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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2022; 37(4): 159-165

Published online December 30, 2022 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2022.37.4.159

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

Chlorella vulgarisParachlorella sp. 메탄올 추출물의 항산화 및 항암 효과

Anti-cancer and Anti-oxidant Properties of Methanolic Extracts of Chlorella vulgaris and Parachlorella sp.

Hyun-Jin Jang1, Kyung June Yim2, Chang Soo Lee2, Ji Young Jung2, Hyun Ju Nam2, Yeji Park2, Yu Ho Kim2, Jee-Hwan Kim2, Su-Hwan Cheon3, and Z-Hun Kim2*

1Laboratory of Chemical Biology and Genomics, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejeon 34141, Korea
2Microbial Research Department, Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Sangju-si 37242, Korea
3Hu evergreen Pharm Inc., Incheon 21447, Korea

Correspondence to:Tel: +82-54-530-0841, Fax: +82-54-530-0849
E-mail: kimzhun@nnibr.re.kr

Received: September 21, 2022; Revised: December 6, 2022; Accepted: December 7, 2022

The anti-cancer and anti-oxidant activities of methanolic extracts from two indigenous freshwater microalgae (Chlorella vulgaris and Parachlorella sp.) were evaluated in vitro. The extracts from Chlorella vulgaris and Parachlorella sp. contained total polyphenols (236.9 ± 13.3, 223.0 ± 4.5 mg/g extract, respectively) and flavonoids (14.6 ± 1.3, 31.3 ± 3.1 mg/g extract respectively). Their anti-oxidant activities were evaluated 20 ± 1% and 95 ± 2%, respectively, when treated with 50 mg/mL of the extracts. From the results of cytotoxicity test, both extracts did not inhibited significantly growth of human breast epithelial cells treated with 10 μg/mL to 500 μg/mL. The microalgal extracts effectively suppressed growth of various cancer cells (DLD-1, MDA-MB 231, MIA PaCa-2 and HCC827). Especially, the extracts from C. vulgaris and Parachlorella sp. effectively inhibited growth of DLD-1 cancer cells (97% and 69%, respectively) when treated with 500 and 1,000 μg/mL, respectively. These results clearly demonstrate that the methanolic extract of C. vulgaris and Parachlorella sp. could be used as a potential natural material as pharmaceutical ingredients.

Keywords: Chlorella, Parachlorella, phytochemicals, anti-cancer, anti-oxidant

암은 세포수의 항상성을 유지하는 정상세포와는 달리 비정상적인 무한증식 과정을 통해 혈류와 림프관을 따라 전신으로 전이되어 사망에까지 이르게 하는 치명적인 질병이다[1,2]. 현대의 발전된 의학기술 및 치료법의 개발에도 불구하고, International Agency for Research on Cancer (France)에 따르면 2018년에 전세계적으로 1,810만명의 암환자가 발생하였고, 이중 50%가 넘는 960만명이 암으로 인해 사망한 것으로 보고하였다. 국내에서도 경제성장에 따른 서구화된 식습관과 생활습관으로 인해 암 발병률과 암으로 인한 사망률이 증가 추세에 있다. 구체적으로 국립암센터가 발표한 암등록통계에 따르면 2019년의 암발생자는 254,718명으로 불과 1년만에 3.6% 증가했다고 밝혔다. 또한 통계청의2019년 사망원인통계에 의하면, 암으로 인한 사망이 27.5%로 3대 주요사망원인 (암, 심장 질환, 폐렴) 중1위를 차지하였다. 따라서 암을 효과적으로 억제하고 치료할 수 있는 방법이 시급히 강구되어야 할 것이다.

암을 치료하는 대표적인 방법으로는 절제술, 방사선 치료, 화학요법 등이 있으며, 특히 항암제를 이용하는 화학요법은 다양한 암을 효과적으로 치료할 수 있는 장점을 가지고 있다[3,4]. 그러나 항암제의 강한 인체독성은 암세포뿐만 아니라 정상세포와 조직에 악영향을 미쳐 유전자 손상, 조혈 장애, 탈모 및 면역 기능 저하 등과 같은 다양한 형태의 부작용이 발생하는 것으로 알려져 있다 [5-8]. 이러한 항암제의 단점을 극복하기 위해 인체의 독성과 부작용이 상대적으로 낮은 생물자원 (e.g., 식물, 미생물)을 이용한 연구가 활발히 일어나고 있다 [9-14].

