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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268
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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2023; 38(1): 1-11

Published online March 31, 2023 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2023.38.1.1

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

지난 20년 간의 고초균 포자표면발현 시스템의 현황과 생물공학적 응용

Current Status of Bacillus subtills Spore Surface Display System and Its Biotechnological Applications for Two Decades

Junehyung Kim*

Department of Chemical Engineering, Dong-A University, Busan 49236, Korea
Center for Sliver-Targeted Biomaterials, Brain Busan 21 Plus Program, Graduate School, Dong-A University, Busan 49236, Korea

Correspondence to:Tel: +82-51-200-7719, Fax: +81-51-200-7728
E-mail: june0302@dau.ac.kr

Received: December 17, 2022; Revised: February 4, 2023; Accepted: February 7, 2023

Abstract

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For the last two decades, Bacillus subtilis spore display system provided new platform for the various biotechnological applications, which overcame many obstacles of traditional bacterial surface display technology. Spore surface display needs Bacillus subtilis spore coat protein such as cotB, cotC and cotG for the anchoring of target protein. When the spore formation is completely done, mother-cell lyse, and spore is liberated to the environment. Because spore display system does not need secretory mechanism through bacterial cell wall or membrane, spore-based display technology has enhanced capability for the display of multimeric protein, large size protein, and co-factor associated protein which could disrupt cell membrane and cell wall of traditional bacterial surface display system. With spore’s nascent robustness, spore surface display technology provides enhanced thermal stability, wide pH stability, organic solvent stability and repeated usage performance in whole cell enzyme reaction. Bacillus subtilis has been Generally Regarded as Safe (GRAS) for the traditional usage in soybean fermented food in Asia. This GRAS characteristics of Bacillus subtilis and its spore has been used for the development of spore based oral vaccine against human, feedstock cattle, fish, and worms. Spore display technology is widening its application in the fields of biosensor, environment, animal nutrition supplementation. In this paper, we describe recent development and application of spore surface technology and present new perspective for the near future.

Keywords: Bacillus subtilis, spore, surface display, anchoring motif

1. INTRODUCTION

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표면발현기술 (Surface display technology)은 특정 숙주의 표면에 목적단백질을 발현시키는 기술이며, 이는 목적단백질의 표현형 (단백질 혹은 펩타이드)과 숙주의 유전형 (DNA, RNA)이 물리적으로 연결되는 의미를 지닌다.

가장 최초의 보고는 대장균에 기생하는 M13 박테리오파지를 이용한 파지 표면발현 기술이었고 [1] 파지의 경우 수용할 수 있는 단백질 크기의 한계 때문에 주로 펩타이드의 표면발현과 유세포 분석기를 이용한 연구가 많이 진행되었다. 리보솜을 이용한 표면발현 기술 [2], mRNA를 이용한 표면발현기술 [3] 등이 개발되어 주로 펩타이드 라이브러리의 선택에 사용되었다.

미생물 표면발현기술은 그람응성균인 대장균 외막단백질인 LamB를 이용해서 펩타이드를 표면발현한 최초의 보고를 필두로 [4] 다양한 그람음성균 그리고 효모를 이용한 다수의 미생물 표면발현 시스템이 개발되었다.

미생물 표면발현의 개요는 아래 Fig. 1에 간략하게 도식화되어 있다. 숙주 미생물에 적절한 발현 발현시스템 (벡터 혹은 유전체에 삽입된 형태)을 이용하여 표면발현모체의 Cterminal 혹은 N-terminal 방향으로 목적 단백질 (target protein)을 융합시키고, 세포내에서 융합단백질 (표면발현모체-목적 단백질)이 발현된 후, 융합단백질이 세포의 분비기구 (secretion mechanism)를 통해 세포막, 세포벽을 지나 분비가 되면서 표면발현모체의 작용에 의해 세포외막 혹은 세포벽에 고정되는 현상이다 (Fig. 1). 미생물 표면발현 기술은 기본적으로 발현된 융합단백질이 세포의 분비기구에 의한 분비가능한 구조이어야 하므로, 목적단백질의 분자량이 크거나, 멀티머 복합체로 활성이 있는 경우, 혹은 다양한 조효소를 함유하는 경우는 성공적인 표면발현을 장담하지 못한다.

Figure 1. Schematic illustration of bacterial surface display. Fusion protein (Anchoring motif + Target protein) is expressed, and it is transported through secretory mechanism of host bacteria. Fusion protein is anchored on the surface due to the action of anchoring motif(pale blue).

