Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal

pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2021; 36(4): 254-259

Published online December 31, 2021 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.4.254

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

가바(GABA, γ-amino Butyric Acid) 대량생산을 위한 공정개발

Developments of GABA Process for the Mass Production

Eui Jin Kim, Hyun-Jae Shin, and Jung-Heon Lee*

Department of Biochemical & Polymer Engineering, Chosun University, Gwangju 61452, Korea

Correspondence to:Tel: +82-62-230-7159, Fax: +82-62-230-7259
E-mail: leejh@chosun.ac.kr

Received: December 19, 2021; Revised: December 25, 2021; Accepted: December 26, 2021

Gamma-amino butyric acid (GABA) is a component of pharmaceuticals and functional foods. GABA can be biosynthesis through the decarboxylation of glutamate by glutamate decarboxylase (GAD) and this conversion process consume hydrogen ion cause change pH condition. Mass production of GABA process overcome changing pH, supplied HCl each 3 hr when 3 times for prevent pH shift and using 1 M HCl for the inhibition to destroying of GAD structure and added PLP for increasing to GAD activity developed process of mass production that 1M MSG convert to 0.99 M GABA on 15 hour. Consider to GAD activity and produced GABA purity, this process is suitable for mass production process of GABA.

Keywords: gamma-amino butyric acid, glutamate decarboxylase, monosodium glutamate, mass production process

γ-Aminobutyric acid (GABA)는 자연계에 널리 분포하는 비단백질 구성 아미노산으로 뇌기능을 촉진시키는 등의 생리작용을 하는 중추신경계(CNS, Central Nervous System)에서 중요한 억제성 신경전달물질이다. GABA는 자연계 유래의 효소인 Glutamate decarboxylase (GAD)의 L-glutamate의 탈 탄산 반응에 의해 CO2와 동시에 생성되며 Pyrodoxal-5’-phosphate(PLP)를 조효소로 사용하는 것으로 알려져 있다[1-4]. GABA는 척추에 존재하는 신경전달물질로 뇌 혈류를 개선하며 뇌의 산소공급을 증가시켜 뇌의 대사촉진 및 뇌 기억을 증진시키는 뇌의 영양제로 알려져 신경전달물질 조절을 통해 뇌 혈류개선, 산소공급증가, 뇌세포 대사 촉진으로 인한 신경안정작용 등의 효능을 가진다고 알려져 있으며 이외에도 스트레스해소, 우울증 완화작용, 기억력증진, 불면, 비만, 중풍과 치매 예방에 효과가 있다 [5-13]. 그 외에도 GABA는 성장호르몬의 분비조절, 통증완화, 정신신경 안전작용, 혈압강하작용, ACE 저해 활성 등이 있어 생리학적으로 매우 유익한 물질이다. 이러한 기능들 때문에 GABA는 식품소재, 건강보조식품, 기능성 식품, 약, 음료, 드링크, 김치 등 식품관련 분야에서 많이 적용되고 있다 [9,14-20]. 산업적으로 GABA를 이용하기 위해서는 대량생산이 필요하지만, 효소를 이용하는 방식은 발효를 통한 효소의 분리, L-glutamate의 용해도, GAD의 탈 탄산화에 의한 반응조건의 급격한 변화로 대량생산이 어려운 실정이다. L-glutamate의 경우 용해도가 8.64 g/L로 아주 낮기 때문에 아미노산을 이용한 생산속도의 향상 및 고농도의 GABA 생산은 어려운 실정으로 산업적인 GABA 생산의 저해요인이 된다. Monosodium glutamate (MSG)는 용해도가 740 g/L로 L-glutamate보다 80배 이상 높다. 고농도의 반응물을 사용하면 고농도의 생성물 생산이 가능하며 분리 정제공정 비용을 현저히 감소시켜 경제적인 공정의 개발이 가능하다. GAD는 탈 탄산화반응을 이용하여 L-glutamate를 GABA로 전환시키는데, 탈 탄산화 반응은 수소이온을 소비하는 반응으로 반응이 진행됨에 따라서 반응계의 pH가 높아진다. 반응계의 pH의 증가는 GAD의 구조적인 변화를 유발하여 [1,21-25] GABA 생산속도를 현저히 감소시킨다. 이러한 pH의 급격한 증가는 GABA를 대량생산하는데 어려운 점으로 인식되어 왔다. 급격한 pH의 증가에 의한 GABA 생산저해를 막기 위하여 연구자들이 버퍼를 사용하여 GABA의 생산을 증진시키는 연구를 진행하고 있다. 그러나 버퍼의 완충작용 범위를 넘어서게 되는 pH의 변화에는 대응하기가 어려워지며, 고농도의 버퍼를 사용하는 경우 생성되는 GABA에 고농도의 버퍼 염이 존재하여 GABA를 분리하는 공정에 문제점이 발생하기도 한다. 본 연구에서는 GABA를 대량생산하기 위하여 용해도가 낮은 L-glutamate 대신에 MSG를 사용하여 생산공정의 어려움을 극복하고자 하였다. GABA 생산하는 과정에서 급격한 pH의 변화를 제어하기 위하여 2 M의 HCl을 이용하였다. 또한, 주기적인 조효소 공급을 통하여 생산성을 향상시키고자 하였다.

