가로 혼합하여 암실에서30분 동안 반응시켰다. 흡광도는 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader (BIO-TEX, Winooski, VT, USA)

를 사용하여 750 nm 파장에서 측정하였다. 측정값은 표준 검정 곡선에 대입하여 시료 1g 당 함유하고 있는 gallic acid의양 (GAE)으로 환산하여 총 폴리페놀 함량을 구하였다.

2.6. 총 플라보노이드 함량 분석 (Total flavonoid contents (TFC))

총 플라보노이드 함량 분석은 Park등의 방법을 변형하여 측정하였다 [8]. 정량을 위한 표준 검정 곡선 (standard calibration curve)은 quercetin를 표준물질로 사용하였으며 표준 검정 곡선의 R² 값은 0.99 이상이었다. 1 mg/mL 농도의 시료와 농도별로 희석한 quercetin 표준 용액을 500 μL씩 취한 후 methanol 1.5 mL, 10% aluminium chloride 100 μL, 1 M potassium acetate

100 μL, 증류수 2.8 mL를 차례대로 첨가하여 상온에서 40분동안 반응시켰다. 흡광도는 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader (BIO-TEX, Winooski, VT, USA) 를 사용하여 415 nm 파장에서 측정하였다. 측정값은 표준 검정 곡선에 대입하여 시료 1 g 당 함유하고 있는 quercetin의 양 (QUE)으로 환산하여 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

2. 7. HPLC를 이용한 폴리페놀 함량 분석

유효성분 분석을 위하여 HPLC (SPD-20A, SHIMADZU CO., Japan)를 이용하여 분석을 진행하였다. 18가지 폴리페놀 표준물질 ((1) nicotinic acid; (2) gallic acid; (3) catechin hydrate; (4) caffeic acid; (5) epigallocatechin gallate; (6) epicatechin; (7) ethyl gallate; (8) p-coumaric acid; (9) chlorogenic acid; (10) 4-hydroxycinnamic acid; (11) ferulic acid; (12) naringin; (13) protocatechuic acid ethyl ester; (14) rutin; (15) benzoic acid; (16) quercetin; (17) kaempferol; (18) biochanin A)을 선정하여 실험을 진행하였으며, HPLC 분석조건은 다음과 같다. Column은 Shimpack GIS-ODS (C18, 4.6 × 250 mm, 5.0 μm, Shimadzu Co., Japan), flow rate는 0.7 mL/min, temperature 30°C, injection volume 10 μL, UV detector의 wavelength는 280 nm로 분석하였다. Mobile phase로는 0.1%acetic acid in water (solvent A)와 0.1% acetic acid in methanol (solvent B)를 사용하였다. 이동상의 gradient 조건은 이동상(B)를 기준으로 0 min: B (10%), 0~5 min: B (10%), 5~15 min: B (40%), 15~45 min: B (60%), 45~55 min: B (80%), 55~60 min: B (100%), 60~65 min: B (10%), 65~70 min: B (10%), 70~75 min: B (10%)로 하였으며 샘플의 주입량은 10 μL였다.분석에 사용한 모든 시료는 0.45 µm filter로 여과하여 사용하였다.

2.8. 통계처리

본 실험에서 얻어진 모든 결과값은 3 회 이상의 반복 실험을 통하여 실험 결과값의 평균±표준오차로 나타내었다. 이에 대한 통계적 분석은 SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 사용하여 Duncan 방법으로 one-way ANOVA 분석을 통하여 통계분석을 실시하였으며, p<0.05 이내가 되는 값을 선별하여 유의성이 있다고 판단하였다.

3.1. 구실잣밤나무 잎 추출물 및 분획물의 수율

본 실험에서 구실잣밤나무 잎 70% EtOH 추출물 269.03 g을 증류수에 현탁 시킨 후에 극성 순서에 따라 분리한 n-hexane, chloroform, EtOAc, BuOH, water fraction의 수율은 각각 4.84%, 1.96%, 19.04%, 16.63%, 5.92% 로 나타났으며 EtOAc 분획에서 수율이 가장 높은 것으로 확인되었다 (Table 1). 본 실험결과를 통해 구실잣밤나무 잎 추출물의 용매 분획물은 주로극성 용매 분획물에 다량의 페놀화합물들이 분포되어 있음을 확인하였다.

