뼈는 기관의 체내에서 장기의 보호, 혈액 생성, 미네랄 저장 및 혈중 칼슘 항상성 유지 등의 생리적 기능을 하는 중요 기관이다 [1]. 이러한 뼈의 기능 문제를 유발하는 골절, 골다공증 등의 질병은 환자의 삶의 질에 중대한 영향을 초래할 수 있는데, 특히 노년층에서의 골절은 사망률의 증가와 직접적으로 연관되어 있다 [2,3]. 최근 이러한 외부 충격에 의한 사고나 골 기능 장애를 해결하기 위한 수단으로 생체 적합성 재료로 구성된 지지체 (scaffold)에 조골세포 (osteoblast)를 탑재하여 이를 환자에 이식하려는 연구들이 활발하게 진행되고 있다 [4-6].

조골세포는 제1형 콜라겐 (type I collagen), 오스테오폰틴(osteopontin), 골 시알로프로테인 (bone sialoprotein) 등과 같은 특정 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 합성과 침착을 유도해 골 조직을 형성할 수 있는 세포로 주로 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs)로부터 분화되어 생성된다 [7,8]. MSCs의 조골세포 분화는 β-glycerol phosphate, ascorbic acid와 dexamethasone이 첨가된 골 분화 유도 배지(osteogenic medium)를 이용해 비교적 간단한 방법으로 달성될 수 있으며 [9], 분화 효율을 증가시키기 위한 여러 연구가 수행되고 있다 [10-13]. 한편, 조골세포를 수득하기 위한 다른 수단으로 최근 분화가 끝난 체세포 운명을 중간 만능 상태 (intermediate pluripotent state)를 거치지 않고 전환할 수 있는 직접 전환 (direct conversion) 연구가 활발하게 진행되고 있다 [14-18]. 그 중에서도 저분자 물질 (small molecule)을 이용한 체세포의 직접 전환은 외부 유전자를 전달하지 않는 전략으로 여러 분야에 적용되고 있다 [19-22]. 특히, 탈아세틸화 (deacetylation) 억제제인 valproic acid (VPA)는 세포핵 내 히스톤 (histone)의 탈아세틸화를 억제해 염색질 (chromatin)을 열린 형태로 유지함으로써 직접 전환의 효율을 증가시킬 수 있다고 알려져 있다 [23]. 최근 우리 연구팀은 인간 진피섬유아세포 (human dermal fibroblasts, HDFs)를 VPA가 첨가된 골 분화 유도배지에서 배양함으로써 조골세포로의 직접 전환을 유도할 수 있음을 확인한 바 있다 [24].

이러한 방식으로 획득한 조골세포는 다양한 지지체에 탑재되어 생체 내 (in vivo)로 이식될 수 있다 [25,26]. 세포를 효율적으로 탑재하기 위해 지지체는 다공성 (porosity), 투과성(permeability) 및 적합한 기계적 특성 (mechanical property)을 가지며 세포에게 조직의 미세 환경 (micro-environment)을 모방한 3차원 환경을 제공한다 [27]. 그 중에서도 마트리겔(Matrigel)은 세포 외 기질이 풍부한 기저막 기질 (basement membrane matrix)로 광범위한 유형의 세포에 3차원 배양 환경을 제공할 수 있어 여러 분야에 널리 사용되고 있다.[28,29]. 주로 라미닌 (laminin)으로 구성된 마트리겔은 제4형 콜라겐 (Type IV collagen), entactin, heparin sulfate proteoglycan perlecan 등과 함께 여러 성장 인자 (growth factor)들도 포함하고 있어 다양한 세포의 성장을 도와줄 수 있다 [30]. 그러나 마트리겔은 구성 성분이 복잡하고 불분명하며 제조 단위(lot)마다 생화학적, 기계적 특성이 일치하지 않아 연구 결과의 재현이 어렵고 매트릭스에 존재하는 알려지지 않은 세포 신호 인자로 인해 예상하지 못하는 결과가 초래될 수도 있다 [31].