2.1. 균주 및 보존

본 연구에 사용된 균주는 GAD를 생산하는 E. coli BL-21 변이주로 생산한 GAD는 N-terminal interdomain을 변형하여 열안정성을 증가시킨 GAD를 사용하였다 [26]. 사용된 재조합 균은 300 ml 플라스크에 100 ml 배양액을 만든 후 37°C에서 6시간 정도 배양 후 50% glycerol (Duksan, Korea)과 동일한 비로 잘 섞은 후 −70°C deep freezer (DF8517, Il-shin Bio Co.)에 보관하여 실험에 사용하였다.

2.2. 시약 및 기기

본 연구에서는 발효조성으로 glucose (Duksan, Korea), (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, MgSO4 (Ducksan, Korea)를 사용하였고 미량 원소인 CaCl2·2H2O, CuSO4·5H2O, NaMoO4· 2H2O, CoCl2·6H2O, MnO4·7H2O, FeSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O을 첨가하였으며, 소포제로는 anti-form 204 (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 제조한 배양액은 121°C에서 15분 멸균하여 실험을 진행하였다. 생산된 효소 활성도 측정은 Llysine, Pyridoxal 5′-phosphate hydrate (Sigma-Aldrich, USA), Toluene (OCI, Korea), Potassium carbonate, Sodium acetate(Duksan, Korea), TNBS (TCI, Japan)를 사용하였다.

본 배양에서는 ammonium sulfate 2 g/L, sodium chloride 1 g/L, magnesium sulfate 1 g/L제조 후 potassium monobasic 1 g/L, potassium dibasic 1 g/L, glucose 20 g/L에서 각 200 mL, 접종시킨 균 200 mL, distillation water 1400 mL를 넣어 총 2 L의 배양액을 제조하였다. 배양액을 121°C에서 15분 멸균한 뒤, 발효의 안전성을 위해 trace salt 1 mL/L와 antiform 1.5 mL/L는 3 mL syringe를 이용해 넣어주었다. 제조한 배양액을 37°C, 300 rpm에서 15시간 진행하였고 pH 6.5는 3N NaOH을 이용해 조절하였다. 이후 배양된 균체량의 측정을 위해 UV-visible을 사용하여 600 nm에서 실험을 진행하였다. 발효조로는 5 L (Biotron Co.)를 사용하였다.

2.3. GAD 분리 및 회수

본 배양이 끝난 후 배양액을 모두 모아 원심분리기(Mega 17R, Han-il Inc., England)를 이용해 8000 rpm 10분간 원심분리 하였다. 침전된 균체를 pH 5.0, 0.5 M phosphate buffer에 균일하게 분산시킨 후 초음파 파쇄 (pulse 1 : 1, amplitude 20%, −4°C, 20 min) 방법을 통하여 세포를 파괴하였다. 초음파 파쇄된 용액을 원심분리 (8000 rpm, 10 min)를 통하여 세포의 잔여물을 제거한 후 상등액을 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 상등액은 분취하여 −70°C에서 보관하였으며, 동일한 대조실험은 한 배치에서 분리한 상등액을 사용하였다.

2.4. GAD 활성도 측정 및 pH에 따른 PLP 변화

추출된 효소와 조효소로 사용되는 PLP, 기질 100 mM MSG를 각각 6:1:4의 비율로 37°C에서 30분간 반응시킨 후, heating block을 이용해 100°C에 10분 동안 불활성화 시킨다. 이후 원심분리 된 sample을 HPLC로 MSG와 GABA 농도를 분석하여 GAD 활성도를 측정하였다. pH에 따른 PLP의 변화를 확인하기 위하여 증류수에 PLP의 농도를 0.625 mM 부터 2배씩 희석을 하여 200 nm에서 500 nm까지 파장을 분석하여 농도에 따른 스펙트럼을 분석하였으며, pH 4에서 pH 10까지 완충용액을 제조하여 0.3 mM의 제조된 PLP 용액과 혼합하여 각기 다른 pH 를 제조한 후 스팩트럼을 분석하였다.

