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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2024; 39(4): 119-127

Published online December 31, 2024 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2024.39.4.119

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

담수 미세조류 Tetradesmus reginae의 세포 생장과 카로티노이드 생산 량에 광파장이 미치는 영향

Effect of Light Wavelength on Cell Growth and Carotenoid Production in Freshwater Green Microalga, Tetradesmus reginae

Sun-Woo Hong1, Seong-Joo Hong1,2, Hyeon-jong Ji1, Shin-young Yun1, Min-ju Jeong1, Choul-Gyun Lee1,2, Bok Yeon Jo3, Yu Ho Kim3, Jin Woo Kim4, Seung Won Nam3*, and Z-Hun Kim5*

1Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea
2Industry-Academia Interactive R&E Center for Bioprocess Innovation, Inha University, Incheon 22212, Korea
3Freshwater Bioresources Culture Collection, Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Sangju 37242, Korea
4Devision of Food Technology and Nutrition, Sunmoon University, Asan 31460, Korea
5Hu evergreen Pharm Inc., Incheon 21447, Korea

Correspondence to:Tel: +82-54-530-0882, Fax: +82-54-530-0889
E-mail: seungwon10@nnibr.re.kr

Tel: +82-32-438-7010, Fax: +82-32-438-7011
E-mail: kimzhun@gmail.com

Received: September 23, 2024; Revised: November 4, 2024; Accepted: November 12, 2024

This study aimed to examine the effect of light wavelength on cell growth and carotenoid production in the freshwater green microalga Tetradesmus reginae during cultivation in bubble column photobioreactors (multi-cultivators) under different light colors (450 nm, blue; 660 nm, red; and CW5700K, white). The microalga cultured under white light showed the fastest specific cell growth rate (1.19 ± 0.00 /day) and highest fresh cell concentration (9.04 ± 0.01 g/L) on day 6. Next, the microalgal cells were cultivated under white light for 5 days to evaluate the effect of light wavelength on carotenoid production. Furthermore, the culture medium was replaced with an N- and P-depleted medium, and the microalgal cells were subjected to different light spectra to induce carotenoid production. Culture under blue light showed the highest carotenoid concentration (19.40 ± 0.19 mg/L) and the highest carotenoid productivity (2.08 ± 0.06 mg/L/day); however, cell concentration was the lowest (4.12 ± 0.00 mg/g dry cell weight) owing to the high carotenoid content. These results clearly show that effective growth and carotenoid production may be induced in Tetradesmus reginae at an appropriate light intensity and quality parameters. Thus, this study provides a basis for developing a light-supply strategy to increase microalgal biomass and carotenoid productivity.

Keywords: Tetradesmus, microalgae, carotenoid, light wavelength, photobioreactor

미세조류는 광합성을 통해 생장에 필요한 에너지를 얻는 단세포 미생물로 주로 바다, 강, 호수 등의 다양한 수서환경에서 서식한다. 생장 중에 이산화탄소를 흡수 및 고정하며 산소를 생성하는 친환경 생물자원으로, 비슷한 역할을 하는 육상 식물에 비해 10배 이상 생장이 빨라 지구 탄소 순환에 큰 기여를 하고 있다 [1,2]. 생장이 빠르고 질소 고정이 가능하여 농업에서는 생물 비료 (biofertilizer)로 사용되며, 체내에 높은 함량의 지질 축적이 가능해 차세대 바이오연료 (biofuel) 등의 청정 에너지 생산 산업에 활용되고 있다. 또한 단백질이나 불포화 지방산, 생리활성이 우수한 카로티노이드(carotenoid)와 같은 고부가가치 산물의 대량생산이 가능하여 건강보조식품과 어류 및 동물 사료첨가제뿐만 아니라 화장품 및 의약품 등 다양한 산업분야에서도 그 활용도가 점차 확대되고 있다 [3,4].

