Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal

pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2022; 37(2): 71-81

Published online June 30, 2022 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2022.37.2.71

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

암모니아 산화 고균 선택적 항체탐침자 개발

Development of an Antibody Probe for Specific Detection of Ammonia-Oxidizing Archaea

Yeon-Jin Chu, Dae-Eun Cheong, and Geun-Joong Kim*

Department of Biological Sciences, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea

Correspondence to:Tel: +82-62-530-3403, Fax: +82-62-530-3409
E-mail: gjkim@chonnam.ac.kr

Received: May 6, 2022; Revised: May 28, 2022; Accepted: May 31, 2022

Ammonia oxidation is the first step of nitrification and plays an important role in global nitrogen cycle. Over the past 20 years, it has been founded that archaeal amoA gene is more abundant than bacterial amoA gene in diverse habitats. However, most of ammonia-oxidizing archaea (AOA) discovered by molecular techniques so far have not been cultivated yet in pure state. Thus, alternative methods of probing AOA are urgently needed. In this study, we attempted to produce antibody probes that specifically bound to a marine AOA strain, by generating polyclonal antibody using a subunit of specific ammonia monooxygenase (AMO) for ammonia oxidation. The resulting antibody could be used for detection of the AOA strain as illustrated by immunofluorescence staining in this work. Our results thus indicate that the typically generated polyclonal antibody would have broad in-vitro and in-situ applications in environmental microbiology and biotechnology.

Keywords: ammonia-oxidizing archaea, ammonia monooxygenase, polyclonal antibody, immunofluorescence

Ammonia monooxygenase (AMO)에 의한 암모니아 산화는 미생물에 의한 질화작용 (nitrification)의 가장 중요한 단계이다. 따라서 AMO 소단위체를 암호화한 amoA 유전자를 기반으로 관련된 미생물에 대한 탐색이 이루어져 왔고, 세균인 β-와 γ-proteobacteria 군의 미생물이 암모니아 산화의 주체인 것으로 보고되어 왔다 [1,2]. 이와는 달리 메타지놈 기반의16s rRNA 유전자 탐색결과는 많은 고균 유래의 amoA 유전자의 존재를 보고하였으며 [3,4], 이어진 활성연구 결과를 통해 다양한 환경에서 고균 유래의 amoA 유전자가 세균의 그것보다 훨씬 풍부하게 존재하는 것이 규명되었다 [5-11]. 따라서 자연계의 질소 생물지화학적 순환 (nitrogen biogeochemical cycle)에 있어 고균에 의한 질화작용이 매우 중요한 것으로 보고되고 있다 [9,12].

최초로 순수 배양된 암모니아 산화 고균 (ammonia-oxidizing archaea, AOA)인 Nitrosopumilus maritimus SCM1은 암모니아를 단일 에너지원으로 제공하여 해수 수족관에서 분리되었다 [13]. 이 후, 분자생태학적 기법을 통하여 다양한 환경에 서식하는 AOA의 존재가 꾸준히 보고되어 왔고, 관련된 AOA의 생태생리활성은 물론 전체 유전정보를 활용한 심도있는 연구가 진행되고 있다 [14-24]. 그러나 보고된 대부분의 AOA는 배양자체가 쉽지 않아, 농화배양 (enrichment culture)이 되더라도 순수배양체를 얻는 것은 매우 어려운 과정으로 알려져 있다 [22,25]. 따라서 많은 경우에 세균과 동시배양(co-culture)된 농화배양체를 이용하여 생리생태학적 특성을 분석하고 있다. 이러한 이유로 인해, AOA에 대한 연구 결과는 농화배양액이나 환경 시료로부터 고균 특이유전자 기반의 핵산 탐침자 (probe)를 이용한 PCR 의존적 DNA 분석이나 fluorescence in-situ hybridization (FISH) 등의 방법을 통해얻어지고 있다. 최근에는 고균 유래의 단백질을 항원으로 이용해 제작된 항체를 특정 생리연구에 이용하는 사례들이 증가하고 있어, 핵산 기반의 연구기법에서 면역학적 방법을 탐침이나 생리분석 과정에 이용하는 사례들이 증가하고 있다[26]. 상대적으로 세균보다 진핵세포에 더 가까운 고균의 전사와 번역기작으로 인해 전형적인 재조합 숙주인 대장균을 이용한 고균 유래 단백질의 생산은 용이하지 않지만, 유용한 발현시스템의 구축이 병행되어 진다면 항체 기반의 고균 연구결과는 더 의미있는 성과물을 도출할 수 있을 것이다. 또한 서열 상동성에 근거하여 유전자 존재자체만을 확인하는 핵산탐침법과의 상호보완적인 결과물 (발현된 단백질 확인)을얻을 수 있을 것으로 기대되어 진다.