2.5. HPLC를 이용한 MSG와 GABA 분석

GAD 전환공정에서 생성된 GABA의 분석은 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzen (DNFB) [27] 로 발색을 시킨 후 HPLC를 이용하여 측정하였다. HPLC의 이동상은 0.05 % TFA /DW(mobile phase A)과 0.05% TFA /CAN (mobile phase B)를 이용하였으며, mobile phase B의 농도를 3분동안 20%, 20분까지 80%로 순차적으로 증가시키며, 30분까지 80%를 유지, 30분 이후로 5분간 20%로 농도를 변경하여 분석에 사용하였다. 분석용 컬럼은 XRerra RP18 (5 μL, 4.6 x 100 mm)을 사용하고 컬럼의 온도는 상온에서 400 nm에서 분석하였다. 이때, flow rate는 0.7 ml/min이며 GABA의 표준물질을 만들어 피크의 면적을 이용해 검량곡선을 만들었다.

3.1. 초기 MSG농도 변화에 따른 GABA 생산

본 연구에서는 단위시간당 GABA의 생산량을 높이기 위하여 수용액에 용해도가 높은 MSG를 기질로 선정하였다. GAD를 이용한 MSG 전환반응은 MSG 농도, pH, 및 온도에 따라 생산속도가 현저히 다르다. 대부분의 효소반응에서는 기질의 농도가 초기에 높을 경우 기질저해 작용으로 인하여 생성물이 생성되는 시간이 길어지며, 생성된 생성물의 농도 또한 현저하게 낮아진다. 단위시간당 생성물의 생성을 극대화하기 위해서는 효소반응에 적합한 기질의 최적농도를 선정하여야 한다. 본 연구에서는 용해도가 낮은 L-glutamate(8.64 g/L, 25°C) 대신에 용해도가 높은 MSG (740 g/L, 25°C)를 이용하여 전환 반응을 수행하였다. MSG 초기농도에 따른 GAD 기질저해를 측정하기 위해 초기 MSG 농도를 변화시키면서 생산되는 GABA의 농도를 측정하였다. 그 결과 0.1, 0.5, 1.0 M의 MSG 반응이 10시간이후 종결되는 것으로 나타났으며, 10시간째 각각의 GABA 농도는 55.4, 171, 200mM, 그리고 전환율은 55.4, 34.2, 20%로 분석되었다 (Fig. 1). GAD의 반응이 각기 다른 초기 MSG농도 반응에서 동일한 시간에 반응이 종결되며 반응이 종결된 시점에서 용액의 pH 8 이상의 염기성으로 변하고, 조효소로 사용되는 PLP의 변화가 확인되어 변화하는 pH와 PLP가 GAD반응에 미치는 영향을 확인하기 위하여 PLP의 농도, pH, 반응시간에 따른 spectra를 비교분석 하였다 (Fig. 2). GAD의 전환반응은 PLP를 조효소로 glutamate를 탈탄산화시켜 GABA를 생성하는 반응이며, 이는 H+이온을 소비하는 반응으로 알려져 있다[28,29]. 일반적으로 낮은 농도의 전환 반응은 완충용액이 H+ 이온이 소비되어도 반응계의 pH는 변화를 주지 않지만 본 연구는 고농도의 MSG를 전환하는 반응이기에 완충작용의 허용범위를 벗어나 pH가 증가하여 전환반응에 영향을 주어 효소의 활성이 현저히 감소된 것으로 추측된다.

Figure 1. GABA production and conversion from MSG along different concentration.

Figure 2. The PLP spectra change according to (A) concentration, (B) pH, and (C) reaction time.