카로티노이드는 식물, 조류, 효모 (yeast), 박테리아 등 다양한 생물에서 아이소프레노이드 (isoprenoid)로 구성된 빨간색, 주황색 또는 노란색을 나타내는 지용성 색소이다. 현재까지 약 700 종이 넘는 카로티노이드가 자연계에 존재하며, 탄소의 개수 및 작용기의 종류에 따라 다양한 생리 활성을 나타낸다 [5,6]. 미세조류의 생리적 측면에서 카로티노이드의 역할은 광 흡수 스펙트럼을 확장하여 광합성의 효율성을 증가시킬 뿐만 아니라, 과잉 공급된 광 에너지를 소멸시켜 광합성 기작을 보호하는 중요한 기능을 한다 [7,8]. 이러한 카로티노이드는 공액 이중 결합 구조 (conjugated double bond)를 가져 라디칼 (radical)과 쉽게 반응해 소거함으로써 강력한 항산화력을 지니고 있다 [9]. 또한 항암 활성과 항염증 활성을 가져 다양한 질환으로부터 인체를 보호해주는 것으로 알려져 있다 [10,11]. 미세조류를 이용해 카로티노이드를 생산할 경우 다른 종과 달리 포도당 (glucose) 등 별도의 유기탄소원을 공급할 필요가 없어 친환경적이며, 동식물 원료에 비해 생산성 및 품질이 우수하다. 또한 화학 합성에 비해 안정성이 뛰어나며, 다양한 종류의 카로티노이드를 생산할 수 있어 미세조류로부터의 생산이 각광받고 있다 [12,13].

미세조류로부터의 카로티노이드 생산은 광파장 및 광도, 영양염의 농도, 혼합 조건 등 다양한 배양 조건에 큰 영향을 받는 것으로 알려져 있다 [14-16]. 특히, 광파장의 경우, 여러 색소의 흡수 대역이 모두 다르기 때문에 생장과 색소 대사에 많은 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로 대부분의 종에서 가장 풍부한 색소인 엽록소는 적색광을 가장 효율적으로 흡수하므로 세포의 생장에는 적색광이 가장 효과적이다 [17,18]. 미세조류에서의 CO2 흡수 과정의 핵심 효소인 ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco)와 carbonic anhydrase는 청색광에서 더 높은 활성을 띄기 때문에 세포의 생장이 아닌 색소 혹은 지질의 생산에서는 청색광이 더 효과적인 경우가 많다 [19,20]. 그러나 종마다 색소의 구성이나 광순응 (light acclimation) 기작이 달라 청색 혹은 백색광에서 가장 잘 자라는 종, 적색광에서 특정 색소를 더 많이 생산하는 종 등의 예외가 상당히 많이 존재한다 [21,22]. 따라서 미세조류의 생장성을 향상시키고 세포 내 카로티노이드 함량 증대 및 생산성의 향상을 위해서는 효과적으로 광파장을 공급하는 전략이 필요하다. 특히 신규분리한 미세조류 종의 경우에는 다양한 광실험과정을 통해 생리적 특성을 규명하는 것이 중요하다. Light Emitting Diode (LED)는 단일 광파장을 균일하고 방향성 있게 조사할 수 있어 미세조류의 생리 연구에 널리 활용되어 왔다 [23]. 본 연구에서는 다양한 파장의 LED (적색, 청색, 백색)를 이용하여 국내에서 신규 발굴된 토착 담수 미세조류인 Tetradesmus reginae의 광파장에 따른 생장성 및 카로티노이드 생산성 변화를 분석하고자 하였다. T.reginae는 카로티노이드의 일종인 루테인 (lutein)의 함량 (13.7 ± 0.2 mg/g)이 비교적 높은 종으로 카로티노이드 생산을 위한 균주로 활용될 가능성이 존재한다 (Table 1). 그러나 이를 개발하기 위한 기초연구가 전무하여 활용되지 못하고 있다. 따라서 미세조류의 생장과 카로티노이드 생산에 적합한 광파장을 탐색하여, 카로티노이드 생산성을 향상할 수 있는 광조사 전략을 개발하고자 하였다.

Table 1 Maximum cell concentrations and specific growth rates of Tetradesmus reginae under various light spectra

Light spectrumMax. cell concentration (gDCW/L, Day 6)Specific growth rate s(/day, Day 3)
Red (660 nm)2.44 ± 0.001.13 ± 0.00
Blue (450 nm)2.29 ± 0.081.10 ± 0.00
White (CW5700K)3.16 ± 0.001.19 ± 0.00

Data were expressed as mean values of two replications ± SD.


