아미노산은 자연계에 무수히 많이 존재하지만 세포 내에서단백질을 구성하는 아미노산은 20 종류가 있다. 20 개의 천연 아미노산이 단량체가 되어 단백질을 형성하기 때문에 이들은 functional group의 범위가 정해져 있다. 천연 아미노산 외에 화학적으로 합성되어 번역 과정동안 사용되는 아미노산이 존재하는데 이를 비천연 아미노산 (non-canonical amino acid)이라고 한다. 비천연 아미노산을 단백질에 도입하면 새로운 functional group을 생성할 수 있다 [1]. 최근에는 이렇게 세포 내에서 특정한 작용기를 가지고 있는 비천연 아미노산을 genetic code expansion 기술을 이용하여 단백질에 결합시켜 기능성과 생체 안정성이 증가된 재조합 단백질을 생산하는 기술이 개발이 되고 있다. 또한, 비천연 아미노산이 도입된 재조합 단백질을 생산하여 단백질의 구조나 기능의 변화를 관찰할 수 있고 다양한 목적으로 단백질을 이해 및 진화시키는 연구도 사용될 수 있다 [2].

일반적으로 아미노산들이 결합하여 단백질을 합성하는 과정에는 원하는 아미노산을 지정하는 codon과 codon이 지정하는 아미노산, 이와 상보적인 anticodon을 가지며 mRNA에 결합하는 tRNA가 사용되며 이때 tRNA와 아미노산을 연결하는 aminoacyl tRNA synthetase (aaRS)가 필요하다 [3,4]. 앞서 언급한 바와 같이 비천연 아미노산은 화학적으로 합성되기 때문에 비천연 아미노산을 지정하는 codon은 자연계에 존재하지 않는다 [1]. 따라서 비천연 아미노산을 단백질에 도입하기 위해선 orthogonal한 tRNA와 비천연 아미노산과 tRNA를 결합시켜 줄 수 있는 orthogonal aaRS가 필요하다 [5,6]. 지금까지 여러 aaRS가 개발되었지만, 다양한 비천연 아미노산의 도입과 단백질내의 비천연 아미노산의 도입 수율 향상을 위하여 지속적인 연구가 진행되고 있다 [7].

비천연 아미노산들 중에서 para-azido-L-phenylalanine (AzF)는 alkyne group과 연결되어 click chemistry에 핵심적으로 기능하는 azide를 functional group으로 갖고 있어서 다양한 목적으로 단백질에 도입되고 있다. 최근, AzF의 단백질 도입 효율이 증대된 돌연변이 aaRS 들이 보고되었다 [8]. 이전의 연구에서는 얻어진 각각의 돌연변이 aaRS의 AzF의 도입 수율을 비교하였지만, 각각의 돌연변이들이 조합이 될 경우 AzF의 도입 수율에 대한 영향과 structural modeling에 대한 연구는 이루어지지 않았다. 이에 본 연구에서는 AzF를 도입할 수 있는 기존에 보고된 여러 aaRS들로부터 돌연변이 위치를 확인하고 이들 돌연변이들을 조합한 새로운 aaRS 들을 제작하여 조합에 따른 AzF의 도입효율과 selectivity를 측정하였다. 또한 얻어진 실험 결과를 해석하기 위하여 AzF와 aaRS와의 docking simulation을 수행하였다.

2.1. 균주, plasmid 및 배양 조건

본 연구에서는 선행 연구에서 AzF의 첨가 유무에 따라 7 배이상의 형광 값 차이를 보이며, 가장 높은 amber suppression을 보인 숙주로 판명된 [9] Escherichia coli DH10B [F– mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara- leu)7697 galU galK λ– rpsL (StrR) nupG] (Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 숙주로 사용했다.