젤라틴 (gelatin)은 뼈의 주요 구성성분인 콜라겐 (collagen)의 부분적 가수분해 (hydrolysis)를 통해 얻어지는 천연 물질로 콜라겐과 거의 동일한 물리화학적 특성을 갖는 한편 [32], 콜라겐이 가지고 있는 면역 원성, 병원체 전파에 대한 우려는 피할 수 있다 [33]. 또한 생분해성 (biodegradability), 생체적합성 (biocompatibility) 및 경제성에서 장점이 있어 수년간 골 재생 연구에 광범위하게 활용되어왔다 [34]. 특히, 거대 다공성 (macroporosity)을 갖는 젤라틴 지지체는 영양소 통로로써 역할을 할 수 있을 뿐 아니라 세포의 이동과 증식, 혈관 형성을 가능하게 함으로 골조직 형성에 기여할 수 있다 [35]. 본 연구에서는 골조직 재생을 위한 생체재료 지지체로써 거대 다공성 젤라틴 크리오겔의 효과를 확인하기 위해 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 (bone-marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs) 분화 및 HDFs의 직접 전환을 통한 조골세포 생성 효율을 마트리겔의 경우와 비교하였다. 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM)을 이용해 거대 기공을 확인한 젤라틴 크리오겔을 이용하여 3차원 배양환경에서 조골세포를 생성하였고 Alizarin Red S (ARS) 염색을 통해 세포 기능을 평가하였다. ARS 염색을 통해 BMMSCs 분화와 HDFs의 직접 전환 모두에서 마트리겔에 비해 젤라틴 크리오겔에서 조골세포 생성에 따른 칼슘 응집체를 형성이 증가하였음을 정량적으로 확인하였다. 이러한 결과는 세포의 조직 내 이식에 널리 사용되는 마트리겔에 비해 젤라틴 크리오겔이 BM-MSCs의 분화 및 HDFs의 직접 전환을 통해 생체 내에서 조골세포를 유도하는데 보다 유용한 생체재료 지지체로 활용될 수 있음을 시사한다.

2.1. 재료 및 세포 배양

젤라틴 크리오겔의 제작에 사용된 A형 젤라틴과 조골세포 유도에 사용된 β-glycerol phosphate, ascorbic acid, dexamethasone 그리고 VPA는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서, EDC (1-Ethyl-3-(3’-dimethylaminopropyl)carbodiimide)와 NHS(N-hydroxysuccinimide)는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 각각 구입하였다. 인간 BM-MSCs는 Promocell(Heidelberg, Germany)로부터 구입하였고, low glucose DMEM(Dulbeccós modified Eagle’s medium, Hyclone, Locan, UT, USA)에 10% FBS (fetal bovine serum, Welgene, Daejeon, Korea), GlutaMAX™ (Thermo Scientific), 5 μg/ml의 gentamicin(Thermo Scientific)을 혼합한 성장 배지를 이용해 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. HDFs (#C-004-5C)는 Thermo Scientific으로부터 구입하였고, DMEM에 10% FBS, 100 U/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin (Thermo Scientific)을 혼합한 성장 배지를 이용해 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다.

2.2. 젤라틴 크리오겔 제작

거대 다공성 젤라틴 크리오겔의 제작을 위해 3차 증류수에 A형 젤라틴을 1% w/v가 되도록 넣고 55°C에서 완전히 용해시켰다. 용해된 젤라틴 용액은 가교 결합되기 전까지 4°C에 보관하였고, EDC와 NHS는 각각 증류수에 1 M농도로 용해하여 보관하였다. 가운데가 움푹 파인 confocal dish (SPL, Pocheon, Korea)는 크리오겔의 모양을 잡아줄 틀로써 반응진행 전까지 −20°C에서 유지하였다. 차갑게 유지된 젤라틴 용액에 EDC와 NHS를 각각 최종 농도 25 mM과 50 mM이 되도록 첨가하고 이 혼합액을 차갑게 유지한 틀에 분주한 뒤, 겔화 (gelation) 및 얼음 결정이 생성되도록 −20°C에 밤새 보관하였다. 다음 날, 생성된 얼음 결정이 승화되어 거대 기공을 생성하도록 동결 건조 (lyophilization)하였고 이후 PBS(phosphate buffered saline, LPS Solution, Daejeon, Korea)을 이용해 수차례 헹궈준 뒤 보관하였다. 실험 직전 젤라틴 크리오겔은 2시간의 UV (ultraviolet ray) 조사를 통한 멸균 과정을 거쳐 사용되었다.