2.1. 미세조류 균주 및 계대배양

본 연구에 사용된 균주는 경상북도 경주시 일정로 186 국립경주박물관 고청지 (35°49’42.8”N129°13’36.7”E)에서 분류한 담수 미세조류인 Tetradesmus reginae (FBCC-A901) (Fig. 1)로, 국립낙동강생물자원관 담수생물자원은행 (Freshwater Bioresource Culture Collection; FBCC)에서 분양 받아 실험에 사용하였다. T. reginae는 100 mL의 BG-11 배지가 [24] 담긴 250 mL Erlenmeyer 플라스크에서 배양하였다. Erlenmeyer 플라스크는 진탕배양기 (VS-8480SF, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 형광등을 이용하여 24시간 연속적으로 30 μmol/m2/s의 광도를 조사하였으며, 120 rpm의 교반속도와 20°C의 온도를 유지하였다. 이후 2 L의 원통형 광생물반응기 (bubble column photobioreactors)에서 온도 21 ± 1°C, 광도 150 μmol/m2/s의 조건으로 배양을 진행하였다. 폭기 조건은 CO2가 3 ± 0.3% 포함된 공기를 반응기 하단부에서부터 0.1 vvm (gas volume per liquid volume per minute)으로 공급하였다. 10일 간격으로 계대 배양을 수행하여 T. reginae의 생장성을 일정하게 유지하였다.

Figure 1. A microscope figure x1000 of fast-growing green microalga, Tetradesmus reginae isolated from Gocheongji lake (Gyeongju, korea).

2.2. 미세조류 생장성 분석

미세조류 생장성을 확인하기 위해 Coulter Counter (Multisizer 4, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA)를 이용하여 세포 수 (cells)와 세포 부피 (μm3) 분포를 측정하였다. 이후 Lee et al.의 방법에 따라 측정된 데이터를 이용해 세포 농도(gFCW/L)를 계산하였다 [25]. T. reginae 의 수분 함량을 65%로 계산하여 건조 세포 농도 (gDCW/L)를 구해 세포의 생장성을 확인하였고, 이를 바탕으로 비생장속도 (specific growth rate; μ)를 Eq. (1)과 같이 계산하였다.

μ=In(X2)In(X2)t2t1

μ는 비생장속도 (/day)이며, X1X2t1t2 배양 시점의 세포 농도 (g/L)를 나타낸다. 여기서 t1t2는 지수생장기인 0일과 3일로 선정하였다. 총 카로티노이드의 함유량을 계산하기 위해 필요한 생체중량은 Coulter counter로 측정한 세포농도를 이용하였다.

2.3. 총 카로티노이드 분석

미세조류의 총 카로티노이드 함량을 측정하기 위해 T. reginae의 배양액 1 mL를 2 mL 스크류캡 튜브 (Precellys lysing kit 2 mL, Bertin Technologies, Montigny-les-Bretonneux, France)에 분주한 후 21,000 x g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 남은 펠렛 (pellet)에 100% 아세톤 1 mL와 glass bead (Gl bead 0.2-0.3 nm, Daihan Scientific, Wonju, Republic of Korea) 0.03 g을 넣고 Bead Beater (Precellys 24, Bertin Technologies, Montigny-les-Bretonneux, France)에서 2,500 rpm, 45 sec 운전, 20 sec 정지를 12회 반복하여 카로티노이드를 추출하였다. 이후 21,000 x g에서 5분간 원심분리하여 상등액만을 분리하였다. 분리된 추출액은 분광광도계 (UV-1800, Shimazu, Kyoto, Japan)를 이용해 661.6 nm, 664.8 nm, 470 nm에서 흡광도 값을 측정하였고, Eq. (2), Eq. (3), Eq. (4)를 이용하여 색소의 함량을 계산하였다 [26].

Ca=11.24A661.62.04A644.8
Cb=20.13A644.84.19A661.6
Cx+c=1000A4701.90Ca63.14Cb/214

CaCb는 각각 엽록소 a (chlorophyll a)와 엽록소 b (chlorophyll b)를 뜻하며, Cx+c는 총 카로티노이드 농도를 나타낸다.