미생물 표면발현기술은 combinatorial polypeptide libraries screening [5], 표면 발현된 효소를 이용한 전세포 반응 (whole cell bioconversion) [6], 생백신 생산 (live vaccine production) [7], organophospho hydrolase의 표면 발현을 이용한 환경 정화 [8], 그리고, polyHis peptide와 중금속 흡착 단백질을 이용한 토양, 수계 환경에서의 중금속 흡착 [9] 등의 다양한 분야에서 많은 연구결과가 보고되었으나, 상기한 표면발현기구에 따른 제약과 발현 숙주의 생리적 제약으로 이를 극복할 새로운 표면발현기술이 요구되었고, 고초균 포자표면발현 기술은 그 대안이 될 수 있으리라 판단된다. 이는 고초균 포자가 가지는 열, pH 변화, 외부 스트레스 등에 대한 내생적인 안정성 및 고초균 포자형성의 특이성으로 인한 기존 미생물 표면발현시스템이 가지는 못하는 장점 때문이라 논의되고 있다.

2001 년 최초로 보고된 이후로 [10] 지금까지 100 편이 넘는 포자 표면발현 연구결과들이 보고되었다. Bacillus thuringiensis [11,12], Bacillus polyfermenticus [13], Bacillus megaterium [14], 혹은 Clostridioides difficile [15] 에서도 몇 건의 논문이 발표되었으나, 대부분의 결과는 고초균 (Bacillus subtilis)에서 보고되어서, 본 논문에서도 관련 결과는 고초균에서의 포자 표면발현으로 한정하고자 한다.

목적단백질의 성공적인 포자표면 발현을 위해서는 이를 고초균 표면에 고정화시킬수 있는 적절한 표면발현모체(anchoring motif)가 필수적이나, 이를 이용하지 않고 목적단백질과 포자표면 단백질과의 단백질-단백질 상호작용 기반의 표면발현 시스템도 보고되었다 [16,17]. 혹은 목적단백질을 포자표면에 흡착시킨 후, 공유결합을 통한 응용도 보고되었다 [18]. 시스템 구축의 간편함 등의 장점이 있을 수 있으나, 본 논문에서는 표면발현모체를 이용한 포자 표면발현 결과에 집중해서 논의하고자 한다.

2. Sporulation process of Bacillus subtilis

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탄소원, 질소원 등의 성장에 필요한 요소가 결핍되면, 고초균은 비대칭 분열 (Asymmetric cell division)을 시작하여, 서로 다른 운명을 가진 두 종류의 세포가 생성된다. 상대적으로 큰 mother cell은 작은 forespore를 내포하고, 포자형성을 도와주며, 최종적으로 분해되어 완성된 포자를 방출한다.

포자형성은 광학현미경과 전자 현미경으로 관찰할 수 있는 일련의 형태학적 단계를 통해 진행되며, 일단 시작되면 완료되기까지 약 8시간이 걸린다 (Fig. 2). 포자형성은 전사단계에서의 유전자 발현 조절의 결과이다. 200 개 이상의 유전자가 이 과정에 관여하며, 유전자 발현 조절의 중심에는 시그마 인자(σF, σE, σG, σK)가 존재하여, 이들은 서로 다른 시간에 활성화되며, 일부는 모세포나 포자에서만 활성화되며, 각각 다른 세트의 유전자를 전사하도록 RNA 중합효소를 제어한다.

Figure 2. Schematic illustration of Bacillus subtilis sporulation process. When starved, Bacillus subtilis undergoes asymmetric division to produce two cell types with different fates. The larger mother cell engulfs the smaller forespore, and then nurtures it and, eventually, lyses to release a dormant, environmentally resistant spore. (Left)
Stages of sporulation. (A) Cell in vegetative growth. (B) Once the cell commits to sporulation, σH activity increases. (C) In the next stage, an asymmetrically positioned septum divides the cell into the forespore and mother cell compartments. σ F becomes active in the forespore, and σE becomes active in the mother cell. (D) The forespore engulfs into a membrane-bound protoplast. σG becomes active in the forespore, and σK directs gene expression in the mother cell. (E) The cortex (the gray area) forms between the forespore membranes. GerE works in conjunction with σK to direct a final phase of gene expression. (F) The coat (the dark ring surrounding the gray cortex) becomes visible by electron microscopy. (G) In the final stage of sporulation, the mother cell lyses and releases the mature spore into the environment. (H) When nutrient returns to the medium, the spore can germinate, and the cell can resume vegetative growth. This involves the rehydration of the interior of the spore and cracking open of the coat. (Right)
Program of mother cell gene expression. The stages of sporulation are shown at the top of the figure, and the transcription factors that direct mother cell gene expression at each stage are shown within the mother cell compartment. Below each cell are the coat protein genes that are active at that time. The repressive functions of SpoIIID and GerE are not indicated.