질소순환 외에도 다양한 생리활성을 통해 생태계에서의 중요성이 크게 부각되고 있는 AOA는 배양 방법의 한계와제한적인 탐침법, 대사생리 연구에 필요한 유전자 조작 방법의 부재 등으로 인해 실험적 접근에 어려움이 많은 상황이다. 본 연구에서는 다양한 환경에 존재하는 AOA를 탐침할 수있는 antibody probe의 제작을 시도하였다. 실험실에서 분리된 AOA균주인 AR [25]를 이용하여 질화과정의 핵심 단백질인 AMO에 특이적인 polyclonal antibody를 제작한 후, 농화배양된 시료와 환경시료를 기반으로 탐침에 필요한 반응특성을 살펴보았다. 결과적으로 기존의 핵산 탐침자와 병행하거나 보완할 수 있는 새로운 암모니아 산화 고균 탐침자로서의 이용이 기대되어지는 결과를 얻을 수 있었다.

2.1. 사용균주 및 플라스미드

본 연구의 대상이 되는 암모니아 산화 고균은 북극해에서 분리한 AR을 이용하였다 [25]. 재조합 유전자 조작과정에서는E. coli XL1-Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)])를 클로닝 숙주로 사용하였고, E. coli C43(DE3) (F–ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3))와 BL21(DE3) (F–ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5- T7 gene1 ind1 sam7 nin5]))을 발현숙주로 이용하였다. AMO 유전자 서열분석을 위한 클로닝은 pBR328 (Addgene) 벡터를 이용하였고, 발현벡터로는 pMAL-c2x (New England Biolabs)와 pET20b+ (Novagen), 그리고 pET21d+ (Novagen)를 사용하였다. 제작된 항체의 선택적 결합을 확인하는 과정에서, Propionibacterium acnes KCTC5008과 Veillonella pavula KCTC501을 해당 기관 (KCTC)에서 분양받아 대조군으로 이용하였다.

2.2. 배지, 배양조건 및 단백질체 분석

암모니아 산화 고균 AR의 배양은 원균주를 분리한 선행연구에 따라 artificial sea water (ASW) 배지를 기반으로 진행하였고 [25], 일부 배지성분은 참고문헌과 비교해 보정하였다[27]. 준비된 배지에 동일한 배지로 전배양한 세포를 5% 접종한 후, 25°C에서 암조건으로 14 day 정치배양하였다. 재조합 유전자 클로닝과 발현에 사용한 E. coli 균주는 전형적인LB 액체배지 (bacto-tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g)에 50 μg/ml ampicillin을 첨가하여 37°C에서 배양하였으며, 단백질 정제과정에서는 28°C에서 같은 조건으로 배양한 세포를 이용하였다. Competent cell의 제조에는 bacto-tryptone 20 g, yeast extract 5 g, NaCl 0.5 g, 2.5 mM KCl, 20 mM MgCl2의조성을 지닌 SOB 액체배지를 사용하였다.

단백질체 분석은 상기과정에서 배양된 고균 균체 (일부 미량의 세균이 포함된 농화배양액 1.5 L)를 모아, 전문기관(Proteinworks, Korea)에 의뢰해 진행하였다.

2.3. 재조합 플라스미드의 제작

항체제작을 위한 항원 단백질 발현과정에서는 AR whole genome에서 발굴해 Genbank (JX292015)에 등록한 AMO 암호화 유전자를 사용하였다. 3개의 소단위체 (subunit)인amoA, amoB 그리고 amoC, 각각의 유전자와 cluster 형태인 amoACB 유전자 모두를 증폭할 수 있는 primer (Table 1의 F1과R1 세트)를 제작 (Bionics, Korea)하여 중합반응 (PCR)을 수행하였다. PCR은 94°C에서 60 sec (denaturation), 63°C에서 60 sec (annealing), 72°C에서 90 sec (extension)로 총 30 cycles을 수행하였다. amoACB 유전자 전체의 증폭 과정에는 annealing 조건만 65°C에서 2min 30 sec로 변경해 수행하였다. 증폭된 각각의 유전자를 PvuII로 절단된 pBR328 플라스미드에 클로닝 (blunt end ligation)하여 pBR328-AmoA, pBR328-AmoB, pBR328-Am°C, 그리고 pBR328-AmoACB를 제작하였다. 제작한 construct는 모두 sequencing을 수행하여 서열을 재확인하였다. 확보된 서열을 바탕으로 제한효소 서열이 삽입된primer의 특성을 이용하여 amoAamoBNcoINheI으로 절단된 pET21d+에, amoC는 NdeI과 NheI으로 절단된 pET20b+ 에 클로닝하여, pET-AmoA, pET-AmoB, pET-Am°C를 각각제작하였다. Maltose-binding protein (MBP)과의 융합을 위해새로운 primer (Table 1의 F2와 R2 세트)를 제작하여 PCR을수행한 후, BamHIHindIII로 절단한 pMAL-c2x에 클로닝하여 pMAL-AmoA, pMAL-AmoB, pMAL-Am°C를 제작하였다.