2.4. 배지 내 인산염 함량 측정

미세조류 배양액 내의 인산염 (phosphate) 함량을 측정하기 위해 표준 방법 4500-P를 이용했다 [27]. 미세조류 배양액 1 mL을 10,000 x g에서 10분간 원심분리한 다음 새로운 튜브에 상등액 600 μL를 옮겼다. 이후 바나데이트-몰리브덴산염 시약 (vanadate-molybdate reagent)을 동일한 부피로 혼합하고 실온에서 20분간 암실 반응하였다. 인 농도는 분광광도계 (UV-1800, Shimazu, Kyoto, Japan)를 이용해 420 nm에서 측정하였다. 표준물질로는 K2HPO4 (Sigma-Aldrich)를 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.20 mM 농도의 용액으로 만들어 사용하여 표준곡선을 작성하였다. 미세조류 배양액 내의 인산염 농도는 흡광도와 인산염의 관계식을 이용하여 계산하였다.

2.5. 배지 내 질산염 함량 측정

미세조류 배양액 내의 질산염 (nitrate) 함량을 측정하기 위해 Carvalho et al.의 방법을 이용하였다 [28]. 미세조류 배양액 1 mL을 10,000 x g에서 10분간 원심분리한 다음 새로운 튜브에 상등액 10 μL를 옮겼다. 이후 증류수 990 μL와 1 M 염산(HCl) 용액을 1 mL 넣은 후 30초간 진탕 (vortexing)하였다. 질산염 농도는 분광광도계 (UV-1800, Shimazu, Kyoto, Japan)를 이용해 220 nm에서 측정하였다. 표준물질로는 NaNO3 (Sigma-Aldrich)을 3.5, 7.0, 10.6, 14.1, 17.6 mM 농도의 용액으로 만들어 사용하여 표준곡선을 작성하였다. 미세조류 배양액 내의 질산염 농도는 흡광도와 인산염의 관계식을 이용하여 계산하였다.

2.6. 광도에 따른 Tetradesmus reginae의 생장성 분석

광파장이 미세조류 생장과 카로티노이드 생산에 미치는 영향에 대한 실험에 앞서 생장 및 카로티노이드 생산에 적절한 광도를 확인하고자 100 mL (working volume: 80 mL)의 원통형 광생물반응기 (bubble column photobioreactors)가 8개로 구성된 다중 광생물반응기 (Multi-cultivator; MC1000-OD, PSI, Drasov, Czech)를 이용하였다. 각각의 반응기에 80 mL의 BG-11 배지를 넣어 배양을 실시하였다. 수조 내의 온도는 21 ± 1°C로 유지하였다. 폭기 조건은 CO2가 3.0 ± 0.2% 포함된 습윤한 공기를 순환 펌프를 이용하여 0.2 vvm으로 공급하였다. 광도 조건은 백색 (CW5700K) LED array를 이용하여 100, 300, 500, 700 μmol/m2/s의 광도로 24시간 연속적으로 조사하였다 (n=2) (Fig. 2(a), Fig. 2(b)). 실험 결과는 평균값과 표준편차로 표기하였다 (mean ± SD).

Figure 2. Photographs of the multi-cultivator system for Tetradesmus reginae cultivation under various light intensities (100, 300, 500, and 700 μmol/m2/s) at Day 0 (a), at Day 6 (b). Photographs of the multi-cultivator system for Tetradesmus reginae cultivation under various light spectrum (450, 660 nm, CW5700K) at Day 0 (c), at Day 6 (d).

2.7. 광파장에 따른 Tetradesmus reginae의 생장성 비교 분석

광파장에 따른 미세조류 생장성 실험은 광파장을 제외하고 상기 광도 실험 조건과 동일하게 수행하였다. 각 광생물반응기에 적색 (660 nm), 청색 (450 nm), 백색 (CW5700K) LED array를 이용하여 400 μmol/m2/s의 광도로 24시간 연속적으로 조사하였다 (n=2) (Fig. 2(c), Fig 2(d)). 실험 결과는 평균값과 표준편차로 도시하였다 (mean ± SD).

2.8. 광파장에 따른 Tetradesmus reginae의 총 카로티노이드 생산성 비교

광파장에 따른 미세조류의 카로티노이드 생산성 실험은 상기 실험과 동일한 조건으로 수행하였다. 광생물반응기에 백색 (CW5700K) LED array를 이용하여 400 μmol/m2/s의 광도로 24시간 연속적으로 조사하여 미세조류의 생장이 정체기(stationary phase)에 돌입할 때까지 배양하였다. 이후, 질소와 인 성분이 결핍된 BG11 배지(N-P-)로 교체하고 각 광생물반응기에 적색 (660 nm), 청색 (450 nm), 백색 (CW5700K) LED array를 이용하여 400 μmol/m2/s의 광도로 24시간 연속적으로 조사하였다 (n=2). 실험 결과는 평균값과 표준편차로 도시하였다 (mean ± SD).