고초균은 광범위한 외부환경 및 생리학적 신호를 통합하여 포자형성개시를 결정하며, 이는 주요 전사 조절 단백질인 Spo0A의 활성화로 이어진다. 포자형성에 관계하는 신호는 영양소 고갈, 세포 밀도, 크렙스 사이클, DNA 합성 및 DNA손상 등이 포함된다.

이러한 신호들은 단백질들의 인산화전달 (phosphorelay)을 통해, 2성분 조절 시스템이 순차적 활성화되고, 최종적으로 response regulator 인 Spo0A의 인산화로 통합된다. Spo0A~P는 몇 가지 주요 포자형성 유전자와 오페론의 발현을 유도하고 비대칭 세포분열을 가져온다.

비대칭 격막 (polar septum)의 형성은 포자형성에서 획기적인 사건이며 forespore에서 σF의 활성화에 직접적으로 기여한다. 그 후, 포자는 σF가 모세포에서 σE의 출현을 촉발하고, σE는 모세포에 의한 포자의 만입과 함께 작은 forespore에서 σG의 출현을 유발하며, 최종적으로 mother cell에서의 σK의출현을 일으키는 순차적인 조절 패턴을 따른다 [19]. 결국 약 6~8시간의 포자형성이 완료되면 완전히 형성된 포자는 mother cell의 분해 후, 외부환경으로 방출된다.

쉽게 표현하면, 주로 mother cell에서 활성화된 시그마 인자인 σE와 σK에 의해 전사된 다양한 포자 코트단백질들이 forespore에 순차적으로 적층되면서 최종적으로 포자를 형성하게 되고, 이런 포자형성 단백질들은 다양한 상호작용과 결합으로 포자의 안정성에 기여하게 된다. 포자 표면발현기술은 포자형성에 필요한 다양한 포자 코트단백질들을 표면발현모체로 하고, 여기에 N-terminal 혹은 C-terminal에 융합발현된 목적단백질을 포자형성층에 위치시키는 방법이다.

3. Major Anchoring Motives in Spore Surface Display System

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표면발현모체 (Anchoring Motif)는 목적단백질의 N-terminal 혹은 C-terminal에 융합발현되어, 목적단백질을 원하는 숙주세포의 최외각에 고정되도록 유도하는 단백질이다. 일반적인 미생물 표면발현에서는 대개 숙주세포의 outer membrane protein 등이 많이 이용되었고, 포자 표면발현에서는 아래에서 상술하듯이 포자 형성단백질들이 주로 사용된다.

가장 먼저 이용된 포자 표면발현모체는 tetanus toxin(TTFC)를 표면발현하기 위해서 cotB가 사용되었다 [10]. 이후 cotB는 다양한 목적단백질을 포자 표면발현하기 사용되어 현재까지 20 편 이상의 논문에 보고되었다. cotB는 serine이 풍부한 친수성의 단백질이며, 46 kDa의 크기로 발현된 후, homo-dimer의 형성으로 66 kDa의 크기로 관측된다. 이 과정에는 cotG 와 cotH 가 관여하는 것으로 알려져 있다 [20]. cotB는 포자형성과정에서 cotC 및 cotG를 비롯한 다양한 포자형성 단백질과 상호작용을 하는 것으로 보고된다 [21].

두 번째로는 cotC가 tetanus toxin (TTFC)과 B subunit of the heat-labile toxin of Escherichia coli (LTB) 발현을 위해 보고된 이후 20편 이상의 논문에 보고되었다. cotC는 유전자 서열 상으로는 118개의 아미노산으로 구성된 단백질이지만, 발현 후 12 ~ 30 kDa의 다양한 크기를 가지는 것으로 보고되었고, 이 역시 다양한 멀티머 단백질 형성에 기인하는 것으로 이해된다.

Table 1 Vaccine development using spore surface display system

Anchoring MotifTarget ProteinReference
CotBTetanus toxin (TTFC)[10]
CotCTetanus toxin (TTFC), heat-labile toxin[38]
cotBTetanus toxin (TTFC)[39]
CotCClonorchis sinensis TP20.8[42]
cotB, cotCAnthrax protective antigen[41]
cotCSchistosoma japonicum 26 KDa GST protein[47]
cotCBombyx mori nucleopolyhedrovirus GP64[54]
CotB, CotC, CotG, CotZClostridium difficile protein FliD[27]
CotCWhite Spot Syndrome Virus Vp26[57]
CotBWhite Spot Syndrome Virus VP28 antigen[49]
CotBM2e of influenza A viruses[40]
cotCClonorchis sinensis enolase[43]
CotCHelicobacter pylori urease B[48]
CotCClonorchis sinensis cysteine p rotease[44]
CotCClonorchis sinensis paramyosin[45]
CotCOmpC of Salmonella serovar Pullorum[55]
CotBAntigen Protein VP8[50]
cotCStreptococcus agalactiae surface immunogenic protein[56]
CotB,CotCGrass carp reovirus (GCRV) antigen Vp7[53]
CotCClonorchis sinensis serpin3[58]
CotBFeline Enteric Coronavirus Spike Protein[52]
cotBPorcine circovirus type 2 antigen protein cap[51]