3.2. pH 변화 및 GABA 생산공정에서 PLP Cofactor 농도변화

반응계의 pH 변화에 따른 PLP의 변화를 확인하기 위하여 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 PLP의 spectra를 확인하였다. 그 결과 389 nm에서 최대 흡광도값을 나타내는 spectrum을 확인하였으며, 농도에 따른 spectrum을 측정한 결과 389 nm에서 정량이 가능함을 확인할 수 있었다 (Fig. 2(A)). 효소 반응이 진행되면서 반응계의 pH가 변화함에 따른 PLP의 변화를 확인하기 위하여 PLP의 pH에 따른 spectrum을 비교하였다. 반응에서 고려할 수 있는 범위인 pH 4에서 pH 10의 PLP변화를 비교해본 결과 pH가 상승함에 따라서 PLP의 최대 흡광도값을 나타내는 389 nm의 peak이 상승하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2(B)). GAD의 반응에서 PLP의 변화를 확인하기 위하여 반응시간에 따른 흡광도를 비교 분석하였다. 그 결과 효소반응액의 최대 흡광도값을 나타내는 파장은 410 nm로 나타났다. 이는 PLP와 효소와의 결합에 의한 peak shift로 여겨지며, 시간이 지남에 따라 peak이 점차 감소하는 현상을 확인하였다. 330 nm 근처의 peak은 반응이 진행되는 8시간동안 상승하다가 19시간이 지난 후에는 조금씩 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 2(C)). PLP의 이러한 현상은 PLP를 조효소로 사용하는 tryptophan synthase 에서 나타난 현상과 동일한 현상이며 [30], 이러한 현상으로 볼 때 PLP가 반응이 진행되는 8시간 동안은 pH 변화에 의해 상태가 변화하는 것으로 예상된다. 형태가 변한 PLP가 GAD의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 PLP의 농도에 따라서 반응을 진행하며 반응시간에 따른 GABA의 농도를 정량 하였다. PLP의 농도가 높으면 pH에 의한 상태변화가 상대적으로 느리게 진행되며, 농도에 따른 결과로 상태가 변한 PLP와 GAD의 활성을 간접적으로 유추해볼 수 있다. PLP의 농도는 10 mM부터 2배씩 희석하여 0.625 mM까지 비교하였다. 그 결과 반응 초기 15시간까지는 PLP농도에 따른 상승효과는 나타나지 않았으며, 15시간 이후 PLP의 농도가 증가함에 따라 생성되는 GABA의 전환율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 이러한 결과로 미루어 볼 때 GAD 반응에 조효소로 사용되는 PLP는 pH에 의해 상태가 변화하며, 상태가 변화한 PLP는 GAD반응에 관여하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 15시간 이전에 상승효과가 크게 나타나지 않는 이유는 PLP의 농도가 GAD의 activity에는 관여하지 않고, 일정량의 이상의 존재만이 필요하기 때문인 것으로 판단된다.

Figure 3. Time curve of GABA conversion with different PLP concentration using GAD reaction system (0.1 M MSG, pH 5, 0.5 M phosphate buffer, 37°C).

3.3. pH 조절에 의한 GAD의 영향

단위시간당 높은 농도의 GABA를 생산하기 위하여 GAD반응의 pH를 조절하기 위하여 실험을 수행하였다. 대부분의 효소 반응이 완충 용액 상태에서 진행되는 이유는 완충 용액의 완충작용에 의하여 pH변화에 대응할 수 있기 때문에 사용된다. 그러나 본 연구에서 실험하는 반응계는 완충 용액의 완충허용범위를 넘어서기 때문에 GAD의 최적 pH범위를 유지하기 위해서는 외부로부터 H+의 공급이 필요하다. GAD의 반응에서 pH상승하여 활성이 떨어지는 시점에서 투입해주는 HCl의 농도에 따른 GABA의 생산량을 비교한 결과 10시간때 1.0, 1.5, 3.0 M의 HCl 농도에서 각각 574, 450, 228 mM의 GABA를 확인하였다. HCl의 농도가 중가함에 따라 생성된 GABA의 농도가 저해되는 현상은 고농도의 HCl이 GAD의 활성에 저해를 일으키게 되어 나타나는 현상으로 여겨진다. pH를 조절하기 위하여 투입한 HCl을 1 M로 사용하여 GAD반응에서 pH상승되어 활성이 떨어지는 시점에서 HCl을 넣어주었다. 대조군으로 PLP를 넣어서 반응을 진행하였으며, HCl에 PLP를 녹여서 HCl과 PLP의 중첩 효과에 대해서도 조사하였다. 그 결과 3시간에 1 ml의 전체 부피에 2 M의 HCl을 0.2 ml 넣어주었을 때, 넣어주지 않은 대조군에 비하여 생성된 GABA의 농도가 반응시간이 10시간이 지났을 때 3배 높은 600 mM로 분석되었다. PLP와 HCl을 동시에 넣어준 반응기의 경우 10시간에 780 mM의 GABA가 분석되었다. 반응 시작 3시간 때 각각 반응기의 농도는 큰 차이가 없이 비슷하였으나, 3시간 이후부터 반응 기간의 GABA농도의 차이가 커지기 시작했다. 반응기에 PLP만 넣어준 반응기는 대조군 보다 조금 높은 210 mM이 전환되었으며, 대조군은 195 mM의 GABA가 분석되었다. 초기 MSG의 농도가 1M임을 감안한다면, 최대 전환률이 80%에 도달한 결과이며, PLP와 pH의 상태가 GAD의 전환 공정에 관여하는 바가 크다는 것을 입증한 실험결과이다. GABA 전환률의 증진을 위하여 3시간 간격으로 HCl 과 PLP를 추가적으로 넣어주었으며, 최종 GABA의 농도를 높이기 위하여 HCl, PLP그리고 MSG를 동시에 넣어주며 반응기의 시간에 따른 GABA의 농도를 분석하였다. 그 결과 15시간에 HCl과 PLP를 넣어준 반응기에서 990 mM의 GABA가 생산됨을 확인하였다 (Fig. 4). HCl 와 PLP를 활용한 pH제어 모델의 생산성을 비교하기 위하여 L-glutamate와 MSG를 활용한 전환 공정을 비교하였다. L-glutamate는 낮은 용해도로 인하여 초기 농도가 20 mM 로 제약이 있으며, 각 반응의 반응종결시간 및 전환율을 비교 분석한 결과 L-glutamate를 이용한 전환 공정과 MSG를 HCl와 PLP를 이용하여 반응계의 pH를 조절한 공정의 생산효율은 각각 0.08 과 1.1 mM/min으로 나타났다 (Table 1).