생물자원 중 하나인 미세조류는 현재 지구상에 20만종 이상이 서식하고 있으며, 수서환경에서 생장하는 광합성 미생물로써 생장을 통해 산업적으로 유용한 불포화 지방산, 단백질, 색소 등과 같은 고부가가치 물질의 고농도 생산이 가능하다 [15-19]. 특히 암세포의 세포증식, 세포형질전환, 소핵(Micronucleus) 생성을 억제함으로써 항암능을 가진다고 알려진 다양한 종류의 카로티노이드 (carotenoid)를 다량 함유하고 있다 [20]. 또한 미세조류가 생산하는 docosahexaenoic acid(DHA)와 eicosapentaenoic acid(EPA)와 같은 불포화지방산이 신경호르몬 촉진을 통한 뇌기능 향상, 콜레스테롤 저하 등 각종 질환개선에 탁월한 효과가 있다고 알려져 있어 생리활성이 우수한 자원으로 주목 받고 있다 [21,22]. 규조류인 Cocconeis scutellum의 EPA는 유방암세포 (BT20)의 세포사멸을 조절하는 단백질인 caspases-3, 8를 활성화하여 암세포 사멸시키며, 해양 미세조류인 Nannochloropsis oculata의 추출물은 대장암세포 (CT-26)의 생장을 효과적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다 [23,24]. 그럼에도 불구하고 국내의 경우 지속적인 미세조류 조사발굴을 통해 다양한 미세조류자원을 확보하고 있으나, 이에 대한 생리활성 기능에 대한 연구는 미미한 실정이다.

이전 연구에서 본 연구진은 국내에서 발굴한 토착 담수 미세조류인 Mychonastes 속 4종의 methanol 추출물이 다양한 암세포 증식의 억제효과를 확인한 바 있다. 본 연구에서는 생장성이 우수하고 기능성 불포화지방산을 다량함유하고 있는 토착 담수 미세조류 Chlorella vulgarisParachlorella sp. 를 이용하여 생리활성 물질 및 항암기능을 탐색하고자 하였다. 항산화 물질로 알려진 폴리페놀 (polyphenol)과 플라보노이드 (flavonoid) 함량과 활성산소 제거능을 평가하였다. 또한 인간 유래 정상세포와 대장암, 유방암, 췌장암, 폐암 세포 생장에 미세조류 methanol 추출물이 미치는 영향에 대해 평가하여 미세조류를 이용한 새로운 암 치료 생물자원으로서의 가능성을 발견하고자 하였다.

2.1. 미세조류 균주 및 종균의 유지

본 연구에서 사용된 균주는 생장성이 우수하고 기능성 불포화지방산을 다량함유하고 있는 토착 담수 미세조류인 Chlorella vulgaris FBCC-A49와 Parachlorella sp. FBCC180029를 국립낙동강생물자원관 생물자원은행 (Freshwater Bioresources Culture Collection; FBCC)에서 분양 받아 사용하였다 [25]. 미세조류의 종균 유지를 위하여 미세조류 배양에 널리 사용되는 BG11 배지를 제작하여 사용하였다. 미세조류의 배양은 온도 25°C, 광도 300 μmol/m2/s의 조건에서 0.5 L 원통형 광생물반응기를 이용하여 배양하였으며, 5% 이산화탄소와 95% 공기가 혼합된 가스를 반응기 하단부로부터 0.1 vvm 속도로 지속적으로 공급하였다. 미세조류의 계대배양은 10일마다 주기적으로 시행하였다.

2.2. 미세조류 methanol 추출물의 제조

10일간 배양된 C. vulgarisParachlorella sp. 의 배양액에서 원심분리를 이용하여 세포만을 회수하였고, 회수한 균체는 동결건조기 (FD8512, lshinbiobase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 동결건조하였다. Methanol 추출물 제조를 위해 건조된 균체 5 g에 99.5% methanol (Daejung, Busan, Korea) 1L를 넣어 추출하였다. 추출물은 초음파추출기 (Powersonic 410, Hwashin Tech, Daegu, Korea)로 20분간 처리 후 상온에서 24시간 반응시켰다. 처리된 추출물을 회전증발농축기(N-2110, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하였으며, 동결건조기를 이용하여 잔여 methanol을 제거하였다. 제조된 시료는 사용할 때까지 −70°C 초저온냉동고에 보관하였다. 농축된 시료는 dimethylsulphoxide (DMSO; Sigma–Aldrich, St. Louis, USA)에 녹여 일정 농도로 제조하였으며, 폴리페놀과 플라보노이드 함량 분석, 항산화와 항암 활성 평가에 사용하였다.