Streptavidin 표면발현을 위해 cotG가 발현모체로 이용되었으며, 이 후 역시 20편 이상의 논문에 보고되었다. CotG는 195개의 아미노산으로 구성된 매우 강한 양전하를 가지는 단백질이다. mother cell에서 σK에 의해 전사되며, 많은 양이 발현되어, 포자 외부층 (outer coat layer)를 형성하며, cotB를 비롯한 다른 포자형성 단백질과 다양한 결합을 하는 것으로 알려져 있다 [22].

cotE는 2013년 최초로 보고되었으며 [23], 이후 tyrosinase 발현 [24,25], cotA laccase [26] 등의 발현에 이용되었다.

cotV, cotW, cotX는 동일한 오페론에서 (cotVWX)에서 발현되며, cotY, cotZ 또한 동일한 오페론에서 (cotYZ) 발현된다. 이들 유전자는 고초균 유전자에서 바로 옆에 위치하고 있으며, 고초균 포자의 최외각 구조물 (Crust)에 필요한 단백질을 발현시키는 것으로 알려져 있다.

cotZ는 Clostridium difficile protein FliD 발현에 이용된 이후 [27,28], urease subunit of Helicobacter acinonychis [29], Helicobacter pylori CagA protein (cytotoxic-associated gene A) [30], Escherichia coli alkaline phosphatase [31], d-Psicose 3-Epimerase [32], GFP [33], lipase B of Bacillus subtilis [34]의 표면발현에 이용되었다.

cotX는 β-Galactosidase [35] 표면발현이 보고된 이후, GFP [33], sucrose isomerase [36] 발현에 이용되었다.

cotY는 GFP [33], cotA laccase [26], lipase B of Bacillus subtilis [34] 발현에 이용되었다.

나머지 cotV와 cotW는 오직 GFP [33] 발현에 응용된 결과만이 보고되었다.

이외에는 β-glucuronidase와 phytase를 발현하기 위한 oxdD [37], cgeA를 이용한 Helicobacter pylori CagA protein (cytotoxicassociated gene A) [30], cgeA를 이용한 GFP 발현 [33] 등이 있으나, 이들 발현모체를 이용한 추가적인 응용은 보고되지 않았다.

상기 서술된 모든 표면발현 모체는 당연하게도 포자형성과정 중 mother cell 쪽에서 적절한 시그마 인자와 전사조절 인자의 작용에 의해 발현되어, 목적단백질과 융합발현되어 포자형성층으로 함께 이동된다.

4. Application Fields of Bacillus Subtilis Surface Display System

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지금까지 발표된 논문을 분석하면, 가장 많이 이용된 분야는 백신개발, 효소반응 분야이며, 이외에는 발현시스템 개발, 바이오센서, 환경 분야 응용 등으로 크게 분류할 수 있다.

4.1. Vaccine Developments

고초균 포자는 경구용 백신으로 활용하는데 있어서는 상당한 장점을 지니고 있다. 먼저 고초균은 오래전부터 아시아 지역에서 콩을 비롯한 식품발효에 사용되어 왔고, 음식물에 포함되어 식용으로 사용되어도 별 문제가 없는 GRAS (Generally Regarded As Safe) 균주로 인정되고 있다. 또한, 경구용 백신의 주된 작용기작인 위장관에서의 점막면역반응을 나타내기 위해서는 강산성인 위산에 영향을 받지 않아야 하는데, 고초균의 포자는 여기에 대해 강한 저항성을 가질 수 있다. 마지막으로, 항원이 발현된 고초균 포자인 경우, 보관, 수송 조건에서 기존 주사제형 백신과는 달리 냉장보관 시스템(cold chain system)에 대한 의존성이 낮기 때문에, 관련 인프라 구축이 미흡한 저개발국 혹은 낙후지역에서도 효과적인 대안으로 인정될 수 있다.

포자표면발현을 이용한 최초의 보고도 파상풍 [10,38,39]에 대한 백신 개발이었고, 이후 인플루엔자 [40], 탄저병 [41], 장염 [27] , 간흡충증 [42-46] , 주혈흡충 [47], 헬리코박터 위염 [48] 등에 대한 적절한 항원을 포자표면발현한 연구가 보고되었으며, 대부분의 연구결과는 마우스 모델을 사용하여, IgG, IgA의 증가를 보여주었다.