2.3. 젤라틴 크리오겔 특성 분석

제작된 젤라틴 크리오겔의 표면 형태와 거대 기공을 확인하기 위해 주사전자현미경 (JSM-7900F, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 가장 먼저 동결 건조를 통해 얻은 크리오겔에 20mA의 조건으로 60초 동안 약 2.5 nm 두께의 백금 (platinum)을 도금하였다. 그 다음, 전자주사현미경을 통해 5 kV 조건에서 젤라틴 크리오겔의 거대 기공을 관찰하였다.

상호 연결된 거대 기공을 가진 크리오겔의 팽윤도 (swelling ratio)를 측정하기 위해 동결건조 직후 건조된 겔의 무게를 측정하였다. 그 다음, 겔을 증류수에 담가 수화 시킨 뒤 과량의 물을 제거하고 무게를 측정하였다. 얻어진 건조 겔 무게와 수화 겔 무게를 아래 식에 적용해 팽윤도를 계산하였다.

팽윤동%=무게수화−무게건조무게건조×100

2.4. BM-MSCs의 조골세포 분화

마트리겔과 젤라틴 크리오겔을 이용해 3차원상에서 BMMSCs를 배양하며 조골세포로 분화 유도하였다. 마트리겔을 이용한 3차원 배양을 위해 1 × 10⁵개의 BM-MSCs를 마트리겔 (Matrigel^TM, Lot#0013008, Corning, Glendale, AZ, USA)과 혼합해 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 30분간 배양하여 세포 부착을 유도한 뒤, 성장 배지를 첨가하여 밤새 배양하였다. 젤라틴 크리오겔을 이용한 3차원 배양을 위해서는 1 × 10⁵개의 BM-MSCs를 소량의 성장 배지에 현탁한 뒤, 이를 멸균된 젤라틴 크리오겔 표면에 조심스럽게 접종해 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 세포 부착을 유도하였고 이후 마트리겔의 경우와 마찬가지로 성장 배지를 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 밤새 배양하였다. 두 지지체에서 밤새 배양된 BM-MSCs는 성장 배지에 10 mM β-glycerol phosphate, 50 μg/ml ascorbic acid 그리고 100 nM dexamethasone을 첨가하여 제작한 골 분화 유도 배지를 이용해 조골세포로의 분화를 유도하였고 골분화 유도 배지는 21일 동안 매 2일마다 교체되었다.

2.5. HDFs의 직접 전환을 통한 조골세포 생성

마트리겔 또는 젤라틴 크리오겔을 이용하여 HDFs를 3차원 배양하는 중, VPA처리를 통해 이를 조골세포로 직접 전환하였다. 마트리겔을 이용한 배양에서는 2 × 10⁵개의 HDFs를 마트리겔과 잘 섞어 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 30분간 겔화하였고 이후 천천히 성장 배지를 넣어 밤새 배양하였다. 젤라틴 크리오겔을 이용한 3차원 배양에서는 2 × 10⁵개의 HDFs를 소량의 성장 배지로 현탁한 뒤, 이를 멸균된 크리오겔에 조심스럽게 분주하고 37°C, 5% CO₂ 조건하에서 1시간동안 배양해 세포를 부착시켰다. 그 후, 조심스럽게 성장 배지를 넣어 밤새 배양하였다. 각 지지체에서 밤새 배양된 세포를 조골세포로 직접 전환 유도하기 위해 골 분화 유도 배지에 1mM VPA를 첨가하여 배양하였다. 이후 24일 동안 매 2일마다 새로운 배지로 교체하였다.