2.3. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물 함량 측정

미세조류 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정은 변형된 Folin-Denis 방법을 이용하여 측정하였다 [26]. 제조한 미세조류 methanol 추출물을 DMSO을 이용하여 200 μg/mL 농도로 희석한 후, 96-well microplate의 각 well에 희석한 추출물 50 μL와 Folin-Denis(Sigma–Aldrich) 용액 100 μL을 각각 혼합하여 3분간 실온에서 반응시켰다. 반응 후 10% sodium carbonate solution 100 μL를 각각 첨가하여 실온의 암실에서 1시간 반응 시켰으며, 상층액을 취하여 분광광도계를 이용하여(Multiskan GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Scientific, Vanta, Finland) 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 추출물의 총 폴리페놀 함량은 DMSO에 녹인 31.25, 62.25, 125, 250, 500 μg/mL 농도의 gallic acid(Sigma–Aldrich)의 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

미세조류 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Moreno et al.[27]의 방법을 변형하여 측정하였다. 제조한 C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물을 1,000 μg/mL 농도로 희석한 후, 96-well microplate의 각 well에 희석한 추출물 40 μL와 10% aluminum chloride 10 μL, 1 M potassium acetate 10 μL, 80% ethanol 140 μL를 차례로 각각 첨가하였다. 첨가 후 실온의 암실에서 1시간 반응시켰으며, 반응 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 추출물의 총 플라보노이드 함량은 DMSO에 녹인 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL 농도의 quercetin(Sigma–Aldrich)의 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

2.4. DPPH 라디칼 소거능 측정

미세조류 추출물의 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) free radical 소거능을 측정하기 위해 Kano et al. [28]의 방법을 변형하여 실시하였다. 제조한 C. vulgarisParachlorella sp. 추출물을 DMSO를 이용하여 1, 10, 25, 50 μg/mL 농도로 희석한 후, 96-well microplate의 각 well에 희석한 추출물 100 μL와 95% ethanol(Merk, Darmstadt, Germany)에 녹인 0.2 mM DPPH 용액 100 μL을 각각 혼합하였다. 혼합 후 실온의 암실에서 1시간 반응시켰으며, 반응 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 추출물 시료의 처리구 (sample)와 무처리구 (control) 사이의 흡광도 차이를 백분율로 계산하였으며 (1), 미세조류 추출물의 색소를 고려하여 blank는 미세조류 추출물과 95% ethanol 각각 혼합하여 사용하였다.

Radicalscavengingactivity%=1OD517nmsampleOD517nmBlankOD517nmcontrol×100

2.5. 세포주 및 세포 배양

미세조류 methanol 추출물의 암세포 생장억제 효과와 세포독성을 평가하기 위해 대장암 (DLD-1, ATCC CCL-221), 유방암 (MDA-MB 231, ATCC HTB-26), 췌장암 (MIA PaCa-2, ATCC CRL-1420), 폐암 (HCC827, ATCC CRL-2868) 세포와 정상세포인 인간 유방 상피 세포 (MCF-10A, ATCC CRL-10317)를 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 암세포의 유지를 위해 10% Fetal bovine serum(FBS; HyClone Laboratories, Logan, USA), 1% antibiotic-antimycotics(Gibco, Langley, USA), RPMI 1640(HyClone)을 혼합하여 배양하였으며, 인간 유방상피 세포 (MCF-10A)의 유지를 위해 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotics(Gibco, Langley, USA)가 함유된 DMEM/F12(Gibco) 배지를 사용하여 배양하였다. 본 실험에 사용된 암세포와 정상세포는 37°C, 5% CO2 항온기 (BB150, Thermo, Langenselbold, Germany)에서 2-3일 간격으로 주기적으로 계대배양하였다.

2.6. 세포독성 평가

미세조류 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 정상세포인 인간 유방 상피 세포 (MCF-10A)에 추출물 처리 후 세포의 생존율을 계산하여 평가하였다. 세포 현탁액은 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotics(Gibco)가 함유된 DMEM/F12 배지를 사용하였다. 96-well plate의 각 well에 DMEM/F12 배지를 이용하여 5 × 104 cells/mL의 농도로 희석하여 100 μL씩 접종하였으며, 37°C, 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 DMEM/F12 배지를 이용하여 추출물 시료농도가 1 mg/mL가 되도록 희석하였으며, 이를 100, 200, 500, 1,000 μg/mL 농도로 단계적 희석을 하여 200 μL씩 처리하고, 37°C, 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 세포생존율은 Cell proliferation reagent WST-1(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)을 이용하였으며, 96-well plate 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 추출물의 세포독성은 추출물 시료의 처리구 (sample)와 무처리구 (control) 사이의 흡광도 차이를 백분율로 계산하였으며(2), blank는 DMEM/F12 배지만을 사용하였다.

Cellciability%=OD450nmsampleOD450nmBlankOD450nmcontrolOD450nmBlank×100

2.7. 미세조류 추출물의 암세포 생장억제 평가

미세조류 추출물의 암세포 생장억제효과는 추출물 처리 후 대장암 (DLD-1), 유방암 (MDA-MB 231), 췌장암 (MIA PaCa-2), 폐암 (HCC827) 세포의 생존율을 계산하여 평가하였다. 세포 현탁액은 1% antibiotic-antimycotics(Gibco)와 10% FBS(HyClone) 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 96-well plate의 각 well에 RPMI 1640 배지를 이용하여 5 × 104 cells/mL의 농도로 희석하여 100 μL씩 접종하였으며, 37°C, 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 RPMI 1640 배지를 이용하여 추출물 시료농도가 1 mg/mL가 되도록 희석하였으며, 이를 100, 200, 500, 1,000 μg/mL 농도로 단계적 희석을 하여 200 μL씩 처리하고, 37°C, 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 세포 생존율은 Cell proliferation reagent WST-1(Roche Diagnostics)을 이용하였으며, 96-well plate 분광광도계 (Sunrise, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 추출물의 암세포 생장 억제능 효과은 추출물 시료의 처리구 (sample)와 무처리구 (control) 사이의 흡광도 차이를 백분율로 계산하였으며 (2), blank는 RPMI 1640 배지만을 사용하였다.