Table 1 Primers used for PCR amplification for gene cloning

Primer nameSequence (5’ -> 3’)Restriction enzyme
amoACB FTTAGTCCCACTTTGACCAAGCGGCC-
amoACB RTTAGATTACTTGCCAGGGTCGTGTTGC-
amoA F1GGCCGTAATATTCCCATGGTCTGNcoI
amoA R1ATGCTAGCTTAGACCCACTTTGACCAAGNheI
amoB F1GACAGTTCCCATGGTCGAAAAAAGNcoI
amoB R1AGACCGTAATGCTAGCTTAGATTACTTGNheI
amoC F1GATGTTACATATGTTATCCATGGCACNdeI
amoC R1GCACGCTAGCTAAGGAATTGCTCTGNheI
amoA F2TTTAAAAAGGCGTTAATGGATCCATGGTCTGBamHI
amoA R2ACCGTAAGCTTAGTCCCACTTTGAHindIII
amoB F2CAGTCAGGATCCATGGTCGAAAAAAGBamHI
amoB R2GGCCGTATTATAAGCTTAGATTACTTGHindIII
amoC F2AAGGATCCATGGCACAGATGCCCGCATTAATCBamHI
amoC R2ATAAGCTTCTAAGGAATTGCTCTGCTGTACAATTTGHindIII


2.4. 단백질 발현 및 정제

pET-AmoA, pET-AmoB, pET-Am°C는 E. coli BL21(DE3)를,이외의 재조합 유전자는 E. coli C43(DE3)를 발현숙주로 이용하였다. 형질전환된 단일 콜로니를 LB 액체배지 (3 ml, 50 μg/mL ampicillin)에 접종하여 37°C에서 8hr 전배양한 후, 같은 배지 (25 ml)에 1%로 접종하여 28°C에서 본배양하였다. OD600값이 0.5~0.6에 도달했을 때, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 90 min동안 단백질 발현을 유도하였다. 발현이 유도된 세포를 원심분리 (14,000 × g, 2 min)로 수확한 후, 초음파로 파쇄하여 상등액과 불용성 분획을 분리한 후, 10% SDS-PAGE gel을 이용해 가용성 발현여부를 확인하였다. 항체생성을 위한 단백질 정제는 MBP 융합형태로 발현되는 pMAL-Am°C 재조합벡터를 지닌 클론을 이용하였다. 상기 클론은 200 ml LB 액체배지가 담긴 삼각 플라스크 (1 L)를 사용하여 전술한 조건과 동일하게 발현을 유도하며 배양하였다. 배양 후, 원심분리 (5,000 x g, 10 min)로 세포를 수확한 후, 3차 증류수로 1회세척하였다. 회수된 세포는 액체질소에 급속 동결하여 80°C에 보관하며 정제과정에 이용하였다.

MBP 융합단백질 형태인 MBP-Am°C 정제를 위해, 80°C에 보관한 세포를 3회에 걸쳐 급속 냉동 (rapid freezing)과 해동 (slow thawing on ice)을 반복해 세포막을 약화시킨 후, 100 ml lysis buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 현탁하였다. 이후 필요에 따라 lysozyme (50 μg/ml)을처리 (30 min)한 후, 초음파분쇄기 (Vibra-cell TM, Sonic & Materials, USA)를 이용해 파쇄하였다. Cell lysate는 4°C에서60 min 동안 원심분리 (10,000 x g)하여 상층액을 회수한 후, 0.45 μm filter (Satorius Stedim BioTech, Germany)를 이용하여 여과하였다. 같은 조성의 buffer에 4배 희석하여 MBPTrap HP column (GE healthcare)에 1 ml/min 속도로 결합을 유도하였다. 이후 동일한 buffer를 사용하여 충분히 세척한 후, 10 mM maltose가 포함된 buffer로 용출을 유도하였다. 정제된 단백질은 factor Xa를 처리 (4°C, 10 hr)하여 융합파트너인 MPB를 절단한 후, column에 다시 loading하거나 gel 로부터 직접 회수 (electro-elution)하여 항원으로 이용하였다. 단백질은 Bradford assay를 통해 정량하였다.

2.5. 항체 제작 및 정제

Anti-AMO polyclonal 항체의 제작은 전남대 수의대 조 경오교수 연구실의 도움을 받아 토끼를 숙주로 이용해 제작하였다. 항체 생성이 확인된 토끼에서 회수한 혈액은 37°C에서1hr 동안 clotting을 유도한 후, 원심분리 (10,000 x g, 10 min)하여 혈청을 확보하였다. 혈청 5 ml을 binding buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.0)로 4배 희석하고 1 g cell debris remover (CDR)을 첨가한 후, 10 min 동안 상온에서 침전을 유도하였다. 2회의 원심분리 (10,000 x g, 10 min)로 CDR과 함께 침전된 불순물을 제거한 후, 0.45 μm filter로 여과하였다. 최종100 ml이 되도록 binding buffer 를 첨가하고 HiTrap rProtein A FF column (GE Healthcare)에 0.5 ml/min 유속으로 결합을 유도하였다. 2 M NaCl이 포함된 동일한 buffer로 충분히 세척한 후, pH 3.0과 6.0의 0.1 M citrate buffer를 이용하여 gradient elution을 수행하였다. 용출단계에서 1.5 ml micro tube 에 10 μl의 1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0)를 미리 첨가하여, 낮은 pH로 용출되는 항체를 신속하게 중화하였다.