2.6. Alizarin Red S 염색 및 정량 분석

Alizarin Red S (Sigma-Aldrich)를 이용하여 조골세포로부터 생성된 칼슘 응집체 (mineralized calcium deposits)를 염색함으로써 생성된 조골세포 기능을 평가하였다. 각각의 지지체에서 배양된 세포를 4% paraformaldehyde로 고정하고 증류수를 이용해 수차례 헹궈주었다. 그 후, 생성된 칼슘 응집체를 2% ARS 용액으로 20분 동안 암실에서 염색하였고 다시 증류수로 수차례 헹궈주었다. 정량 분석은 Alizarin Red Staining Quantification Assay Kit (ScienCell, Carlsbad, CA, USA)의 지시를 따라 진행하였다. 가장 먼저, 염색된 지지체를 상온에서 30분동안 10% acetic acid (DAEJUNG, Siheung, Korea)에 담가 교반한 뒤, 녹아 나온 염색물을 80°C에서 10분동안 가열하고 5분 동안 얼음에서 식혀주었다. 20000×g의 조건으로 15분 동안 원심분리하여 얻어진 상층액에 10% ammonium hydroxide (Sigma-Aldrich)를 넣어 중화하였다. 마지막으로 분광 광도계를 이용해 405 nm에서 중화된 용액의 흡광도를 측정해 ARS 염색 정도를 정량적으로 비교하였다.

2.7. 통계 처리

정량적 실험들의 결과값은 평균값 ± 표준편차 (mean ± SD)로 나타냈으며 실험 군 사이의 유의성 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005) 검증을 위해 분산분석 (analysis of variance, one-way ANOVA)을 실시하였다.

3.1. 젤라틴 크리오겔 제작

젤라틴 크리오겔의 안정성은 지지체의 가교도, 가교제의 특성, 중합 반응 용액의 농도에 따라 달라 질 수 있다 [36]. 특히, 젤라틴을 기반으로 한 지지체의 경우 젤라틴의 농도 증가는 지지체의 기계적 강도 약화를 유발할 수 있으며 동결 건조로 제작된 지지체에서 가교도의 지나친 증가는 다공성 정도를 의미하는 팽윤도의 감소로 이어질 수 있다 [37,38]. 그런 이유로 젤라틴 크리오겔을 생체 내 골 재생에 활용한 이전 연구들의 결과를 바탕으로 1% (w/v) 젤라틴 용액에 25 mMEDC와 50 mM NHS를 첨가하여 겔화를 유도하였다 [11]. EDC/NHS 반응을 통해 자가 가교된 젤라틴은 −20°C 조건에서 겔화가 진행되어 얼음 결정이 형성되었고, 이후 동결 건조를 통해 얼음 결정을 제거하여 거대 다공성 젤라틴 크리오겔을 제작하였다. 주사전자현미경을 통해 젤라틴 크리오겔을 관찰한 결과, 거대 기공이 상호 연결되어 있는 다공성 구조가 확인되었다 (Fig. 1(A)). 무작위로 선정된 거대 기공의 평균 크기는 81.37 ± 10.54 μm로 나타났으며 (Fig. 1(B)), 건조 겔과 수화 겔 무게를 측정하여 계산된 젤라틴 크리오겔의 팽윤도는 827.5 ± 24.31%로 앞선 연구에서 사용된 젤라틴 크라이오겔과 유사한 수치를 보였다 (Fig. 1(C)) [11]. 이를 통해 본 연구에서 제작한 젤라틴 크리오겔이 앞선 연구에서의 크리오겔과 유사한 물리 화학적 특성을 가진다는 것을 확인하였다. 세포 지지체의 거대 기공은 생체 외 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 실험에서 영양소의 이동 외에 세포의 이동과 세포 증식에도 기여할 수 있다 [35]. 특히, 지지체의 상호 연결된 기공은 생체 내 이식에 활용될 경우, 모세혈관과 혈관 주위 조직의 성장을 가능하게 할 수 있으며 주변 뼈로부터 BM-MSCs를 끌어들여 조골세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다 [39]. 얼음 결정의 승화를 통해 생성된 거대 기공은 젤라틴 크리오겔 내 영양소의 원활한 전달과 세포 증식을 촉진하여 효과적으로 생체 내 및 생체 외 골 분화를 유도할 수 있을것으로 여겨진다.