2.8. 통계분석

모든 분석은 3번의 반복 수행하였으며, 분석 수치는 Mean ± SEM(n=3)으로 나타내었다. 수집된 결과 는 Prizm 프로그램(GraphPad Software, La Jolla, USA) 을 이용하여 통계 분석하였다. 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 P < 0.05 수준에서 analysis of variance와 Tukey’s test에 의해 분석하였다 [29].

3.1. 미세조류의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 분석

식물계에 널리 분포하는 폴리페놀과 플라보노이드는 방향족 알코올 화합물의 일종이며, 다수의 수산화기(-OH)를 가지고 있어 다른 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있다. 이러한 특성을 통해 인체 내 높은 활성산소종 제거능을 가지고 있어 항염증, 항암, 항바이러스 효과가 우수하다 [30,31]. 미세조류 추출물의 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 분석한 결과, 폴리페놀을 높은 농도로 함유하고 있었다 (Table 1). C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물의 폴리페놀 화합물 함유량은 각각 236.9 ± 13.3 mg/g extract 와 223.0 ± 4.5 mg/g extract로 Pradhan et al. [32]에 의해 보고된 Chlorella vulgaris Beyerinck의 methanol 추출물 (46 mg/g extract)보다 폴리페놀화합물 함유량이 약 5배 높은 것을 확인하였다. Parachlorella sp.의 추출물의 플라보노이드 함유량은 31.3 ± 3.1mg/g extract로 C. vulgaris의 추출물 (14.6 ± 1.3 mg/g extract)보다 2배 이상 높았다. C. vulgarisParachlorella sp.의 폴리페놀은 늑막염, 소염, 이뇨작용 등의 치료용으로 사용되는 질경이(Plantago asiatica)의 methanol 추출물 (246.4 ± 4.1 mg/g extract)과 유사한 수치를 보였으며, Parachlorella sp. methanol 추출물은 항당뇨와 항염증 작용이 우수한 약용식물인 치자(Gardenia Jasminoides)의 플라보노이드 함량 (26.2 ± 0.6 mg/g extract)과 유사한 수치를 보였다 [33-36]. 미세조류는 광도, 온도, 이산화탄소, 영양염 결핍 등의 배양 조건에 따라 함유하고 있는 생리활성물질의 농도가 달라지며, Miranda et al.[37]에 의하면 동일 미세조류라도 배양온도에 따라 폴리페놀 함량이 달라진다고 보고된 바 있다. 따라서 C. vulgarisParachlorella sp. 의 배양연구를 통해 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 향상시키는 것이 가능할 것으로 판단된다.

Table 1 Total polyphenolic and flavonoid content of Chlorella vulgaris and Parachlorella sp. extracts

FeedstockScientific nameTotal polyphenolic content (mg/g extract)Total flavonoid content (mg/g extract)Ref.
Medicinal plantsPlantago asiatica246.4 ± 4.148.1 ± 2.2[36]
Gardenia jasminoides121.7 ± 69.826.2 ± 0.6[36]
MicroalgaeChlorella vulgaris Beyerinck45.0 ± 0.1470.0 ± 0.3[32]
Chlorella vulgaris FBCC-A49236.9 ± 13.314.6 ± 1.3This in study
Parachlorella sp. FBCC180029223.0 ± 4.531.3 ± 3.1This in study


3.2. 미세조류 추출물의 항산화 활성

인간의 호흡 또는 환경적인 요인으로 생성되는 활성산소(reactive oxygen species)는 홀전자 (unpaired electron)의 높은 반응성을 통해 인체 내 세포의 유전자 및 단백질를 산화시킨다. 활성산소의 세포 내 산화반응으로 세포의 변이를 일으켜 암 발생을 유도한다고 알려져 있다 [38,39]. 이러한 암 발생을 방지하기 위해서는 활성산소를 효과적으로 제거할 수 있는 항산화력이 우수한 물질의 개발이 필요하다.