2.6. Immunofluorescence staining과 현미경 관찰

항체를 이용한 immunofluorescence (IF) staining의 전반적인과정은 기 보고된 방법에 따라 수행하였다 [28,29]. 이를 위해 농화배양된 AR을 원심분리 (16,000 x g, 30 min)로 수확한후, PBS에 현탁 (suspension)하였다. 이를 0.1% poly-L-lysine으로 coating한 slide glass에 도말하였다. 이후 4% paraformaldehyde로 고정화 (10 min)한 후, PBS로 세척하였다. 준비된 시료는0.2% Triton X-100을 처리 (10 min)하여 투과화를 유도하였다. Blocking buffer (5% skim milk, PBS, 0.02% Tween 20)로 반응 (60 min)을 유도한 후, 일차 항체를 1:200으로 희석하여90 min 동안 처리하였다. PBST로 10분씩 2회 세척한 후, rhodamine-conjugated secondary antibody (Millipore)를 같은비율로 희석하여 반응을 유도 (60 min)하였다. 준비된 시료는 PBST로 2회 세척한 후, 100×/1.30 oil DIC (differential interference contrast)가 장착된 BX43 형광 현미경 (Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하였다. BX3-URA universal reflected illuminator를 이용하여 SYTO 9 형광 관찰은 U-FBW (460-495 nm) 필터를 이용하였고, rhodamine 형광 관찰은 U-FGW (530~550 nm) 필터를 이용하였다. DIC와 형광 이미지는DP71 디지털 카메라 (200~500 ms 노출)를 이용하여 촬영하였다. AR 배양액 내 전체 미생물의 형광염색은 SYTO 9으로공급자 (Thermo Fisher Scientific)의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 상기 모든 과정은 상온에서 3회이상 수행하여 결과를 확인하였다. 환경시료와 대조군을 이용한 IF와 현미경관찰도 같은 방법으로 진행하였다.

3.1. AR amo 유전자의 서열분석

암모니아 산화 고균인 AR 균주의 whole genome으로부터 발굴해 Genbank에 등록 (JX292015)한 amo 유전자 cluster는,클로닝과 서열분석을 통해 문제가 없음을 재확인하였다. 이과정에서, 박테리아 (세균)의 전형적인 amoamoCAB 배열형태로 존재하는데 반해, 고균의 amo유전자는 총 2,651 bp의유기적 구성 (소단위체 유전자 순서)이 세균과는 다른 amoACB형태로 존재함도 검증하였다 (Fig. 1A). 또한 AR amo cluster에서의 소단위체들의 발현은 두 개 이상의 프로모터에 의해 조절 (그림의 ORF 방향 참조)되는 것으로 예측되었다. amoA, amoB 그리고 amoC ORF는 각각 651, 570, 564개의 염기쌍으로 구성되며, 단백질 분자량은 24.3, 20.7, 21.1 kDa으로 예측되었다. 신호서열 (signal peptide) 예측 프로그램 (SignalP 3.0)으로 Hidden Marcov model기반으로 분석하였을 시, 세포막으로 인도하는 신호서열은 amoB에 존재하는 것으로 예측되었다. 미생물에 의한 암모니아 산화의 지표유전자로 사용되는 amoA의 아미노산 서열을 이용하여 계통수를 분석한 결과, 균주 AR과 99.1%의 16S rRNA 유전자 염기서열 유사도를 지닌 N. maritimus SCM1[13]과 가장 높은 상동성을 지닌 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1B).

Figure 1. Genetic organization and evolutionary relationship of the putative ORFs in AR amo gene cluster. (A) Genetic organization of the putative ORFs in amo gene cluster. Open arrows indicate the proposed direction and extension of the putative ORFs. Labeled numbers indicate the nucleotide sequences of each ORF. (B) Phylogenetic analysis of the AR amoA gene sequence (651 bp). AR amoA gene was amplified using primers amoA F1 and amoA R1. The amoA gene sequences from 8 species of archaea and 10 species of bacteria arbitrary selected from closely related sequences were used to build phylogenetic trees.