Figure 1. Characterization of interconnected macroporous gelatin cryogel. (A) Representative SEM images of gelatin cryogel. The scaffold was observed in 50 × and 250 × magnifications. (B) Bar graph showing average size (μm) of randomly selected macropores. Error bars indicate the standard deviation (n = 7 per group) (C) Swelling ratio (%) of gelatin cryogel. The swelling ratio was calculated using the dried the swollen gel weight. Error bars indicate the standard deviation (n = 3 per group).

3.2. 젤라틴 크리오겔에서 BM-MSCs의 조골세포 분화

골조직 재생을 위한 생체재료로써 거대 다공성 젤라틴 크리오겔의 효용성을 평가하기 위해, 젤라틴 크리오겔을 이용한 3차원 배양 환경에서 BM-MSCs를 조골세포로 분화 유도하였다. BM-MSCs로부터 분화되어 생성된 조골세포가 만들어 낸 칼슘 응집체를 분석하기 전에 먼저, 세포를 포함하지 않는 무 세포 (acellular) 젤라틴 크리오겔의 ARS 염색을 통해 3차원 구조체 자체는 ARS로 유의미하게 염색되지 않음을 확인하였다 (Fig. 2(A)). 이는 골조직을 구성하는 칼슘에 특이적으로 결합하는 성질을 가지는 ARS가 젤라틴 크리오겔 자체에는 결합하지 못하고 증류수를 이용한 세척과정에서 떨어져 나갔기 때문인 것으로 여겨진다 [40,41]. 이어서 각 지지체에서의 분화 효율을 비교하기위해 마트리겔과 젤라틴 크리오겔에 각각 1 × 10⁵개의 BM-MSCs를 접종하고 21일간 골 분화 유도 배지를 이용해 조골세포 세포 분화를 유도하였다 (Fig. 2(B)). 최종적으로 생성된 칼슘 응집체를 ARS로 염색한 결과, 양쪽 모두 전체적으로 균일하게 칼슘 응집체가 형성되었으나 그 정도는 젤라틴 크리오겔의 경우에서 훨씬 높다는 것이 확인되었다 (Fig. 2(C)). 두 그룹간 칼슘 응집체 형성 정도를 정량적으로 비교한 결과는 마트리겔에 비해 젤라틴 크리오겔에서 조골세포 생성에 따른 칼슘 응집체의 형성이 12배 이상 증가하였음을 나타내었다 (Fig. 2(D)). 젤라틴 크리오겔에서의 이러한 결과에 대해서는 젤라틴의 생리화학적 특성이 세포 부착 기질로써 BM-MSCs의 조골세포 분화 기전에 영향을 주었을 가능성과 함께, 거대 기공을 가지는 크리오겔의 형태적 특성도 원인이 될 수 있다고 여겨진다. 마트리겔을 이용하여 3차원 환경에서 세포를 장기 배양할 경우 세포수가 감소한 연구 결과들이 보고된 바 있는데[29,42], 이를 통해 본 연구에서 조골세포로의 분화를 위한 장기간의 배양 중 일부 세포들이 마트리겔 지지체에서 유실되어 그 결과 칼슘 응집체의 총 생성량 저하를 유발하였을 가능성을 추론할 수 있다. 반면, 젤라틴 크리오겔의 거대 다공성 구조는 부피 대피 표면적 비율을 크게 늘려줌으로써 많은 수의 세포들이 효과적으로 부착하여 유지될 수 있어 이러한 세포 유실의 가능성이 낮을 것으로 예상된다 [43-45]. 또한 거대 다공성 구조는 각종 영양소와 성장 인자, 그리고 대사 부산물의 전달 효율을 극대화할 수 있어 BM-MSCs의 생장 및 분화에 기여할 수 있었을 것이다 [35].