축산, 수산업의 경우, 주사에 의한 백신투여에 따른 인건비가 관련 산업의 경제성과 밀접한 상관관계를 가지기 때문에, 포자를 이용한 경구투여용 백신의 개발은 추가적인 의미를 가진다고 평가할 수 있다. 동물을 대상으로는 흰다리새우의 흰 반점 증후군 [49] 에 대한 최초의 보고 이후, 돼지의 급성바이러스 위장염 [50], 돼지열병 [51] , 고양이 호흡기 질환 [52], 물고기 레오바이러스 질환 [53], 누에나방 바이러스 [54], 병아리 추백리병 [55], 물고기 연쇄상구균 감염 [56] 등에 대한 경구백신 개발이 보고되었다.

Table 2 Enzymatic reaction using spore surface display system

Anchoring MotifTarget ProteinRelated CharacteristicsReference
SolventpHHeatReusability
CotGβ-Galactosidase○○[65]
CotGω-transaminase[71]
CotGN-Acetyl-D-Neuraminic Acid Aldolase○○[59]
CotCBombyx mori Alcohol Dehydrogenases○○[60]
CotGNanA○[68]
CotCβ-galactosidase○[69]
CotBThermophilic lipase Tm1350○○[61]
CotBEsterase from Clostridium thermocellum○○[66]
CotGClostridium thermocellum Nitrilase○○[67]
CotETyrosinase[24]
CotGGlucose 1-dehydrogenase○○[62]
CotXβ-Galactosidase○○[35]
CotZd -Psicose 3-Epimerase○[32]
CotGClostridium thermocellum cohesin[72]
CotGL-arabinose isomerase○[70]
CotG, CotCTrehalose synthase[73]
CotGOrganophosphorus-degrading enzymes○○○○[63]
CotBAcidovorax facilis 72W Nitrilase○○○[64]
CotXSucrose isomerase○[36]


4.2. Enzyme reaction

일반적인 미생물 표면발현에 비해, 고초균 포자가 가지는 내재적인 강인함, 열, pH에 대한 안정성 등이 고정화 효소의 담체로서 상당한 장점을 가지고 있기 때문에, 관련 주제로 20편 이상의 논문들이 발표되었다. cotG가 표면발현모체로서 가장 많이 이용되었으며, 많은 논문에서 포자표면발현의 특성인 넓은 pH 조건에서의 활성 [59-64], 향상된 열안정성 [4,35,36,60,62-66], 유기용매에 대한 안정성 [63-65,67], 효소 재사용에 대한 편의성 [32,59,61,63,66-70] 등을 보고하였다.

특이한 응용으로는 lactose와 octanol을 이용하여 octyl-β-D-galactopyranoside를 합성하기 위해서 물/유기용매 이상계 반응시스템이 고안되었고, 이를 위해서 포자 표면발현된 β-galactosidase가 이용되었다. 특히 β-galactosidase가 표면발현된 포자는 물/유기용매 경계에 위치하여 목적반응을 매우 효율적으로 진행하였다. 또한 n-Hexane, Ethyl ether, Toluene, Ethyl acetate, Acetonitrile 등의 유기용매에 대해서도 고정화 되지 않는 효소보다 안정성이 더 증가한 것을 보고하였다 [65]. 관련 유기용매 반응, 이상계 반응에서 다양한 응용이 가능할 것이라 예상된다.

N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) 로부터 다양한 생리활성효능을 가지는 N-acetyl-D-neuraminic acid (Neu5Ac)를 합성하기 위해서는 중간체인 N-acetyl-D-mannosamine (ManNAc)를 거쳐야 하는데, 중간체 합성을 위한 첫 번째 단계는 염기성 조건에서 alkaline epimerization 과정을 수행하는 것이 바람직하나, 2 번째 단계의 반응 효소인 Neu5Ac aldolase 가 염기성 조건에서 빨리 불활성화되므로, GlcNAc 2-epimerase를 사용하여 반응 중간체를 합성하였다. 포자 표면발현된 Neu5Ac aldolase는 염기성 반응조건 (pH 10) 에서도 충분한 활성을 보여, epimerase 사용 없이 aldolase 만을 사용하는 훨씬 간편한 chemoenzymatic 반응을 통해 53.9 g/liter의 Nacetyl-D-neuraminic acid (Neu5Ac)를 합성할 수 있었다 [59]. 고포균 포자에 의해 부여되는 표면발현된 단백질이 가지는 넓은 pH 영역에서의 안정화 효과는 다양한 효소반응 및 chemoenzymatic 반응에서 반응시스템의 단순화를 통해 다양한 응용이 가능하리라 예상된다.