10 g/L NaCL, 5 g/L tryptone, 10 g/L yeast extract의 조성을 가지는 Luria-Bertani (LB) 배지에 항생제를 첨가하여 (50 mg/L gentamicin (Thermofisher, Waltham, MA), 50 mg/L chloramphenicol (Sigma-Aldrich)) 균주 배양에 사용하였다. 형광 단백질에 결합하는 비천연 아미노산으로는 para-azido-L-phenylalanine (AzF, Sigma-Aldrich, Burlington, MA)을 사용하였다.

형광 단백질과 비천연 아미노산의 결합을 위해서 변형된 tRNA synthetase와 tRNACUA 유전자가 포함된 플라스미드인 pEVOL-pAzF (Addgene, Watertown, MA)와 이로부터 유래한 pEVOL-pAzF-C1-K776을 사용하였다 [10].

단백질 내의 AzF의 도입 유무를 확인하기 위하여 형광 단백질 (super-fold green fluorescence protein)의 204 번째 아미노산 위치에 amber codon이 삽입된 sfGFP204amb 를 가지고 있는 pSEVA631pt-sfGFP204amb를 사용하였다 [11].

2.2. Site-directed mutagenesis

기존에 보고된 AzF의 도입 효율이 증가된 돌연변이 aaRS들은 pEVOL-pAzF에서 유래한 aaRS (K776, M320, K801)에서 여러 위치의 돌연변이가 확인되었다 [8]. 따라서 확인된 돌연변이들을 조합하여 새로운 돌연변이 aaRS를 제작하기 위하여 Met178Thr, Phe248Leu, Lys256Glu 을 위한 primer를 제작하고 (Table 1), pEVOL-pAzF-C1-K776을 각각 site directed mutagenesis하였다. Site directed mutagenesis는 10 ng의 pEVOL-pAzF-C1-K776을 template로 하여, PhusionTM Plus DNA Polymerase (Thermofisher, Waltham, MA) 0.5 mL, forward와 reverse primer 각 2 mL, dNTP mix 1 mL, 5X Phusion™ Plus Buffer 10 mL을 포함한 50 mL의 PCR mixture를 제작하여 진행하였다. PCR 진행 조건은 98°C에서 30 s(denaturation), 55°C에서 10 s (annealing), 72°C에서 2 m 30 s(elongation)로 설정 후, 25 cycles 진행하였다. 이후 E. coli DH10B(pSEVA631pt-sfGFP 204amb) competent cell에 pEVOL-pAzF-C1-K776 mutants를 형질전환 (2.5 kV, 200 Ω, 25 μF, Biorad, Hercules, CA, USA)하였다.

Table 1 Sequences of primers used for site-directed mutagenesis. The nucleotide changes are underlined

Target site	Sequence of Primers
M178T	Forward 5’-CGCAAAATTCACACGCTGG-3’
	Reverse 5’-TTGCTCCATACCACCGAC-3'
F248L	Forward 5’-CCAAGTATTTACTGGAATACCCAC-3’
	Reverse 5’-CGATTTCCATGATCGGGTTAC-3’
K256E	Forward 5’-CCCGGAGAAATTTGGCGG-3’
	Reverse 5’-CGCTCAATCGTCGGTGGGTATTC-3’

이후 특정 site가 각각 변경한 균주의 선별을 위해 50 mg/L gentamicin과 50 mg/L chloramphenicol 이 첨가된 LB Agar 배지에 18시간동안 배양하였고 성장한 colony들 중에서 염기서열을 분석하여 원하는 위치에서만 돌연변이가 이루어졌는지 확인하였다. 확인된 돌연변이들을 이 후 실험에 사용하였다.