3.1 광도가 Tetradesmus reginae의 생장성에 미치는 영향

광독립영양조건에서 미세조류 배양 시 광도는 미세조류의 생장에 가장 큰 영향을 미치게 된다. 구체적으로 생장에 광도가 충분히 공급되지 않는 조건에서는 광합성 속도가 공급되는 광도에 비례하는 선형 의존성 (light dependent growth)을 나타내며, 광포화 (saturated light intensity) 조건에서는 최대 광합성 속도를 나타낸다. 이보다 더 높은 광도에서는 광억제 (light inhibition) 현상을 유발하여 광합성 속도가 감소하게 된다 [29]. 따라서 미세조류 최대 생장성을 얻을 수 있는 최소의 광도를 공급해, 높은 광 에너지 대비 바이오매스 효율 (photon yield: Yx/E)을 얻을 수 있을 것이다.

우선적으로 T. reginae의 생장에 적합한 최적의 광도를 찾고자, 다양한 광도 (100, 300, 500, 700 μmol/m2/s)에서 3일간 배양한 후 비생장속도를 비교하였다. Fig. 3에서 보는 것처럼, T. reginae의 비생장속도는 공급되는 광도에 비례적으로 증가하였다. 실험군 중 높은 광도군인 500 μmol/m2/s와 700 μmol/m2/s에서는 생장속도는 각각 0.78 ± 0.00 /day, 0.79 ± 0.01 /day로 가장 빠른 비생장속도를 보였다. 그 다음으로 높은 광도인 300 μmol/m2/s에서는 0.72 ± 0.00 /day로 나타났으며, 가장 낮은 광도인 100 μmol/m2/s에선 0.35 ± 0.03 /day로 최대값의 절반의 비생장속도를 나타냈다. 광도 300 μmol/m2/s까지는 비생장속도가 공급되는 광도에 비례하여 급격하게 증가하였으나, 그 이후에는 증가폭이 감소되어 약 400 μmol/m2/s부터는 비생장속도의 증가폭 변화가 미미하였다. 광도에 따른 생장곡선을 추세를 고려하여, 미세조류 생장성을 최대화시키는 최소의 광도인 400 μmol/m2/s를 생장에 적절한 광도로 설정하였고 향후 실험에 적용하였다.

Figure 3. Specific growth rates of Tetradesmus reginae as a function of supplied light intensity. Data were expressed as mean values of two replications ± SD.

3.2 광파장이 Tetradesmus reginae의 생장성에 미치는 영향

광파장이 미세조류의 생장성에 미치는 영향을 분석하기 위해 적색 (660 nm), 청색 (450 nm), 백색 (CW5700K) 광을 조사하여 배양한 T. reginae의 생장성을 비교하였다. Fig. 4에서 도시한 것처럼, 배양 2일차까지는 광파장에 따른 세포 농도 차이가 크게 나타나지 않았으나, 배양 3일 이후부터 백색광에서의 생장이 다른 광파장에 비해 높게 나타났다. 이를 구체적으로 비교해보고자, 지수성장기인 3일차까지의 비생장 속도로 광파장에 따른 생장성 비교를 수행하였다 (Table 1). 적색광에서 1.13 ± 0.00 /day, 청색광에서 1.10 ± 0.00 /day의 비생장속도를 보였으며, 백색광에서 적색광에 비해 5.3%, 청색광에 비해 8.2% 높은 1.19 ± 0.00 /day로 가장 높은 생장속도를 나타냈다. 최고 세포 농도 (gDCW/L, Day 6)는 적색광에서 2.44 ± 0.00 gDCW/L, 청색광에서 2.29 ± 0.08 gDCW/L, 백색광에서 3.16 ± 0.00 gDCW/L로 백색광이 적색광과 청색광에 비해 각 22.8%, 27.5% 높은 수치를 보였다. 따라서 비생장속도와 최대 세포농도를 종합적으로 고려한 결과 T. reginae의 생장에 가장 적합한 광파장은 백색광으로 판단된다.

Figure 4. Time profiles of Tetradesmus reginae cultured under various light spectra in bubble column photobioreactors. Data were expressed as mean values of two replications ± SD.