Table 3 System development and other applications of spore surface display system

Anchoring MotifTarget ProteinApplicationReference
cotGStreptavidinBiosensor[74]
cotGGFPuvBiosensor[78]
CotB, CotC, CotGUreA of Helicobacter acinonychisAnchoring motif[82]
cotACotADirected evolution[83]
oxdDPhytase, β-glucuronidaseAnchoring motif[37]
CotB18-His peptideMetal adsorption[80]
phytaseAnimal feedstuff[13]
CotCHAS (Human Serum Albumin)Protein delivery tool[84]
cotE, cotGbeta-galactosidaseAnchoring motif[23]
CotCHuman ProinsulinProtein delivery tool[85]
CotZurease subunit of Helicobacter acinonychisAnchoring motif[29]
CotZ, CgeAHelicobacter pylori cagAAnchoring motif[30]
cotCHuman Growth HormoneProtein delivery tool[86]
CotB, CotC, CotGα-amylasePromoter development[49]
CotB, CotZEscherichia coli alkaline phosphatase PhoAExpression system[31]
cotACotA LaccaseDirected evolution[87]
CotBT.maritima lipase Tm1350Linker development[75]
CotGThermotoga maritima MSB8 nitrilaseLinker development[76]
CotB, CotC, CotG, CotZFliDAnchoring motif[28]
CotGB. pumilus chitinasepotential biopesticide[88]
CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, CgeAGFPAnchoring motif[33]
CotGEscherichia coli PhytaseAnimal feedstuff[89]
Cot ETyrosinaseBiosensor[25]
cotGHaloalkane Dehalogenase DhaAEnvironmental usage[81]
cotE, cotG, cotYCotA laccaseEnvironmental usage[26]
CotB, cotCSA-eGFPBiosensor[79]
cotCQuintuple glucagon-like peptide 1 (28-36) nonapeptideProtein delivery tool[79]
cohesin dockerin interactionβ-galactosidaseAnchoring motif[90]
CotY, CotZTIEDPromoter development[34]
CotGp75 ProteinProbiotics, Transcriptome analysis[91]


4.3. Spore surface display system development, Biosensor, Environmental applications

4.3.1. 발현시스템 개발

융합단백질 발현에 필요한 벡터에 대해서는 기존 고초균에서 사용되는 벡터, 대장균/고초균 셔틀 벡터 등을 사용하고 있고, 이미 고전적인 외래단백질 발현에서 많이 연구가 되어본 리뷰에서는 상술하지 않기로 한다. 내용을 좁혀 고초균포자표면발현 시스템에서 핵심적으로 개발되어야 할 부분은 발현모체, 효율적인 링커, 프로모터 시스템 등이라 할 수있다.

이중 발현모체에 관한 부분은 포자표면발현을 위해서 초기에 개발된 발현모체는 cotB [10], cotC [38], cotG [74] 정도였으며, 지금도 다양한 응용에서 위 세 가지 발현모체가 가장 많이 사용되고 있다. 하지만, 이 후에도 oxdD [37], cotE [23], cotZ [29], cotV, cotW, cotX, cotY [33] 등의 다양한 발현모체가 개발되고 있다.

융합단백질 (발현모체-목적단백질)의 효과적인 활성을 위해서는 대개 발현모체와 목적단백질 사이에 특별한 단백질 2차 구조를 가지지 않는 GGGGS (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 등의 작고 유연한 (flexible) 링커를 삽입하는 것이 일반적이다 [74]. 때로는 아주 강한 a-helix 구조를 형성하는 EAAAK를 포함하는 GGGEAAAKGGG 링커가 효율적이라는 보고도 있다 [29].

위에 제시된 특별한 단백질 2차 구조를 가지지 않는 GGGGS 링커와 강한 a-helix 구조를 형성하는 EAAAK 조합을 이용하여 최대 아미노산 30개 길이까지의 다양한 링커를 만들고 이러한 링커의 길이와 방향에 따라, 목적 단백질인 Thermotoga maritima의 lipase Tm1350 활성, 열안정성 등이 증가되었다는 보고가 있다 [75]. 또한, 동일한 연구의 연장선으로 Thermotoga maritima MSB8 Nitrilase에 대해서도 비슷한 링커의 조합이 표면발현된 목적단백질의 활성, 열안정성, pH 안정성 등에 영향을 미친다는 보고도 있다 [76]. 링커의 특성 (유연함, 강한 a-helix 구조)도 아직까지는 완결된 연구가 아니라, 각 발현모체와 목적단백질의 관계와 물리적 상호작용에 따라, 개별적으로 고려되어야 할 사항이라 생각된다.