Table 1 Yield of extract and solvent fractions from C. cuspidata var. sieboldii leaves (CSL)

Sample	Fraction	Weight (g)	Yield (%)
C. cuspidata var. sieboldii leaves (CSL) (64.64 %)	n-Hexane	13.03	4.89
	Chloroform	5.27	1.95
	EtOAc	51.22	16.26
	BuOH	44.74	17.30
	Water	15.93	24.24

3.2. DPPH free radical 소거능 측정 결과

DPPH free radical 은 비교적 안정한 free radical로 세포의 노화와 각종 질병 등을 일으키므로 천연물의 항산화 활성을 평가하는 데에 널리 사용되고 있다 [9]. 본 실험에서 구실잣밤나무 잎 70% EtOH 추출물 (CSL) 및 각 용매 별 분획물에 대하여 DPPH free radical 소거능을 측정하였다. 표준물질을 제외한 시료의 농도는 25-1000 μg/mL의 농도로 진행하였으며 각각에 대한 IC₅₀ 값을 계산하였다 (Fig. 2, Table 2). 본 실험결과는 구실잣밤나무 잎 추출물 및 분획물의 DPPH free radical 소거능이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며 각 분획별 항산화 활성은 EtOAc, chloroform, BuOH, water, n-hexane 순으로 나타났다. EtOAc 분획물의 IC₅₀ 값은87.58 μg/mL 로 가장 우수한 DPPH radical 소거활성을 나타내었다. 이는 Kim 등의 연구에서 보고한 구실잣밤나무 잎80% 에탄올 추출물을 n-hexane, dichloromethane, EtOAc, BuOH, water 로 분획한 실험에서 ethyl acetate 분획물이 가장높은 항산화 활성을 보인 실험 결과와 동일하였다 [10]. 또한구실잣밤나무와 동일한 참나무과인 붉가시나무 잎 추출물및 용매 분획물의 DPPH free radical 소거능 결과와 비교하였을 때, 붉가시나무 잎 ethyl acetate 분획물의 IC₅₀값은 438.37 μg/mL을 보였으며, 본 실험결과는 구실잣밤나무 잎의 DPPH free radical 소거능이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다 [11].

Table 2 IC₅₀ values of DPPH and ABTS radical scavenging activity, total polyphenol contents and total flavonoid contents of extract and solvent fractions from C. cuspidata var. sieboldii leaves (CSL)

Sample	DPPH IC50 (μg/mL)	ABTS IC50 (μg/mL)	TPC (GAE mg/g)	TFC (QUE mg/g)
CSL	138.21 ± 10.66	169.83 ± 0.30	84.28 ± 1.87	19.34 ± 2.19
n-Hexane	> 200	>200	38.59 ± 1.25	7.33 ± 0.36
Chloroform	93.92 ± 1.96	79.33 ± 1.19	138.21 ± 4.25	25.40 ± 0.63
EtOAc	87.58 ± 4.61	71.45 ± 1.42	144.48 ± 5.82	37.79 ± 2.39
BuOH	169.18 ± 1.36	136.71 ± 1.69	111.37 ± 0.74	14.47 ± 0.36
Water	> 200	> 200	20.17 ± 0.33	6.07 ± 0.36
Gallic acid	22.73 ± 2.04	-	-	-
Quercetin	-	22.73 ± 2.04	-	-