3.2. 탐침 지표 단백질인 AMO 가치평가

전술한바와 같이 암모니아 산화과정의 지표유전자로 amo를 일반적으로 이용하고 있다. 하지만 대부분의 연구가 발현된 단백질이 표적이 되는 항체를 이용하는 것이 아니라, 핵산탐침자를 이용한 FISH를 이용하는 방법이 주류를 이루고 있다. 따라서 염색체내의 유전자의 존재 여부와 단시간내에 많은 양이 생성되는 전사체가 대상이 되는 기존의 탐침결과가 단백질을 대상으로 하는 경우에도 유지되는지를 확인할 필요가 있다. 다시 말해, 암모니아가 존재하는 환경에서 일정수준 이상의 AMO 단백질이 발현되는지를 확인해야만, 항체를 이용해 탐침을 하는 경우에 필요한 신호 (이차항체에 의한 형광)를 발생시켜 탐침 대상을 확인할 수 있을 것이라 사료되었다.

상기한 의문점을 확인하기 위해 암모니아가 존재하는 환경에서 배양된 고균 균주 AR을 대상으로 단백질체 (proteome) 분석을 시도하였다. 세균이 포함된 농화배양이라 하더라도 AOA가 우점하는 배양체인 만큼 유의미한 분석이 가능할 것이라고 판단되었다. 분석은 전문기관에 의뢰하여 신뢰성을 확보하는 방법으로 진행하였다. 필요한 단백질 양을 반복적인 실험과정에서 확인한 후, 최종적으로 ~100 μg의 단백질을 이용하여 Fig. 2와 같은 결과를 도출하였다.

Figure 2. Two-dimensional gel electrophoresis and identification of the extracted crude proteins from AR culture. Soluble protein fractions were prepared from 1 L cultures of AOA AR grown under the described condition in Materials and Methods. About 100 μg of total protein was resolved on 2D PAGE. First dimension isoelectric focusing was performed with linear immobilized pH 3–10 gradient strip. For the second dimension, 12% SDS-polyacrylamide gels were used. The numbers indicate the excised protein spots that were analyzed by MALDI peptide mapping. The identification results of excised spots are summarized in lower columns.

결과적으로 해상도가 확보된 2D gel 단백질 spot를 분석하여 충분한 탐침이 가능할 것으로 예상되어지는 20개의 과 발현 spot을 분리하여, peptide mass fingerprinting으로 동정을 진행하였다. 다행스럽게도 2개의 spot을 제외한 모든 경우에서 동정이 가능한 결과를 얻었다. 또한 동정된 대부분의 단백질이 고균 유래로 확인되어, 동시 배양체를 이용한 고균단백질체의 2차원 분석이 가능함도 부수적으로 확인할 수있었다. 기대대로, 과발현된 spot 9와 14에서 암모니아 산화고균의 핵심유전자인 ammonia monooxygenase (AMO)와 copper-containing nitrite reductase를 확인함으로써, 이를 항원으로이용하여 항체를 제작할 경우 AMO의 탐침이 가능할 수 있는 결과를 얻었다. 에너지 공여체인 암모니아 농도에 따라 발현되는 단백질의 양이 증가한다면 기존의 핵산 탐침자를 이용한 FISH 탐침 결과보다 좀 더 강한 검출신호를 확인할 수 있을 것으로 기대되어졌다. 이러한 결과를 바탕으로 amo유전자를 이용한 클로닝을 진행하여 대장균 기반의 항체 생성용 재조합 단백질 (항원)의 생산을 시도하였다.

3.3. 대장균 기반의 AR AMO 발현 및 정제

탐침의 대상이 되는 AMO는 세개의 소단위체로 구성되어있으며, 하나의 단위체에 신호서열이 뚜렷하게 검출되는 것으로 보아 세포막에 연관되거나 관통할 가능성이 매우 높은 단백질이다. 따라서 세개의 소단위체 유전자를 같이 발현시킬 경우, 4차구조 형성이나 세포막으로의 이동에 의한 독성유발이 문제가 될 수 있다. 이러한 상황을 고려하여 소단위체 각각을 클로닝하는 방법을 시도하였다. 또한 전사와 번역기작이 세균과는 다른 고균의 특성에 의해 난발현의 특성을 보여줄 수도 있어, 가용성 발현에 도움이 되는 MBP와의 융합발현 (pMAL vector 기반)도 시도하였다. 발현숙주로는 전형적인 단백질 가수분해효소가 결손된 대장균 BL21과 막단백질과 같이 세포독성을 유발하는 난발현 단백질의 발현에 유리한 C43 균주를 병행해 사용하였다.