2.3. 세포 농도와 형광 단백질의 발현 측정

형광 단백질의 원활한 발현을 위하여 0.2% Arabinose와 0.5 mM AzF를 배양액에 첨가하였고 37°C, 250 rpm에서 18 시간 동안 배양하였다. 재조합 대장균에서 aaRS의 amber-suppresion 활성 여부는 AzF의 첨가에 따른 형광 단백질의 발현 여부로 확인하였다 [11]. 배양이 완료된 대장균들의 형광 단백질 발현 유무와 세포 농도의 정량적인 측정은 마이크로 플레이트 리더 (SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, San José, CA, USA)를 이용하여 확인하였다. 세포농도는 600 nm에서의 흡광도 (OD600)로 측정하였고, 형광단백질의 발현량은 485 nm에서의 excitation 파장 값과 535 nm에서의 emission 파장 값으로 측정하였다 [12,13]. 단위 세포 당 형광 단백질 발현량은 형광 단백질 발현량 (fluorescence intensity)을 흡광도 (OD600)로 나눈 값 (specific fluorescence intensity)으로 확인하였고, AzF positive의 specific fluorescence를 AzF negative의 specific fluorescence로 나눠 얻은 값을 selectivity 로 정하였다. pEVOL-pAzF에서 유래한 aaRS (K776)의 selectivity에 대한 돌연변이 aaRS의 selectivity 값을 relative selectivity로 나타내었다.

2.4. Amino-acyl tRNA synthetase modeling 과 docking

Amino-acyl tRNA synthetase는 homology-modeling을 이용하는 swiss-model (www.swissmodel.expasy.org)에서 단백질 서열을 입력하였을 때, 가장 유사한 상동성을 가지는 Methanocaldococcus jannaschii 유래 Tyrosyl-tRNA synthetase (1J1U)를 template로 하여 modeling하였다. AMdock [14]의 Autodock Vina [15]를 이용하여 aaRS, aaRS mutant와 AzF의 docking을 예측하고, 이를 통하여 mutation이 aaRS의 AzF 도입에 영향을 주는 원인을 확인하기 위한 단백질 구조 분석을 진행하였다.

3.1. 돌연변이 aaRS 제작 및 활성 비교

이전의 연구 결과로부터 pEVOL-pAzF에 클로닝되어 있는 aaRS에서 유래한 돌연변이 중에서 K776이 가장 높은 AzF의 결합능 증가를 보였다 [8]. 돌연변이 pEVOL-pAzF-C1-K776 는 253번의 Leu이 Pro으로 변환된 것이 확인되어졌다 [8]. 이외에도 여러 돌연변이 aaRS에서 AzF의 결합능 증가가 확인되어 졌는데, 이 들 중에서 M178T, F248L, K256E의 아미노산 변환이 확인되었다. 이에 본 연구에서는 Leu253Pro 으로 변환된 pEVOL-pAzF-C1-K776에서 각각 178, 248, 256 번의 아미노산이 변환된 돌연변이들을 site-directed mutagenesis를 이용하여 제작하였다. 얻어진 돌연변이는 염기서열을 확인하여 이 후 실험을 진행하였다.