대부분의 포자 표면발현은 고초균의 포자형성과정과 연동되어 포자형성층에 융합단백질이 위치해야 하기 때문에, 발현은 발현모체 단백질의 자체 프로모터를 사용하는 경우가 대부분이다. 이 경우 융합단백질의 발현이 포자형성과정에 따라 자동적으로 제어되는 장점은 있지만, 발현양의 정도, 시기를 조절하기는 불가능하다. 이를 보완하기 위해, IPTG로 유도가능한 프로모터를 사용하여, 목적단백질의 발현시기와 발현양을 조절하였다는 보고도 있다 [77]. 강력한 T7 RNA polymerase 기반의 포자표면 발현시스템을 이용하여, 목적단백질의 과발현을 유도한 경우도 보고되었다 [34].

4.3.2. 바이오센서

초기 포자표면발현의 바이오센서 관련 응용을 제시한 논문은 cotG를 발현모체로 하여 streptavidin과 GFPuv를 표면발현 시킨 논문이 있다 [74,78] streptavidin과 GFPuv의 표면발현과 Lateral flow immunoassays (LFIs)를 이용한 응용에서 목적단백질의 측정 감도를 10-15 mol까지 낮출 수 있었다 [79].

cotE를 이용한 tyrosinase 가 표면발현된 포자를 paper chip 형태의 센서로 제조하여, 이를 이용하여 정상인, 신부전증, 당뇨병, 신부전증-당뇨 환자의 소변속에 포함된 tyrosine의 함량을 가시적으로 빠르게 판별할 수 있었다. 이러한 응용은 병원 시스템의 접근성이 제한된 저개발국 아동을 대상으로한 타이로신혈증 (Tyrosinemia)의 조기진단에 기여할 것이라 기대된다 [25].

4.3.3. 환경분야 응용

포자표면발현의 환경분야 응용은 크게 2 가지 분야로 논의되고 있다. 중금속 흡착 모티프 혹은 중금속 흡착 단백질을 이용한 토양 혹은 수계에 방출된 중금속을 흡착하거나 [80] 2,2′-dichlorethyl sulfide와 같은 할로겐 화합물들은 살충제, 제초제, 생물학적 무기로 사용되며, 이를 분해하기 위해서는 Haloalkane dehalogenases 등의 효소가 필요하다. Rhodococcus rhodochrous 유래의 DhaA는 할로겐 화합물들의 분해에 효과적이지만, 효소의 낮은 안정성, 분리정제에 따른 비용등으로 인해 직접적인 응용이 힘들었는데, 포자 표면발현시스템을 활용하여 효율적으로 할로겐 화합물을 분해할 수 있었다 [81]. 의류산업에서 방출되는 합성염료는 일반적인 효소로는 분해되기 어렵다. 안트라퀴논 계열의 acid green 25 염료를 고초균 유래의 CotA laccase를 표면발현하여, 효과적으로 분해할 수 있었다 [26].

4.3.4. 기타 포자표면발현 시스템의 흥미로운 응용사례

식용으로 사용되어도 별 문제가 없는 GRAS (Generally Regarded As Safe) 균주로서의 고초균의 특성은 경구용 백신 이외에도 동물 사료용 제재로도 많이 연구되고 있다. oxdD 혹은 cotG를 발현모체로 이용하여, 단위성 동물의 영양학적 개선에 필요한 phytase를 성공적으로 발현시켰다. [37,89]

또다른 사례로는 고초균 포자표면발현 시스템을 프로바이오틱스 및 항생제로 개발한 사레가 있다. [92] Lactobacillus rhamnosus에서 유래한 peptidoglycan hydrolase (PGH)를 가지는 것으로 추정되는 p75를 포자표면발현하여, Listeria monocytogenes에 대한 항생제 효과를 가지는 것으로 보고하였다. 또한, p75가 표면발현된 포자 자극에 대한 인간유래 HT-29 세포의 전사체 분석을 통하여, 과발현된 유전자의 상호작용을 연구하였다 [91].