Table 1 Summary of GABA productivity from L-glutamate and MSG

SubstrateL-glutamateMSG
Solubility (g/L)8.6740
Molecular weight147.13169.11
Conversion rate (%)5090
Initial substrate concentration (mM)201000
Reaction time (min)120900
Productivity (mM/min)0.081.1


Figure 4. Time curve of GABA production according to different HCl concentration, insert material and insert times.

GAD는 glutamate를 탈탄산화 하여 GABA로 전환하는 효소이다. 기질로 사용되는 glutamate는 L-glutamate와 MSG의 형태가 있으며, 두 물질의 물에 대한 용해도는 MSG가 80배 높다. 기존 연구에 따르면, GAD의 활성은 GA와 MSG에서 근사치로 유사한 활성이 나타난 연구가 있다 [31]. 이는 용해도가 높은 MSG를 사용할 경우 GABA의 생성에 좀더 유리할 것으로 여겨진다. GAD는 PLP를 조효소로 사용하며, 최적 pH는 4~5로 알려진 GAD의 탈탄산화 반응은 H+. 이온을 소비하는 반응으로 반응이 진행됨에 따라 반응계는 염기성으로 변화하게 되며, GAD의 활성을 저해하게 된다. 본 연구에서 PLP의 농도에 따라 GABA의 생성량이 증가한 결과를 확인하였다. 이는 기존 연구에서 PLP의존적으로 GABA의 생성량이 증가한 결과와 0.025, 0.05, 0.1 mM로 농도를 증가시킴에 따라 전환율이 순차적으로 증가한 결과와 유사한 결과이다 [32-34]. 본 연구에서는 대량의 GABA생산을 위하여 초기 MSG의 농도별 반응을 통하여 기질의 농도에 따른 반응시간을 확인하였으며, 반응이 진행되는 동안 염기성으로 변화하는 반응계의 상태로 인한 PLP의 변화를 확인하였다. 염기성으로 변화하는 전환 공정을 3시간 간격으로 3회 HCl과 PLP의 추가적인 공급으로 제어하였으며, 이를 통하여 1 M의 MSG를 15시간에 990 mM의 GABA로 전환하였다. 이때 사용한 HCl의 농도가 1 M에서 3 M로 증가함에 따라 GAD의 활성이 저해되는 현상이 확인되어, 반응에 1 M HCl을 사용하였다. 기존연구에서도 pH 제어를 위하여1 M의 HCl을 활용하였으며, 91.2%의 전환율에 도달하였다[31]. L-glutamate를 이용한 전환 공정과 MSG를 HCl 와 PLP를 이용하여 반응계의 pH를 조절한 공정의 생산효율은 각각 0.08 과 1.1 mM/min으로 나타났다. 이는 GAD의 활성을 유지시키기 위하여 HCl과 PLP를 활용한 새로운 방법으로, GABA의 대량생산공정을 개발하는 초석을 다질 수 있는 연구결과라고 사료된다.

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