얻어진 돌연변이를 각각 pEVOL-pAzF-C1-K776-M178T, pEVOL-pAzF-C1-K776-F248L, pEVOL-pAzF-C1-K776-K256E로 명명하고, pSEVA631pt-sfGFP204amb을 포함하는 대장균에 각각 형질전환하여 specific fluorescence intensity와 selectivity를 측정하였다. M178T, F248L 돌연변이 aaRS의 경우 각각 control 대비 1.36, 1.19배의 증가된 specific fluorescence intensity를 보였다 (Fig. 1). 하지만, K256E의 경우에는 control 대비 0.45배로 감소한 specific fluorescence intensity를 보였다 (Fig. 1). AzF 선택적 결합성을 나타내는 selectivity의 경우에는 control인 K776의 경우 2.79의 값을 보였으나, M178T, F248L, K256E의 경우에는 각각 1.88, 1.93, 그리고 1.62의 값으로 control 대비 감소한 값을 나타내었다 (Fig. 1). 이러한 결과로부터 기존에 보고된 aaRS K776에 M178T, F248L의 아미노산을 치환할 경우 aaRS의 amber suppression intensity는 증가하였으나, selectivity는 감소하였다는 결과가 확인되었다. Specific fluorescence intensity는 형광단백질의 측정된 형광값을 세포농도인 optical density (OD)로 나눈 값을 나타내며, 이는 aaRS mutants를 가지고 있는 각각의 균주가 amber codon이 삽입된 유전자로부터 green fluorescence protein을 얼마나 생산하는지에 대한 정도를 나타낸다. 따라서 specific fluorescence intensity는 amber codon을 suppression 하는 정도를 나타낸다고 할 수 있다. 본문에서 M178T와 F248L의 경우, Specific fluorescence intensity가 증가하였는데, 이는 K776 보다 얻어진 aaRS mutants의 polyspecificity가 증가한 것으로 생각된다. 즉, pAzF 뿐만 아니라 pAzF의 전구체인 phenylalanine이나 구조가 비슷한 tyrosine을 인식하여 amber codon에 도입하고 이에 대한 결과로 specific fluorescence intensity가 증가한 것으로 보여진다. Selectivity는 pAzF를 첨가한 AzF positive의 specific fluorescence를 AzF 가 첨가되지 않은 (negative) 경우의 specific fluorescence로 나눠 얻은 값이다. K776과 얻어진 aaRS mutants의 비교를 위해　K776의 selectivity를 1로 하고, 각 aaRS mutants의 selectivity를 상대적으로 나타낸 것이 relative selectivity이다. Specific fluorescence intensity가 증가한 M178T, F248L의 경우 selectivity는 K776에 비해 감소한 것을 확인할 수 있는데, 앞서 언급한 aaRS mutants가 pAzF에 대한 specificity가 감소하여, pAzF를 첨가하지 않았을 때도 형광단백질이 발현되어 나타난 결과로 보여진다. 이러한 실험적인 결과를 해석하고 aaRS의 돌연변이에 따른 활성을 예측하기 위하여 Swiss-Model을 이용한 homology model을 제작하고 이로 부터 docking simulation을 진행하였다.

Figure 1. (A) Specific fluorescence intensity and (B) relative selectivity of aaRS mutants with pSEVA 631pt-sfGFP204amb. The specific fluorescence intensity is the fluorescence intensity (extinction at 485nm, emission at 528 nm) of sfGFP divided by the optical density (at 600 nm). Selectivity was obtained by dividing the specific fluorescence under AzF positive condition by specific fluorescence under AzF negative condition. Relative selectivity is relative value based on selectivity of K776.

3.2. 돌연변이 aaRS modeling과 docking

돌연변이 aaRS의 modeling은 Swiss-Model을 이용하여 진행하였다. 대조군 aaRS K776과 site-directed mutagenesis를 통하여 얻어진 mutants에서 총 여덟 개의 binding pose가 예측되었으며, 그 중 affinity efficiency가 가장 높은 binding site는 aaRS의 내부에 위치하고 있다. 해당 자리에 binding하는 AzF 수는 대조군에서 2개, M178T 돌연변이 aaRS에서 1개, F248L 돌연변이 aaRS에서 1개, K256E 돌연변이 aaRS에서 3개로 이들을 겹쳐보면 그 위치가 매우 유사함을 알 수 있다(Fig. 2).

Figure 2. Interaction model of aaRS mutants and AzF with AMdock. (A)Interaction model of K776 aaRS and AzF, (B) interaction model of M178T mutant and AzF, (C) interaction model of F248L mutant and AzF, (D) interaction model of K256E mutant and AzF, and (E) Superposition of ligand and binding sites with the highest affinity of each aaRS.