하나의 특이한 응용사례로는 목적단백질이 발현된 포자의 경구투여를 통해, 목적단백질의 전달매체로 사용한 경우가 보고되어 있다. cotC를 발현모체로 하여 Human serum albumin (HSA)을 포자 표면에 발현하고, 이를 실험용 ICR mice에 1 달 동안 매일 1010개의 포자를 경구투여한 후, 혈장 내의 Human serum albumin (HSA) 함량이 유의미하게 증가한 것을 보고하였다 [84]. 논문에 따르면, 1 달 투여 후 ICR mice 혈장에서 HSA 함량 3 ~ 4 g/L의 증가가 있었고 이는 위장관 소화과정에서 고초균 포자가 유실되지 않는 강인한 특성이 목적단백질의 전달에 도움을 주었다고 해석하고 있다. 한 가지 의문점은 저자들이 측정한 1010 개의 포자에서 발현된 HSA 함량은 0.23 ± 0.09 μg이고, 30일 동안 경구투여된 양은 모든 포자발현된 HSA 가 ICR mice 혈장에 전달되었더라도 6.9 μg 정도이기 때문에, 이는 ICR mice 혈장 내 HSA 증가를 설명하기에는 너무 부족한 수치이다. 전달된 HSA가 항원에 따른 항체 반응이 아니기 때문에, 본 결과를 이해하기에는 정량적인 부분에서 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다. 동일한 연구그룹에서 비슷한 시스템으로 Human Proinsulin [85], Human Growth Hormone [86], glucagon-like peptide 1 (28–36) [93] 등의 목적단백질의 전달에 대한 비슷한 연구결과를 보고하고 있다.

5. CONCLUSIONS

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2001년 최초의 보고 이후, 다양한 연구그룹에 의해 cotB, cotC, cotG를 필두로 한 몇 가지의 표면발현모체가 보고되었고, 연구그룹의 선호도에 따라 표면발현모체는 선택적으로 사용되는 것으로 파악되고 있다. 일반적인 미생물 표면발현의 경우와 마찬가지로, 목적단백질을 포자 표면발현하기 위한 최적의 표면발현모체가 존재하는가에 대한 문제에 대한 완벽한 답은 어렵다고 생각된다.

기본적으로 표면발현은 융합단백질 (표면발현모체-목적단백질)의 활성에 관한 문제이기 때문에 아직까지는 여기에 대해 완전히 예측가능한 프로토콜이 존재하지 않는다. 표면발현모체와 연결된 목적단백질의 활성을 증가시키기 위해 -GGGGS- 와 같은 유연한 펩타이드 모티프 (flexible linker sequence)를 표면발현모체와 목적단백질의 사이에 삽입하는 경우도 많지만, [29,74], 아직 100% 예측가능한 결과를 제공하지는 않는다. 더구나, 발현된 융합단백질 (표면발현모체-목적단백질)이 자유롭게 수용액 속에서 존재하는 것이 아니라, 여러 층으로 구성된 고초균의 포자 단백질 사이에 존재해야 하고, cotB, cotC, cotG를 비롯한 대부분의 포자형성 단백질은 다른 포자형성 단백질들과 물리, 화학적 결합을 하는 것으로 알려져 있다 [22]. 이러한 전체적인 과정에서 발현된 융합단백질 (표면발현모체-목적단백질)이 활성을 가진다는 것은 단순히 표면발현모체의 선택으로는 해결되지는 않는다. 추가적인 연구를 통해 견고하고 일반적으로 사용할 수 있는 표면발현모체 개발이 기대된다.

특히, 본 리뷰는 고초균 포자의 물리적인 강인함에 중점을 둔 연구를 중심으로 작성되었으나, 사실 고초균 포자가 가지는 근원적인 생리학적인 특성, 즉 목적단백질의 포자표면 발현을 위해서 세포막이나, 세포벽을 통한 분비기구가 필요하지 않는다는 점에서 기존의 미생물 표면발현에서는 불가능한 단백질의 표면발현에 최적화된 시스템이라 할 수 있다. 과발현되었을 때 세포 성장을 방해하거나, 세포에 독성을 가지는 단백질 [74], 멀티머로 존재하거나, 조효소를 포함하는 단백질 [71] 단백질이 커서 세포의 일반적인 분비기구를 통해 분비되기 어려운 단백질 [23] 등이 특히 일반적인 미생물 표면발현시스템에 비교하여, 고초균 포자 표면 발현 시스템이 장점이라고 말할 수 있다.

물론 일반적인 미생물 표면발현시스템에서도 멀티머 단백질이 표면발현되어 활성을 가지는 경우가 있으나, 이는 유동적인 세포막에서의 목적단백질이 멀티머로 4 차구조를 형성한 것으로 보이며, 목적단백질의 배향 (orientation) 등에 영향을 받을 것이라 생각되고, 관련 분야에서 좀 더 정확한 연구가 필요한 부분이다.

이러한 포자 표면발현만이 가지는 장점에 대해서 기존의 미생물 표면발현과의 차이점을 부각할 수 있는 추가적인 연구가 계속 진행되기를 바라며, 고초균 포자를 실제 산업현장에 응용하거나, 실증적 경구용 백신개발에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다.

Acknowledgements

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This research was supported by a grant (NRF-2017R1D1A1B0503572614) of the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education, Republic of Korea.

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