일반적으로 녹조류의 주요 광합성 색소는 엽록소로 적색(600-700 nm)과 청색(400-500 nm) 파장대에서 최대 흡광도를 보인다 [30]. Kim et al.의 보고에 따르면 T. reginae와 같은 때목말과 (Scenedesmaceae)에 속하는 Scenedesmus sp.를 BBM 배지에서 배양한 결과, 적색광 (670 nm)과 청색광 (450 nm)을 7:3의 비율로 혼합하여 조사하였을 때 약 95 mg/L/day의 최대 바이오매스 생산성을 보였다. 이는 적색광 (약 55 mg/L/day) 혹은 청색광 (약 51 mg/L/day)만을 이용한 것에 비해 약 73% 이상 높은 수치로, 광합성에 필요한 파장 범위만을 선택적으로 동시에 공급하여 광합성 효율을 높였기 때문이다 [31]. 본 실험에서 백색광으로 사용한 Cool White LED의 방출 스펙트럼은 450 nm (청색)에서의 날카로운 피크와 500-630 nm (녹색-적색)에서의 넓은 피크로 이루어져 있어 엽록소의 최대 흡광 파장대를 모두 충족시킬 수 있다. 이에 따라 T. reginae의 광합성 효율을 적색 혹은 청색의 단파장보다 더 높일 수 있어 이러한 결과가 나온 것으로 판단된다. 추후 상기 연구와 같이 적색광과 청색광의 혼합 비율을 다르게하여 실험할 경우 더욱 높은 생장성을 보이는 광파장을 찾을 수 있을 것으로 사료된다.

3.3. 광파장이 Tetradesmus reginae의 카로티노이드 생산에 미치는 영향

광파장이 T. reginae의 카로티노이드 생산성에 미치는 영향을 분석하기 위해 백색광을 400 μmol/m2/s의 광도로 24시간 연속 조사하여 정체기에 돌입할 때까지 배양한 후 각 생물반응기에 적색, 청색, 백색광을 조사하였다. 질소와 인이 결핍되면 미세조류의 생장에 필요한 활동이 억제되어 탄소의 대사 흐름이 탄화수소화합물 (지방산, 탄수화물, 카로티노이드 등)로 유도된다 [32,33]. 특히 질소 결핍은 광계에서 전자전달계로의 전자 흐름을 손상시켜 반응성 산소종을 생성하므로 이에 대응하기 위해 카로티노이드 생성이 촉진되는 경향이 있다 [34-36]. 본 연구에서도 카로티노이드 함량 증대하기 위해 질소와 인이 고갈된 상태에서 각 파장의 광을 조사하고자 하였다. 연구에서 사용한 BG11은 인산염의 함량 (0.02 g/L)에 비해 질산염의 함량 (1.09 g/L)이 높은 불균형적 특성이 있어 배양 3일차만에 인산염은 모두 고갈되었으나, 질산염은 세포가 정체기에 도달한 배양 5일차까지 배지에 남아있음을 확인하였다 (refer to Fig. 1). 따라서 전술한 것처럼, 미세조류 내의 카로티노이드 함량 증대를 위해 배양 5일차에 질소와 인이 결핍된 BG11으로 배지를 교체한 후 다른 광파장을 공급하였다.