AMdock을 통해 단백질과 ligand의 docking을 진행할 때, 단백질과 반응하여 ligand가 결합할 수 있는 binding pocket이 먼저 검색되며 자동으로 grid box의 위치와 크기가 지정된다. 이후 docking을 진행하면 결합이 강한 구조부터 차례로 친화도와 ligand efficiency 등 결과값을 얻을 수 있다. 그 결과를 Table 2에 나타내었다. Control (aaRS K776)의 경우, docking 결과 친화도가 가장 좋은 1, 2의 binding pose에서는 affinity가 각각 −7.0, −6.9 kcal/mol로 계산되었으며 해당 binding pocket은 다른 pocket과 달리 aaRS 내부에 위치하고 있었다. 추가로 control과 mutation된 aaRS에서 각 8개씩의 putative binding pocket에 대한 정보를 얻을 수 있었고, 가장 affinity가 높은 각 binding pocket center의 좌표가 control과 mutant에서 거의 일치하였다. 또한 binding pose에 따른 affinity, ligand efficiency가 동일하였기에 이러한 결과로부터 aaRS mutation이 AzF가 결합하는 active site의 구조 변화와 그에 따른 단백질로의 비천연 아미노산 AzF 도입 효율에 영향을 미치지 않는다고 판단하였다. 이때 binding site, affinity, ligand efficiency는 각각 enzyme에 ligand가 결합하는 자리(binding site), enzyme과 ligand 사이의 결합 세기(affinity), 한 분자의 ligand와 enzyme 사이의 결합세기를 의미하며 이번 실험에서 binding site는 AzF가 aaRS 내에 결합하는 위치, affinity는 aaRS와 AzF 간의 결합 세기를 의미한다. 이때, 결합세기는 수치가 작을수록 그 세기가 크다. 또한 Ligand efficiency는 AzF 한 분자 당 AzF와 aaRS 사이의 binding energy를 측정한 값을 의미한다. 위 값들을 바탕으로 docking 결과를 비교 분석한 결과 control 과 돌연변이 aaRS 사이에서는 의미있는 차이를 확인할 수 없었다. 본 연구에서 사용한 Swiss-Model 은 homology model을 기반으로 하는 modeling 방법이기 때문에, 단백질의 정적 구조만 예측할 수 있으며, 실제로는 변화하거나 동적으로 작용하는 단백질의 기능을 반영하는 것이 어려울 수 있다.

Table 2 Affinity prediction of each aaRS mutant and Azf.

aaRS	Binding Site	Affinity	Estimated KI	KI units	Ligand Efficiency
		(kcal/mol)
K776 (Control)	1	−7	7.4	uM	−0.47
	2	−6.9	8.76	uM	−0.46
M178T	1	−6.9	8.76	uM	−0.46
K256E	1	−7	7.4	uM	−0.47
	2	−7	7.4	uM	−0.47
	3	−7	7.4	uM	−0.47
F248L	1	−6.9	8.76	uM	−0.46

본 연구는 비천연 아미노산 AzF을 amber codon으로 도입함에 있어 aaRS의 효율을 향상시키고, 이를 확인하기 위해 reporter gene으로 사용되는 형광 단백질을 이용하여 genetic code expansion을 진행하였다. Site-directed mutagenesis를 진행하여 형질 전환한 재조합 대장균의 AzF의 유무에 따른 형광 단백질 발현을 측정하여, Specific fluorescence intensity와 selectivity를 측정하였다. 돌연변이 aaRS들 중에서 M178T와 F248L의 경우 specific fluorescence intensity는 증가하였으나, selectivity는 M178T, F248L, K256E에서 모두 감소하였고, 이를 통해 mutation이 aaRS의 AzF를 도입 효율에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 판단하였다. Swiss-Model을 이용한 단백질 구조 예측에서는 큰 차이를 확인할 수 없었다. 이러한 연구 결과는 향후 다양한 비천연 아미노산의 도입을 위한 aaRS의 개발이나 분자 구조 분석에 활용될 수 있을 것이다.

This research was supported by “Regional Innovation Strategy (RIS)” through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (MOE) (2021RIS-002).