우선 독립된 소단위체로 발현되는 amo 유전자가 pET vector에 클로닝된 각각의 재조합벡터를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환한 후, 0.1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다(Fig. 3A). 그 결과, AmoB와 AmoC에 해당되는 과발현 band를 확인할 수 있었으나, AmoA는 단백질 band가 확인되지 않았다. 또한 발현된 대부분의 단백질이 가용성 분획에서는 확인되지 않아, inclusion body와 같은 불용성 응집체로 발현됨을 알 수 있었다. 이러한 특성은 발현조건의 조절, 즉 배양온도나 배지, 유도체 농도의 변화를 통해서도 개선되지 않았고, 발현벡터 (pTrc99a와 pQE30)와 숙주를 변경한 조건에서도 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 일반적으로 가용성발현유도에 유리한 시스템으로 알려진 pMAL-c2x 벡터를 이용해 MBP 융합단백질의 형태로 발현을 유도해 보았다. 제작된 재조합벡터는 E. coli C43(DE3)에 형질전환한 후, IPTG로 발현이 유도된 세포파쇄액을 SDS-PAGE로 분석하였다(Fig. 3B). 기대와 달리, 단백질 접힘과 가용성 발현에 도움을주는 MBP융합형태로 발현됨에도 불구하고 AmoC만이 과발현이 유도되는 것이 확인되었다. amoAamoB가 삽입된 construct에서는 MBP로 추정되는 위치에서만 과발현 band가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 숙주에서가용성으로 강제발현된 융합단백질의 독성이나 불안전성으로 인해 융합파트너인 MBP만 남아 있고, AMO 소단위체는 단백질 가수분해 효소에 의해 분해된 결과로 추정된다.

Figure 3. SDS-PAGE analyses of recombinant AMO subunits in the sole and fusion state. Representative Coomassie stained SDSPAGE of expressed recombinant proteins in the sole (A) and MBP-fusion state (B) as described in the section of Materials and Methods. M, size marker; T, total fraction; S, soluble fraction. Red arrows indicate the corresponding band to expected size of sole (A) and fusion protein (B).

AmoC의 경우, 독립발현으로는 불용성 응집체로 발현되었으나, MBP-AmoC의 경우에는 가용성으로 과발현되었다. 이를 amylose resin을 이용하여 순수 분리하였다. 정제된 단백질에 Factor Xa를 처리하여 MBP와 AmoC의 분리를 시도하였다. 결과적으로, 융합단백질인 MBP-AmoC, 분리된 MBP와 AmoC의 분자량으로 예측된 63, 42, 그리고 21 kDa 위치에서 정제되어, 이를 이용한 항체제작을 시도하였다. 이러한 분리정제법은 선행연구의 결과와 같이 가용성을 보이는MBP 융합단백질을 이용하는 전형적인 결과로 잘 알려져 있다 [30].

3.4. Anti-AMO antibody 제작과 활용 가능성 확인

전술한대로 융합단백질과 안정적으로 분리된 소단위체 AmoC를 AOA 탐침을 위한 항체제작에 이용하였다. 토끼를이용한 항체제작은 전남대 수의대의 도움을 받아 진행하였으며, protein A affinity column을 이용하여 추출하였다. 이후 MBP만이 과발현된 대장균 lysate와의 침전유도 (immunopreci-pitation)를 통해, 정제된 AmoC를 항원으로 주사하는 과정에서 남아 있을 수도 오염원 (완전히 제거되지 않은 MBP나 정제과정에서 미량으로 남아 있을 수도 있는 대장균 유래 단백질)에 의해 생성된 항체를 제거하는 과정을 거쳐 순도를 개선하였다. 예비실험과정에서 제작된 항체의 특이성을 western blot으로 확인해 본 결과, 일부 비특이적인 반응 밴드가 보임에도 불구하고 대장균에서 AmoC를 독립발현시킨 경우(pET 벡터에서 발현된 불용성 응집체)와 MBP와 융합된 상태, 그리고 AR 고균 배양체 crude extract (2D gel 분석에 이용)에서 특이적으로 반응하는 밴드를 확인하였다. 또 다른 예비실험으로 사람을 포함한 일부 포유류에서 흔히 발견되는microbiota의 일종인 Veillonella parvulaPropionibacterium acnes를 대상으로 anti-AMO 항체의 반응 특성을 살펴보기 위한 IF를 수행하였다. 결과적으로 두 종의 미생물과는 반응이 일어나지 않음이 확인되어, 제작된 항체가 AMO 단백질을 지닌 고균에 특이적일 수 있음을 지지하는 증거들을 확보할 수 있었다 (AR 배양액과 동시에 IF 를 수행한 Fig. 5A 참조).

Figure 5. Immunofluorescence staining results of mixed cells and environmental samples using anti-AMO antibody. (A) Immunofluorescence staining image of mixed AR with a bacterial strain. To evaluate specific binding of anti-AMO antibody to AR, the enriched AR culture was deliberately mixed with a typical bacterial strain P. acnes (a) and V. parvula (b), then treated with anti-AMO antibody according to the same procedure described in the section of Materials and Methods. (B) IF staining images of environmental samples (Gwangju, Korea) from soils (sampling site from a to c) and activated sludge (d, sludge. e, concentrated sludge, f, filter cake). Immuno-stained fluorescence spots (red) with anti-AMO antibody probe indicate a microcolony of probable (AOA-like) organisms. Scale bars represent 1 µm.