Figure 2. Comparison of the effects of macroporous gelatin cryogel and Matrigel on the osteogenic differentiation of MSCs. (A) Representative images of acellular gelatin cryogel stained by ARS. (B) Schedule for the human BM-MSC differentiation in each scaffold. (C) Representative images of calcification assessment by ARS staining in Matrigel and gelatin cryogel after 21 days. (D) Relative efficiency of osteoblast differentiation in gelatin cryogel evaluated by ARS staining quantification. Statistical significance was identified using one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test in comparison to the culture in Matrigel (n = 3 per group).

3.3. 젤라틴 크리오겔에서 HDFs를 조골세포로 직접 전환

다음으로는 거대 다공성 젤라틴 크리오겔에서 HDFs의 조골세포 직접 전환을 유도하였다. 최근, 우리 연구팀은 HDFs를 2차원 배양 환경에서 VPA가 첨가된 골 분화 유도 배지를 이용하여 조골세포로 직접 전환 유도할 수 있음을 증명한 바 있다 [24]. 이 연구 결과를 바탕으로 3차원 배양 환경에서 VPA를 이용한 HDFs의 조골세포 직접 전환을 유도하기 위해 각각 2 ×10⁵개의 HDFs를 마트리겔 혹은 젤라틴 크리오겔에 접종하고 24일간 1 mM의 VPA가 첨가된 골 분화 유도 배지에서 배양하였다 (Fig. 3(A)). 생성된 유도 조골세포 (induced osteoblasts)의 기능을 평가하기 위해 ARS 염색을 수행한 결과, 마트리겔에 비해 젤라틴 크리오겔에서 더 균일하게 증가한 칼슘 응집체 형성이 관찰되었다 (Fig. 3(B)). 이 ARS 염색의 정량 분석 결과는 마트리겔에 비해 젤라틴 크리오겔에서 HDFs의 조골세포 직접 전환에 따른 칼슘 응집체 형성이 3배 이상 증가되었음을 보여주었다. (Fig. 3(C)) 이와 같은 결과는 BM-MSCs의 분화 뿐만 아니라 분화가 끝난 체세포를 직접 전환하여 조골세포를 생성하는 경우에서도 젤라틴 크리오겔이 생체 재료 지지체로써 마트리겔보다 더 높은 효율을 보인다는 것을 증명한다.

Figure 3. Comparison of the effects of gelatin cryogel and Matrigel on the direct conversion of HDFs into osteoblasts. (A) Schedule for the direct conversion of HDFs in each scaffold using osteogenic medium supplemented with VPA. (B) Representative images of calcification assessment by ARS staining in Matrigel and gelatin cryogel after 24 days. (C) Relative efficiency of direct conversion into osteoblasts in gelatin cryogel evaluated by ARS staining quantification. Statistical significance was identified using one-way ANOVA with Tukey’s post hoc test in comparison to the culture in Matrigel (n = 3 per group)

본 연구에서는 −20°C 조건에서 EDC/NHS 반응을 통해 젤라틴을 자가 가교 시켰고 이를 동결 건조함으로써 거대 다공성 젤라틴 크리오겔을 제작하였다. 주사전자현미경을 통해 이크리오겔 내 상호 연결된 거대 기공을 확인하였고 건조, 수화 무게를 통해 겔의 특성을 분석하였다. 제작된 젤라틴 크리오겔의 골조직 재생 생체 재료로의 효용성을 평가하기 위해 인간 BM-MSCs의 조골세포 분화 및 HDFs의 조골세포 직접 전환을 젤라틴 크리오겔에서 유도하였고 이를 세포의 조직 내 이식을 위해 널리 사용되는 수화겔인 마트리겔에서와 비교하였다. ARS 염색을 통해 조골세포 기능에 의한 칼슘 응집체 형성을 분석한 결과, BM-MSCs의 분화 및 HDFs의 직접 전환을 통한 조골세포의 생성이 마트리겔에 비해 젤라틴 크리오겔에서 유의미하게 향상되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 줄기세포 분화 혹은 체세포 직접 전환을 통해 조골세포를 생성함으로써 골다공증과 같은 골 질환을 치료하려는 재생의학 기술 개발에 있어 생체 내 세포 이식을 위한 지지체로써 젤라틴 크리오겔의 효용성을 보여준다.

This study was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science and ICT(NRF- 2021R1A2C1010865).