본 연구에서는 활성산소의 제거능을 확인하기 위해 DPPH radical 소거활성을 이용하여 항산화 효과를 평가하였다. C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물을 1, 10, 25, 50 mg/mL로 처리한 결과, 모든 처리군에서 농도 의존적으로 항산화능이 향상되는 것을 확인하였다 (Fig. 1). C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물을 50 mg/mL 처리시 각각 20 ± 1%와 95 ± 2%로의 활성산소 제거능을 나타내었다. C. vulgaris 추출물을 10 mg/mL의 농도로 처리시, 15 ± 1%의 항산화 활성을 보였으며, 이는 Assunção et al. [40]의 연구에서 보고된 C. vulgaris의 enthanol 추출물 (10 mg/mL 처리시, 14%)의 항산화 활성수치와 유사하다. Parachlorella sp.의 추출물을 10 mg/mL의 농도로 처리시, 40.0 ± 3.3%의 항산화 활성을 보였으며, 이는 항산화력이 우수한 카로티노이드인 astaxanthin을 생산하는Haematococcus pluvialis의 추출물 (10 mg/mL 처리시 13%)보다 3배 이상 높은 수치이다 [40]. 이러한 C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물의 항산화능은 미세조류의 폴리페놀과 플라보노이드 화합물 함유량과 상관성을 보여주는 것으로 판단된다 (Table 2).

Table 2 Anti-oxidant activity of the two freshwater microalgae as relative comparison

MicroalgaeStrainUsed solvent for extraction% Inhibition (10 mg/mL)Ref.
Chlorella vulgarisACOI 879Ethanol14.0 ± 0.0[40]
Haematococcus pluvialisACOI 3380Ethanol12.9 ± 0.0[40]
Chlorella vulgarisFBCC-A49Methanol15.0 ± 1.0This in study
Parachlorella sp.FBCC180029Methanol40.0 ± 3.3This in study


Figure 1. Anti-oxidant activities of methanolic extract from Chlorella vulgaris and Parachlorella sp. To evaluate radical scavenging effects, each concentration of microalgal extracts were incubated with DPPH reaction mixture, in which DPPH radical was induced by sonication. Data represent the mean ± SEM of three independent experiments. ***p < 0.001 versus non-treated cells.

3.3. 미세조류 추출물의 세포독성 및 암세포 성장억제 효과

인간 유방 상피세포 (MCF-10A)를 사용하여 C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물을 대상으로 정상세포 독성을 확인하였다. C. vulgaris의 추출물은 500 μg/mL 농도까지 MCF-10A에 독성을 나타내지 않았으나, 고농도인 1,000 μg/mL 에서 77 ± 7%의 급격한 세포 독성을 나타냈다. 반면 Parachlorella sp.의 추출물을 세포에 1,000 μg/mL로 처리시 대조군에 비해 농도 의존적으로 세포 생장을 약 30%까지 증가시키는 것을 확인하였다 (Fig. 2).

Figure 2. Cytotoxic effect of methanolic extracts from Chlorella vulgaris(A) and Parachlorella sp.(B) on human breast epithelial cells. The cells were treated with extract of Chlorella vulgaris and Parachlorella sp. for 48 hr and the cell viabilities were assessed by WST-1 assay. Data represent the mean ± SEM of three independent experiments. *p < 0.05, and **p < 0.01 versus non-treated cells.

C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물을 대상으로 대장암 세포 (DLD-1), 유방암 세포 (MDA-MB 231), 췌장암 세포 (MIA PaCa-2), 폐암 세포 (HCC 827)에 대해 암세포 생장억제 효과를 확인하였다. C. vulgarisParachlorella sp.의 추출물은 인체 유래의 대장암, 유방암, 췌장암, 폐암 세포에 대해 농도 증가에 비례하여 암세포의 증식을 억제하였다(Fig. 3(A), Fig. 3(B)). C. vulgaris의 추출물은 500 μg/mL 처리시 대장암 세포와 췌장암 세포에서 약 97 ± 1%와 75 ± 2%의 항암능을 나타낸 반면에, 유방암 세포와 폐암 세포에 대해서 17 ± 9%와 38 ± 3%의 항암능을 나타냈다 (Fig. 3(A)). Parachlorella sp.의 추출물은 1,000 μg/mL 처리시, 대장암 세포와 췌장암 세포에 대해 69 ± 4%와 47 ± 6%의 항암능을 나타낸 반면, 유방암 세포와 폐암 세포에 대해서 8 ± 5%와 24 ± 2%의 항암능을 나타냈다.

Figure 3. Inhibitory effect of methanolic extract from Chlorella vulgaris(A) and Parachlorella sp.(B) on growth of DLD-1, MDA-MB 231, MIA PaCa-2, and HCC 827 cancer cells. The cells were treated with extracts of Chlorella vulgaris and Parachlorella sp. for 24 hr and the cell viability was assessed by WST-1 assay. Data represent the mean ± SEM of three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001 versus non-treated cells.