반응특성이 부분적으로 확인된 anti-AMO 항체를 암모니아 산화 고세균에 대한 실 탐침도구로 사용할 수 있는지를 확인하기 위한 IF를 수행하였다 (Fig. 4A). 상대적으로 농화가 진행되지 않은 AR 초기 배양체를 이용하여 IF를 수행한결과, 광학현미경에서는 세포의 형태가 관찰되지 않는 부분에서 뚜렷한 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 일반적인 세균에 비해 매우 작은 해양유래 (Group I.1a 계통)의 암모니아 산화 고균의 크기 (직경 0.15~0.2 μm, 길이0.5~1.0 μm)에 의한 전형적인 현상인 것으로 판단되었다. 작은 크기로 인해 일반 광학현미경에서는 고균의 관찰이 용이하지 않은 것으로 흔히 보고되고 있기 때문이다 [14,18-20,24]. 광학현미경에서는 세포의 형태가 관찰되지 않으나 형광이 나타나는 부분에 실제로 세포가 존재하는지 확인하기 위하여, SYTO 9으로 AR 배양액 내의 전체 미생물을 염색 (핵산염색)하고 anti-AMO 항체를 사용하여 암모니아 산화 고균만을 특이적으로 염색 (IF)한 후, 두 형광이 동일한 위치에 나타나는지를 확인하였다 (Fig. 4B). 그 결과, 세포의 존재를 암시하는 SYTO 9 핵산염색과 anti-AMO 항체에 의해 나타나는 형광이 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 암모니아 산화 고균은 일반 광학현미경으로는 쉽게 관찰되지 않지만, anti-AMO 항체로 IF를 수행하였을 때 나타나는 형광이 실제로 세포가 존재하는 부분이라는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 반응 특성은 AR 배양액과 전술한 두 종의 대조군 (Veillonella parvulaPropionibacterium acnes) 배양액을 임의로 혼합해 수행한 IF 결과에서도 확인할 수 있었다(Fig. 5A). 그림과 같이 광학현미경으로 분명하게 관찰되는 두 종의 세균에 대한 비특이적 반응은 관찰되지 않았고 일반 광학현미경상에서 보이지 않는 AR의 존재가 앞선 결과와 같이 확인되었다. 유의미한 선택적 반응특성을 보이는 anti-AMO 항체를 생태계 실시료인 부엽토와 활성오니에 적용한 결과에서도, 고균으로 추정되는 형광을 확인할 수 있었다 (Fig. 5B).

Figure 4. Immunofluorescence and SYTO 9 staining of AOA AR. (A) Immunofluorescence staining image of a starter culture of AR. Optical and immunofluorescence images were merged after successive observation of the same sample with optical and fluorescence microscope. (B) Immunofluorescence staining for merged SYTO 9 stained AR culture (green) was evaluated by fluorescence microscope using anti-AMO antibody. Scale bars represent 1 μm.

3.5. Discussion

기존의 많은 보고들은 amoA 유전자를 지표로 암모니아 산화 고균의 존재와 다양성을 핵산수준에서 주로 증명하였고, 단백질을 대상으로 한 탐침 연구는 극히 미미한 상황이다. 본연구에서는 암모니아 산화 고균의 핵심 단백질인 AMO를 기반으로 항체를 제작하여 고균의 탐침을 시도하였다. 이를 위해 세개의 소단위체를 독립적으로 발현시켜 보았으나, 불안정하거나 불용성응집체로 발현되는 것을 확인하였다. 이는 기 보고된 문헌에서 관련 유전자를 대장균에서 발현시킬 경우, 유전자의 발현 산물이나 활성 결과물이 숙주에 독성을 지닐 수 있음을 예측한 결과와 일치한다 [31]. 또한 AmoA와signal peptide를 지니고 있는 것으로 예측된 AmoB가 MBP와 융합된 상태에서도 정상적으로 발현되지 않는 이유를 설명할 수 있는 근거도 될 수 있을 것이다. 활성이 있는 완전한 AMO complex가 필요하지 않는 현 연구의 목적으로 인해 시도하지는 않았지만, 필요할 경우 이러한 문제점을 고려한AMO 발현전략을 고려해 볼만한 가치가 있을 것 으로 판단된다. 이때 2D 결과에서 볼 수 있는 것처럼, 고균 자체에서는 이들 단백질들이 과발현되는 특성을 지니고 있음을 확인하였기에, 유전체 정보를 활용한 고균 발현시스템 (전사, 번역, 접힘인자 등)의 세균과의 비교나 상대적으로 유전적 조작이 용이한 AOA 관련 숙주를 개발하기 위한 전략으로 활용할 수 있을 것이다.