Fig. 5(a)에서 도시한 바와 같이 총 카로티노이드 (mg/L)는 광파장을 바꾼 이후 배양 3일차에 가장 많이 생산되었다. 배양 3일차에 적색광에서 18.59 ± 0.76 mg/L, 백색광에서 18.49 ± 0.65 mg/L의 카로티노이드를 생산하였으며, 청색광에서 적색광에 비해 4.3%, 백색광에 비해 4.9% 많은 19.40 ± 0.19 mg/L로 가장 많은 카로티노이드를 생산하였다. 광파장이 미세조류의 카로티노이드 생산에 미치는 영향을 더욱 구체적으로 분석하기 위해 바이오매스당 카로티노이드 함량(mg/gDCW, Fig. 5(b))과 총 카로티노이드 생산성 (mg/L/day, Table 2)을 확인하였다. 가장 높은 바이오매스당 카로티노이드 함량은 배양 3일차 청색광에서 나타난 7.49 ± 0.01 mg/gDCW로, 같은 배양 3일차의 적색광 (6.85 ± 0.19 mg/gDCW)과 백색광 (5.83 ± 0.15 mg/gDCW)에 비해 각각 9.6%, 22.2% 높은 수치를 보였다. 이는 Tetradesmus sp.를 이용하여 최적 LED광파장 연구를 통해 도출된 6.09 ± 0.29 mg/g와 비교시 23% 높은 수치이다 [37]. 총 카로티노이드 생산성 또한 광파장 교체 이후 3일차를 기준으로 청색광에서 2.08 ± 0.06 mg/L/day로 가장 높았다. 이는 적색광 (1.81 ± 0.25 mg/L/day)과 백색광 (1.77 ± 0.22 mg/L/day )보다 각각 14.9%, 17.5% 높은 수치이다. 광자에너지는 광파장의 반비례하는 관계를 갖게 된다. 다시 말해 짧은 파장의 광자는 상대적으로 긴 파장의 광자보다 큰 에너지 값을 가지고 있다. 에너지 측면에서 카로티노이드 생산의 효율을 계산하고자, 파장별 투입되는 광자에너지를 계산하고자 하였다. 청색은 106.3 J/m2/s이고, 적색은 72.5 J/m2/s이며 백색은 90.3 J/m2/s이였다. 이를 근거로 카로티노이드 수율값 (Yg/J)을 계산한 결과에서도 청색 (693.2 mg/J)이 적색 (974.3 mg/J)과 백색 (778.2 mg/J) 보다 효율적인 것으로 확인하였다. 따라서 총 카로티노이드 생산량과 바이오매스당 카로티노이드 함량, 총 카로티노이드 생산성, 에너지 효율성을 종합적으로 고려한 결과 T. reginae의 카로티노이드 생산에 가장 적합한 광파장은 청색광으로 판단된다.

Figure 5. Time profiles of total carotenoid production (a) and carotenoid content (b) cultured under various light spectra. Data were expressed as mean values of two replications±SD.

Table 2 Profiles of carotenoid production of Tetradesmus reginae under various light spectra at Day 3

Light spectrum1Total carotenoid (mg/L)Carotenoid content (mg/gDCW)Total carotenoid productivity (mg/L/day)
Red (660 nm)18.59 ± 0.196.85 ± 0.191.81 ± 0.25
Blue (450 nm)19.40 ± 0.197.49 ± 0.012.08 ± 0.06
White (CW5700K)18.49 ± 0.655.83 ± 0.151.77 ± 0.22

Data were expressed as mean values of two replications±SD.