Hamouda et al. [41]의 연구에 따르면, C. vulgaris의 methanol 추출물은 간암 세포 (HepG2), 대장암 세포 (HCT-116), 자궁경부암 세포 (HeLa), 전립선암 세포 (PC3)의 세포 생장에 영향을 주지 못했다고 알려진 반면, C. vulgaris 추출물은 500 μg/mL 에서 정상세포에 독성을 나타내지 않으며 대장암 및 췌장암 특이적으로 75% 이상의 항암능을 보여주었다. Ishiguro et al. [42] 연구에 따르면 Parachlorella kessleri의 열수추출물은 쥐의 면역 세포 활성화를 통해 대장암 세포주(HT-29, Caco-2)에 대해 항암능을 갖는다고 알려져 있다. 또한 Parachlorella sp.가 생산하는 Lutein은 유방암 세포(MDA-MB-157, MCF-7)에 대해 항암능을 나타낸다고 알려진 반면 [43,44], Parachlorella sp.의 추출물은 유방암 세포의 생장에 영향을 주지 않았고, 대장암 및 췌장암 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 3(B)). 이러한 미세조류 추출물의 항암능은 암세포의 세포주기 조절, 세포자멸사 및 자가포식 유도를 통해 암세포의 생장을 억제한다고 알려진 폴리페놀과 플라보노이드에서 기인된 것으로 판단된다[45]. 특히 C. vulgaris FBCC-A49 추출물은 폴리페놀 화합물의 함유량이 우수하였고, 500 mg/mL 처리시 정상세포 생장촉진과 암세포 억제능력이 우수하여 항암 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.

본 연구에서는 국내 담수 수계에서 확보한 담수미세조류 C. vulgarisParachlorella sp.의 기능성 평가를 위해 methanol 추출물을 제조하여 폴리페놀과 플라보노이드 함유량, 항산화 활성 및 세포독성 평가를 통해 암세포 억제효과의 가능성을 확보하고자 하였다. 본 연구를 통해 C. vulgarisParachlorella sp. 내에 항산화력이 우수한 폴리페놀과 플라보노이드 화합물을 고농도로 함유하고 있는 것으로 확인하였으며, 처리농도에 비례하여 활성산소를 효과적으로 제거하는 것으로 나타났다. 또한 미세조류 추출물은 인간유래 정상세포에 처리시 낮은 독성을 나타내었고 다양한 인간의 암세포의 증식을 효과적으로 억제하는 것으로 확인하였다. 향후 암세포에 대한 유효성분 분석과 항암 기작에 대한 추가적인 연구를 진행하여 토착 담수미세조류의 생리활성 효과를 규명한다면 생물소재로서 활용가치를 높일 수 있을 것으로 기대된다.

이 연구는 환경부의 재원으로 국립낙동강생물자원관에서 지원을 받아 수행된 연구입니다 (NNIBR202202109).