MBP와 융합된 상태에서 상대적으로 안정적인 발현이 확인된 AmoC를 이용하여 고균에 특이적인 항체가 제작된 증거를 얻을 수 있었다. 제작된 anti-AMO 항체가 특이성을 지니고 있음은 본 실험 결과인 IF를 통해 확인할 수 있었다. Anti-AMO 항체에 결합하는 이차항체로 형광을 띄는 세포의 이미지는 광학현미경에서는 관찰할 수 없으나 IF로는 뚜렷하게 관찰이 가능한 흥미로운 특성을 보여주었다. 이러한 특성은 핵산탐침자를 이용한 FISH 결과에서도 이미 알려진 현상이다. 또한 형광을 통해 관찰되는 세포의 이미지 (모양, 크기와 같은 형태)는 관련 고균 SCM1의 세포분열 관련 단백질에 특이적인 항체를 이용한 문헌의 결과와 유사한 것을 확인할 수 있었다 [32]. 또한 이러한 이미지 형태는 해양 시료로부터 고균에 특이적인 핵산탐침자를 사용하여 수행한 FISH결과와 최초의 암모니아 산화 고균의 분리를 보고한 문헌에서 수행한 FISH 결과와도 매우 유사함을 확인할 수 있었다[14,33].

AMO를 발현하는 AOA 고균에 특이성을 지닌 것으로 판단되는 결과를 바탕으로 anti-AMO 항체를 주변의 흔한 생태환경 시료에 적용해 보았다. 환경시료는 부엽토와 하수 처리장의 다양한 슬러지를 이용하였다. 토양에 서식하는 암모니아 산화 고균이 분리되어 보고되어 있으며 [19,20], 활성 슬러지에서의 고균의 존재도 이미 보고되었다 [34-36]. 각각의 환경시료를 anti-AMO 항체를 이용하여 IF를 수행한 결과, 배양된 AR 시료를 사용한 IF 결과에 비해 형광세기는 다소 약했으나 모든 시료에서 형광이 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 형광 이미지도 광학현미경에서는 세포형태가 보이지 않는 부분에 나타나는 특성을 보여주었다. 토양 시료의 경우, 여름에 채취한 시료에 비해 초겨울에 채취한 시료에서 상대적으로 고균으로 추정되는 형광이 빈번하게 관찰되었다. 이는 암모니아 산화 고균의 최적 생육 온도가 약25°C로 보고된 것을 바탕으로 계절의 온도차에 따른 고균 분포의 차이라고 생각된다. 고균의 존재를16S rRNA 유전자 증폭을 통해 확인해 본 결과, 이용된 환경시료에서 고균 16S rRNA 서열이 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 본 실험에서 형광이 나타난 부분에 존재하는 것이 실제 고균인지는 추후에 더 확인해 보아야 할 여지가 남아있으나, 전술한 결과대로 CYTO 9에 의한 핵산 염색결과와 IF 염색결과가 일치한다는 점과 시료에서의 AOA 16S rRNA의 검출, 예비실험에서 확인된 Western 결과 등을 기반으로, 제작된 anti-AMO 항체가다양한 환경 시료로부터 암모니아 산화 고균을 탐색할 수 있는 도구로서 사용할 수 있는 가능성을 제시한다. 본 연구에 사용된 AmoC는 해양 고균 유래 단백질이나 토양 유래 암모니아 산화 고균인 N. koreensis MY1의 단백질과 97.83%의높은 상동성을 보여주기에, 동일한 항체가 결합할 확률이 높아 이러한 가능성이 더욱 높음을 알 수 있다. 이는 본 연구에서 제작한 해양 고균에 특이적인 anti-AMO 항체가 다양한환경에 존재하는 암모니아 산화 고균 탐침자로 사용할 수 있을 가능성을 의미한다.

본 연구에서 제작한 anti-AMO 항체는 진화적으로 밀접한 단백질을 발현하는 암모니아 산화 고균의 탐침자로서 사용이가능한 특성을 지닌 것으로 판단된다. 따라서 기존의 핵산탐침자를 이용한 FISH를 이용한 탐침법과의 상호 보완적인 역할이 기대되어진다. 또한, 다중항체 생산의 일반적인 방법에 의해 쉽게 제작할 수 있는 강점을 지니고 있다. 따라서, 생산이 용이한 anti-AMO 항체를 이용한 친화 크로마토그래피 제작이 성공할 경우, 고균으로부터 직접 관련된 단백질을 단일과정으로 정제할 수 있는 방법도 제공할 수 있을 것이다. 이를 통해 아직도 관련된 연구도구가 부족한 고균 생리와 생태 연구에 일조할 수 있을 것으로 기대되어진다.

본 연구는 교육과학기술부 한국연구재단 지원 과제 (20090087901) 결과를 기반으로 후속 연구주제 발굴을 위한 전남대학교 산학협력단 교내지원 과제 (2021-1770)의 도움에 의해 수행되었기에, 이에 감사드립니다.

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