이러한 결과를 광파장에 따른 미세조류 탄소대사 및 카로티노이드 생산 관련 문헌에서 확인하고자 하였다. 청색광 조건에서 미세조류는 이산화탄소 고정에 관여하는 효소인 ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase (RuBisCo)와 carbonic anhydrase의 생성을 촉진하여 탄화수소화합물의 축적을 유도하는 것으로 알려져있다 [38]. 또한 청색광의 광에너지는 다른 광파장에 비해 높아 광합성에 이용되는 양을 넘게 투사되어 비광합성 소광 (non-photosynthetic quenching) 현상을 일으키며 반응성 산소종을 만들 가능성이 높다 [39]. 이에 대응하여 카로티노이드와 같은 광보호 (photoprotective) 색소를 만들기 때문에 청색광을 조사하였을 때 카로티노이드의 생산성이 증대된 연구가 다수 존재하며, 본 연구의 결과도 이와 일치한다. 구체적으로 Fu et al.의 보고에 따르면 청색과 적색 LED를 1:3으로 혼합하여 조사해 적응형 실험실 진화(Adaptive laboratory evolution)한 Dunaliella salina는 그렇지 않은 균주에 비해 285.1 ± 55.3% 높은 카로티노이드 생산량을 보였으며, Katsuda et al.의 실험에서는 Haematococcus pluvialis에 청색광을 조사했을 때 14 mg/mL로 적색광 (5.1 mg/mL)과 형광 (3.0 mg/mL)을 조사했을 때보다 각각 2.75배, 4.67배 높은 최대 아스타잔틴 (astaxanthin) 축적량을 보였다[40,41]. 그러나 Baba et al.의 연구 결과에서 적색광에서 Botryococcus braunii에 더 높은 카로티노이드/엽록소 비율로 인한 색변화가 일어난 것과 Sánchez-Saavedra et al.의 보고에서 나타난 Dunaliella bardawil의 적외선에 의한 카로티노이드 축적량 증가의 결과로 추론하였을 때, 미세조류의 종과 미세조류 배양기의 형태 (e.g., 반응기의 형태 및 지름, 광투과 깊이)에 따라 카로티노이드 생산성 증대에 적합한 광파장이 달라질 수 있다 [23,42,43]. 따라서 이러한 결과들은 실험을 통한 카로티노이드 생산 유도에 효과적인 광파장 공급 조건의 규명 및 광조사 전략 개발의 중요성을 시사하고 있다. 따라서 추후 본 연구 결과에 더하여 적색광과 청색광의 혼합 조사, 적외선 조사 등의 공급 조건을 확인하여 효과적인 광 파장 공급 조건을 규명한다면 산업적 활용에 충분한 생산성을 확보할 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 생장성이 우수한 토착 담수 미세조류 T. reginae를 이용하여 세포의 생장성 향상과 총 카로티노이드 생산성을 증대시키기 위해 다양한 광도와 광파장 조건에서 실험을 수행하였다. 파장이 다른 광원을 이용하여 (청색광, 적색광, 백색광) T. reginae를 배양한 결과 백색광에서의 비생장속도(1.19 ± 0.00 /day)와 바이오매스 농도 (3.16 ± 0.00 gDCW/L)가 가장 높아 세포의 생장에 백색광이 가장 효과적임을 확인하였다. 또한 정체기에 도달한 세포를 질소와 인 결핍조건에서 청색광과 적색광, 백색광을 이용해 배양한 결과 청색광에서 가장 높은 카로티노이드 함량 (7.49 ± 0.01 mg/gDCW)과 생산성 (2.08 ± 0.06 mg/L/day)을 얻을 수 있었다. 본 연구 결과는 미세조류로부터 대표적 고부가가치 산물인 카로티노이드의 생산성을 향상시킬 수 있는 광도와 광파장의 효과적인 공급전략을 제시하고 있다.

Supplementary Fig. 1 Time profiles of phosphate and nitrate concentrations of Tetradesmus reginae culture. Data were expressed as mean values of six replications±SD.

Table s1 Carotenoid contents of various microalgae. Data were expressed as mean values of replications±SD

Species and Straincarotenoidcontent (mg/g)Reference
Tetradesmus reginaetotal carotenoid7.49 ± 0.01in this study
Botryococcus brauniitotal carotenoid2.10 ± 0.07[1]
Chaetoceros calcitranstotal carotenoid2.33 ± 0.14[1]
Chlorella #1total carotenoid3.04 ± 0.20[1]
Isochrysis ISO-Ttotal carotenoid3.08 ± 0.07[1]
Isochrysis sp.total carotenoid7.75 ± 0.13[1]
Nannochloropsis oculatatotal carotenoid1.65 ± 0.10[1]
Nannochloropsis sp.total carotenoid2.17 ± 0.03[1]
Neochloris oleoabundanstotal carotenoid1.56 ± 0.29[1]
Parachlorella kessleritotal carotenoid2.12 ± 0.04[1]
Phaeodactylum tricornutumtotal carotenoid6.14 ± 0.16[1]
Scenedesmus obliquustotal carotenoid0.44 ± 0.06[1]
Tetraselmis sp.total carotenoid2.88 ± 0.29[1]
Tetraselmis suecicatotal carotenoid4.27 ± 0.21[1]
Chlorella fusca SAG 211-8blutein4.74 ± 0.67[2]
Chlorococcum citriforme SAG 62.80lutein7.68 ± 1.76[2]
Muriellopsis sp.lutein5.59 ± 0.65[2]
Neospongiococcum gelatinosum SAG B 64.80lutein4.51 ± 0.94[2]
Chlorella zofingiensis CCAP 211/14lutein2.85 ± 0.44[2]
Tetraselmis sp. CTP4lutein3.17[3]
Chromochloris zofingiensislutein4.00[4]

이 연구는 환경부의 재원으로 국립낙동강생물자원관의 지원(grant number: NNIBR20241108)과 환경산업기술연구원의 다부처 국가생명연구자원 선진화 사업 (grant number: 2021003420004)의 지원을 받아 수행된 연구입니다.

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