  1. Weinberg, R. A (1994) Oncogenes and tumor suppressor genes. CA Cancer J. Clin. 44: 160-170.
    Pubmed CrossRef
  2. Schulze-Osthoff, K., D. Ferrari, M. Los, S. Wesselborg, and M. E. Peter (1998) Apoptosis signaling by death receptors. Eur. J. Biochem. 254: 439-459.
    Pubmed CrossRef
  3. Matsuyama, R., S. Reddy, and T. J. Smith (2006) Why do patients choose chemotherapy near the end of life? A review of the perspective of those facing death from cancer. J. Clin. Oncol. 24: 3490-3496.
    Pubmed CrossRef
  4. Lee, J. W., G. H. Park, H. J. Eo, H. M. Song, M. K. Kim, M. J. Kwon, J. S. Koo, J. R. Lee, M. H. Lee, and J. B. Jeong (2015) Anti-cancer activity of the flower bud of Sophora japonica L. through upregulating activating transcription factor 3 in human colorectal cancer cells. Korean J. Plant Res. 28: 297-304.
    CrossRef
  5. Links M. and C. Lewis (1999) Chemoprotectants: a review of their clinical pharmacology and therapeutic efficacy. Drugs 57: 293-308.
    Pubmed CrossRef
  6. Kim, H. S., S. B. Hong, H. J. Sung, G. A. Moon, and Y. Yoon (2003) Effect of deer blood on reduction of the side effects of chemotherapeutic drugs. Kor. J. Pharmacogn. 34: 145-149.
  7. Grigsby, P. W. (2002) Update on radiation therapy for endometrial cancer. Oncology 16: 777-786.
  8. Park, R. K., K. R. Oh, K. G. Lee, Y. J. Mun, J. H. Kim, and W. H. Woo (2001) The water extract of Boswellia carterii induces apoptosis in human leukemia HL-60 cells. Yakhak Hoeji. 45: 161-168.
  9. Oh, H. S., C. B. Cui, H. T. Choi, S. H. Kim, M. S. Jeon, and S. S. Ham (2004) Antimutagenic and cytotoxic effects of Acer ginnala Max. bark extracts. Korean J. Food Preser. 11: 550-556.
  10. Kim, Y. M., J. R. Do, D. S. Kim, and J. H. Park (2006) Cytotoxicities of hydrolyzed crude laminaran from Eisenia bicyclis on the SNU-1, HeLa and SW cells. Korean J. Food Sci. Technol. 38: 93-798.
  11. Jung, S. E. and J. H. Bae, (2002) The effect of Prunus mume extracts on the growth of Hepg 2 and HeLa cell lines. Korean J. Food Nutr. 35: 439-445.
  12. Park, S. Y., M. O. Shin, S. H. Lee, and S. J. Bae (2005) The growth inhibitory effects of Atrina Pecitinata fractions on cancer cell lines. J. Nutr. Health. 38: 307-312.
  13. Im, H. G., M. H. Yu, D. W. Chung, and I. S. Lee (2006) Inhibitory effects of fungal metabolites isolated from foodstuffs on the growth of human cancer cell lines. Korean J. Food Sci. Technol. 38: 262-267.
  14. Jang, H. J., K. J. Yim, B. Y. Jo, S. W. Nam, Y. H. Nam, B. S. Hwang, C. S. Lee, J. Y. Jung, S. H. Woo, S. Lee, E. Hong, and Z.-H. Kim. (2021) Antioxidant and anticancer activities of methanolic extracts from indigenous freshwater green microalgae. KSBB. J. 36: 154-164
    CrossRef
  15. Joe, H., D.-H. Kim, D. S. Choi, and S. Bai (2018) Optimization of phototrophic growth and lipid production of a newly isolated microalga, Desmodesmus sp. KAERI-NJ 5. Microbiol. Biotechnol. Let. 46: 37-389.
    CrossRef
  16. Mahdieh, M., S. Shabani, and M. R. Amirjani (2019) Characterization of the growth, total lipid and fatty acid profiles in microalga Nanochloropsis oceanica under different nitrogen sources. Microbiol. Biotechnol. Let. 47: 1-19.
    CrossRef
  17. Park, H., D. Hoh, D.-W. Shin, Z.-H. Kim, S.-J. Hong, S.-M. Lim, and C.-G. Lee (2019) Isolation and characterization of five isolates of Tetraselmis sp. with rapid growth rates in low temperatures. J. Mar. Biosci. Biotechnol. 11: 23-28.
  18. Baer, S., M. Heining, P. Schwerna, R. Buchholz, and H. Hübner (2016) Optimization of spectral light quality for growth and product formation in diferent microalgae using a continuous photobioreactor. Algal Res. 14: 109-15.
    CrossRef
  19. Shin, D.-W., J.-H. Bae, Y. Cho, Y.-J. Ryu, Z.-H. Kim, S.-M. Lim, and C.-G. Lee (2016) Isolation of new microalga, Tetraselmis sp. KCTC12236BP, and biodiesel production using its biomass. J. Mar. Biosci. Biotechnol. 8: 39-4.
    CrossRef
  20. Seo, Y. B. and G. D. Kim (2017) Microbial production of carotenoids: biological functions and commercial applications. J. Life Sci. 27: 726737
  21. Carvalho, A. P. and F. X. Malcata (2000) Effect of culture media on production of polyunsaturated fatty acids by Pavlova lutheri. Cryptogram. Algol. 21: 59-71.
    CrossRef
  22. Harun, R., M. Singh, G. M. Forde, and M. K. Danquah (2010) Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renew. Sustain. Energy Rev. 14: 1037-1047
    CrossRef
  23. Nappo, M., S. Berkov, C. Massucco, , V. Di Maria, J. Bastida, C. Codina, C. Avila, P. Messina, V. Zupo, and S. Zupo (2012) Apoptotic activity of the marine diatom Cocconeis scutellum and eicosapentaenoic acid in BT20 cells. Pharm. Biol. 50: 529-535.
    Pubmed CrossRef