3.3. ABTS cation radical 소거능 측정 결과

ABTS의 화학반응은 radical 양이온이 항산화 물질로부터 전자를 얻게 되면 청록색에서 투명한 색으로 색 변이가 발생된다 [12]. 본 실험에서 구실잣밤나무 잎 70% EtOH 추출물(CSL) 및 각 용매 별 분획물에 대하여 ABTS cation radical 소거능을 측정하였다. 표준물질을 제외한 시료의 농도는 25-1,000 μg/mL의 농도로 진행하였으며 각각에 대한 IC₅₀값을 계산하였다 (Fig. 3, Table 2). 본 실험 결과는 구실잣밤나무잎 추출물 및 분획물의 ABTS cation radical 소거능이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며 각 분획별 항산화 활성은 EtOAc, chloroform, BuOH, water, n-hexane 순으로 나타났다. EtOAc 분획물의 IC₅₀ 값은 71.45 μg/mL 로 가장 우수한 ABTS cation radical 소거능을 나타내었다. 본실험결과는 ABTS cation radical이 물과 유기용매에 용해되어 친수성 물질과 친유성 화합물의 항산화 능력을 측정할 수있는 특징에 따라 DPPH radical에 비해 비교적 더 높은 IC₅₀값을 나타낸 것으로 사료된다 [2]. 또한 이는 Park 등의 연구에서 보고한 구실잣밤나무와 동일한 4종의 참나무과 추출물의 ABTS cation radical 소거능 결과와 비교하였을 때 가장 활성이 좋은 Q. serrata의 IC₅₀ 값 (85.88 μg/mL) 보다 구실잣밤나무 잎의 ABTS cation radical 소거능이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다 [13].

3.4. 총 폴리페놀 함량 분석 (Total polyphenol contents (TPC))

전통적으로 많은 식물이 인간의 건강 관리를 위한 한약 제제로 사용되며, 이러한 의학적 용도는 식물계에서 가장 널리 알려져 있는 항산화, 항염, 항균 및 항암 특성을 갖는 것으로 입증된 주요 성분인 폴리페놀 화합물에 기인된다 [14]. 폴리페놀은 식물의 2차 대사 산물로서 소량 생산되는데, 폴리페놀 화합물의 구조는 분자 내에 전자가 풍부하여 탈 수소화가 일어나도 안정한 분자 구조를 가지며 환원 특성을 유발하여항산화제 역할을 하여 건강상의 이점을 제공한다 [15]. 본 실험에서 gallic acid를 표준물질로 사용하여 표준 검정 곡선을작 성하고 구실잣밤나무 잎 70% EtOH 추출물 (CSL) 및 각용매 별 분획물에 함유된 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 함량은 중량 1 g 당 함유하고 있는 gallic acid의 양 (gallic acid equivalent (GAE))로 환산하여 나타내었다 (Table 2). 본 실험결과는 EtOAc 분획물에서 144.48 ± 5.82 GAE mg/g으로 가장 높은 폴리페놀 함량을 보였다. Lee 등의 연구에서 tannic acid를 표준물질로 사용한 추출방법별 구실잣밤나무 열매의 TPC 결과는 water 추출물에서 최대 27.69 mg 를 나타냈다는 보고가 있다 [16]. 이는 본 연구 결과와 비교하였을 때 구실잣밤나무 잎이 열매보다 더 많은 폴리페놀 함량을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

3.5. 총 플라보노이드 함량 분석 (Total flavonoid contents (TFC))

본 실험에서 quercetin을 표준물질로 사용하여 표준 검정 곡선을 작성하고 구실잣밤나무 잎 70% EtOH 추출물 (CSL) 및각 용매 별 분획물에 함유된 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 함량은 중량 1g 당 함유하고 있는 quercetin의 양 (quercetin equivalent (QUE))로 환산하여 나타내었다 (Table 2). 본 실험결과는 EtOAc 분획물에서 37.79 ± 2.39 QUE mg/g 으로 가장 높은 플라보노이드 함량을 보였다. 이는 총 폴리페놀 함량 분석 결과와 비교하였을 때 구실잣밤나무 잎에 flavonoid 구조를 가진 화합물보다 phenolic acid 와 같은 구조를 가지는 화합물이 다량 함유되어 있는 것으로 추측된다.