  24. Cha, S. H., M. J. Kim, H. Y. Yang, C. B. Jin, Y. J. Jeon, T. Oda, and D. K. Kim (2010) ACE, α-glucosidase and cancer cell growth inhibitory activities of extracts and fractions from marine microalgae, Nannochloropsis oculata. Korean J. Fish. Aquat. Sci. 43: 437-444.
    CrossRef
  25. Yim, K. J., H. Park, C. S. Lee, B. Y. Jo, S. W. Nam, C.-G. Lee, and Z.-H. Kim (2019) Effects of nitrogen and phosphorus starvation on growth and fatty acid production in newly isolated two freshwater green microalgae from nakdonggang river J. Mar. Biosci. Biotechnol. 1: 81-8.
  26. Folin, O., and W. Denis (1912) On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J. Biol. Chem. 12: 239-243.
    CrossRef
  27. Moreno MI, MI. Isla, AR. Sampietro, and MA. Vattuone (2000) Comparison of the free radical scavenging activity of propolis from several region of Argentina. J. Ethnopharmacol. 71: 109-114.
    Pubmed CrossRef
  28. Kano, M., T. Takayanagi, K. Harada, K. Makino, and F. Ishikawa (2005) Antioxidative activity of anthocyanins from purple sweet potato, Ipomoera batatas cultivar Ayamurasaki. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69: 979988.
    Pubmed CrossRef
  29. Tukey, J. W. (1949) Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 99-114.
    Pubmed CrossRef
  30. Lu. Y. and LY. Foo (2000) Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace. Food Chem. 68: 81-85.
    CrossRef
  31. Cha, J. Y., H. J. Kim, C. H. Chung, and Y. S. Cho (1999) Antioxidative activities and contents of polyphenolic compound of Cudrania tricuspidata. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 28: 1310-1315.
  32. Pradhan, B., S. Patra, S. R. Dash, R. Nayak, C. Behera, and M. Jena (2021). Evaluation of the anti-bacterial activity of methanolic extract of Chlorella vulgaris Beyerinck [Beijerinck] with special reference to antioxidant modulation. Futur. J. Pharm. Sci. 7: 1-11.
    CrossRef
  33. Lee S. J. (1999) Korean Folk Medicine. Korean J. Pharmacogn. 130.
  34. Sung, Y. Y., A. Y. Lee, and H. K. Kim (2014) The Gardenia jasminoides extract and its constituent, geniposide, elicit anti-allergic effects on atopic dermatitis by inhibiting histamine in vitro and in vivo. J. Ethnopharmacol. 156: 33-40.
    Pubmed CrossRef
  35. Wang, L., Z. Pi, S. Liu, Z. Liu, and F. Song (2017) Targeted metabolome profiling by dual-probe microdialysis sampling and treatment using Gardenia jasminoides for rats with type 2 diabetes. Sci. Rep. 7: 1-11.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  36. Kim, E. J., J. Y. Choi, M. R. Yu, M. Y. Kim, S. H. Lee, and B. H. Lee (2012) Total polyphenols, total flavonoid contents, and antioxidant activity of Korean natural and medicinal plants. Korean J. Food Sci. Technol. 44: 337-342.
    CrossRef
  37. Miranda, M. S., S. Sato, and J. Mancini-Filho (2001) Antioxidant activity of the microalga Chlorella vulgaris cultered on special conditions. Boll. Chim. Farm. 140: 165-168.
  38. Jena, N. R (2012) DNA damage by reactive species: Mechanisms, mutation and repair. J. Biosci. 37: 503-517.
    Pubmed CrossRef
  39. Matés, J. M., J. A. Segura, F. J. Alonso, and J. Márquez (2012) Oxidative stress in apoptosis and cancer: an update. Arch. Toxicol. 86: 1649-1665.
    Pubmed CrossRef
  40. Assunção, M. F., R. Amaral, C. B. Martins, J. D. Ferreira, S. Ressurreição, S. D. Santos, J. M. T. B. Varejão, and L. Santos (2017) Screening microalgae as potential sources of antioxidants. J. Appl. Phycol. 29: 865-877.
    CrossRef
  41. Hamouda, R. A., A. Abd El Latif, E. M. Elkaw, A. S. Alotaibi, A. M. Alenzi, and H. A. Hamza (2022) Assessment of antioxidant and anticancer activities of microgreen alga Chlorella vulgaris and Its blend with different vitamins. Molecules. 27: 1602.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  42. Ishiguro, S., D. Uppalapati, Z. Goldsmith, D. Robertson, J. Hodge, H. Holt, A. Nakashima, K. Turner, and M. Tamura (2017) Exopolysaccharides extracted from Parachlorella kessleri inhibit colon carcinoma growth in mice via stimulation of host antitumor immune responses. PloS one, 12: e0175064.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  43. Li, Y., Y. Zhang, X. Liu, M. Wang, P. Wang, J. Yang, and S. Zhang (2018) Lutein inhibits proliferation, invasion and migration of hypoxic breast cancer cells via downregulation of HES1. Int. J. Oncol. 52: 2119-2129.
    CrossRef
  44. Heo, J., D. S. Shin, K. Cho, D. H. Cho, Y. J. Lee, and H. S. Kim (2018) Indigenous microalga Parachlorella sp. JD-076 as a potential source for lutein production: Optimization of lutein productivity via regulation of light intensity and carbon source. Algal Res. 33: 1-7.
    CrossRef
  45. Bhosale, P. B., S. E. Ha, P. Vetrivel, H. H. Kim, S. M. Kim, and G. S. Kim (2020) Functions of polyphenols and its anticancer properties in biomedical research: a narrative review. Transl. Cancer Res. 9: 7619.
    Pubmed KoreaMed CrossRef