3.6. HPLC를 이용한 폴리페놀 함량 분석

구실잣밤나무 잎 70% EtOH 추출물 중 항산화 활성이 가장 뛰어난 EtOAc 분획 (CSL-EA)의 폴리페놀 함량 분석 위해 HPLC 분석방법을 개발하여 18가지 폴리페놀 표준물질을 이용한 HPLC 정성 분석을 실시하였다. CSL-EA의 HPLC 분석 결과는18개의 폴리페놀 표준물질들 중 protocatechuic acid ethyl ester를 제외한 총 17개의 표준물질을 포함하고 있음을 확인하였다(Fig. 4). 18개의 폴리페놀 표준물질들 중 epigallocatechin gallate (275.63 ± 0.17 mg/g), caffeic acid (61.24 ± 0.31 mg/g), ethyl gallate (60.98 ± 0.46 mg/g), p-coumaric acid (57.86 ± 0.14 mg/g)의 함량은 높은 값을 나타내며, CSL-EA에 위 4가지폴리페놀이 다량으로 함유되어 있음을 확인하였다 (Table 3). 이외에 CSL-EA의 retention time 20min 부근에서 unknown peak 가 검출되었는데, 이는 폴리페놀 표준물질에 포함되지 않은 식물의 terpenoid 계열 화합물로 판단된다. 또한 용매 분획 후에 유기용매 별로 화합물들이 분리가 되며 CSL-EA에서ethyl gallate의 함량이 증가된 것으로 추정되며, flavonoid 계열의 화합물 보다 phenolic acid 계열의 화합물이 더 많이 검출된 것을 확인하였다. 이는 본 실험의 총 폴리페놀 함량 분석 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과와 일치하였다.

Table 3 Phenolic compounds identified in CSL-EA quantified by UV-HPLC using diode array detection at 280 nm (Unit : mg/g)

No.	Standard	CSL-EA
1	Nicotinic acid	1.00 ± 0.44
2	Gallic acid	9.20 ± 0.15
3	Catechin	41.14 ± 0.20
4	Caffeic acid	61.24 ± 0.31
5	Epigallocatechin gallate	275.63 ± 0.17
6	Epicatechin	12.55 ± 0.17
7	Ethyl gallate	60.98 ± 0.46
8	p-Coumaric acid	57.86 ± 0.14
9	Chlorogenic acid	2.83 ± 0.51
10	4-Hydroxycinnamic acid	0.63 ± 0.07
11	Ferulic acid	14.57 ± 0.74
12	Naringin	4.90 ± 0.16
13	Protocatechuic acid ethyl ester	-
14	Rutin	17.69 ± 0.04
15	Benzoic acid	2.86 ± 0.58
16	Quercetin	18.94 ± 0.82
17	Kaempferol	2.72 ± 0.55
18	Biochanin A	0.12 ± 0.07
Total		584.84 ± 0.17

본 연구는 70% ethanol을 사용한 구실잣밤나무 잎 추출물에 대해 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, water를 이용하여 유기용매 별 분획을 실시하여 시료로 사용하였다. 구실잣밤나무 잎 추출물 및 분획물의 항산화 활성 및 유효성분함량을 확인하여 비교 분석하였으며 항산화 활성을 중심으로 화합물의 화학 구조 식별 연구를 진행하였다. 추출물 및모든 용매 분획물에 대한 DPPH free radical 소거능 및 ABTS cation radical 소거능 측정 결과 EtOAc 분획물에서 가장 높은 radical 소거능을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 분석결과 또한 동일하게 EtOAc 분획물에서 각각 144.48 ± 5.82 GAE mg/g, 37.79 ± 2.39 QUE mg/g 으로 가장 높은 함량을 보였다. 위 실험을 통해 구실잣밤나무잎에 flavonoid 구조를 가진 화합물 보다 phenolic acid 구조를 가진 화합물이 더 많이 포함된 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 구실잣밤 나뭇잎은 다양한 폴리페놀 화합물들로 구성되어 있으며, 다른 식물에 비해 항산화 활성이 매우 뛰어나 화장품 원료 소재로써 매우 유용할 것으로 생각되며, 추후 화장품 소재 활용을 위해 미백, 주름개선 등의 지속적인 추가 연구가 필요하다.

본 연구는 산림청 (한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업 (2020194B10-2022-BA01)의 지원에 의하여 수행되었습니다.