Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2021; 36(4): 285-295
Published online December 31, 2021 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.4.285
Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.
Sun Il Seo1, Jae Won Ryu2, and Si Wouk Kim2*
1Center for Industrialization of Agricultural and Livestock Microorganisms (CIALM), Jeongeup 56212, Korea
2Department of Environmental Engineering, Chosun University, Gwangju 61452, Korea
Correspondence to:Tel: +82-62-230-6649
E-mail: swkim@chosun.ac.kr
Harmful algal blooms (HABs) is a rapid increase or accumulation in the population of harmful microalgae in freshwater and marine aquatic system, and can harm the health of the environment, plants or animals. Conventional chemical and physical techniques to mitigate HABs such as chlorination, ozonation, ultrasonic treatment, and clay-based flocculation are limited by the low efficiency and risk of destroying the aquatic ecosystems. Therefore, host-specific virus-like particles (VLPs) as an alternative biological method for the efficient control of harmful microalgae that can be combined with chemically synthesized algicidal compound has been successfully performed in this lab. This system was efficient for algicidal activity but also involved several significant disadvantages such as difficult purification and less production rate. To overcome these issues, we attempted to develop a low-cost, constitutive overexpression, and easy purification system of viral capsid protein to obtain large amounts VLPs. The capsid protein of HcRNAV34 as a singlestranded RNA virus that infects the toxic dinoflagellate, Heterocapsa circularisquama, was successfully expressed in E. coil without inducer. The maximal condition for production of HcRNAV34 capsid protein in the E. coil BL21(DE3) was optimized, and then finally 3.25 g/ℓ (wet weight) cell mass was obtained from 30 L reactor containing M9 medium at 37oC for 20 h. The expressed insoluble capsid protein was partially purified by low speed centrifugation and labelled with green fluorescent FITC. The resulting protein was visualized on the cell surface of H. circularisquama 9433 and 92-1, the hosts of native HcRNAV34 virus. In addition, HcRNAV34 VLPs absorbed with TD49 as algicidal substance showed a high algicidal effect against H. circularisquama 9433 and 92-1 in a host-specific manner. This host target-specific VLPs can be used for the management of HABs in aquatic ecosystems.
Keywords: harmful algal bloom, Heterocapsa circularisquama, HcRNAV virus, capsid protein, virus-like particles
유해조류의 대번식 (Harmful algal bloom, HAB)은 담수와 해수 생태계에서 유해조류 개체수의 급속한 증가나 축적을 의미하며, 환경, 식물 또는 동물 건강에 해를 끼칠 수 있다. HAB는 수중 산소를 고갈시키고, 주변 대기를 오염시키며, 물리적으로 어류의 아가미를 막히게 하고, 동물이나 인간에게 위험한 독소를 생산한다 [1-3]. HAB는 전 세계 해변 유역에서 발생하는 빈도가 높아지면서 전 지구적인 이슈가 되고 있다 [4-6]. 염소 처리, 오존 처리, 초음파 조사, 명반 또는 황산동 살포, 그리고 황토 살포 등과 같은 HAB를 제거하기 위한 재래식 물리화학적 기술 등은 효율이 높지 못하고 수중 생태계를 파괴하는 문제가 있다. 따라서 박테리아, 원생동물, 그리고 미세조류 바이러스를 이용하는 생물학적 대체기술이 제시되고 있다 [7-9]. 이 가운데 조류 바이러스는 수중 생태계에 가장 풍부해서 물 1 ml당 106-108개 정도 포함되어 있으며, 원생생물에 감염하는 40 여종의 바이러스가 분리되어 그 특성이 밝혀졌다 [10].
유해조류인
이전 실험에서 HcRNAV34의 캡시드 단백질을 대장균에서 발현/정제한 다음
상시발현 벡터인 pHCE 벡터 4종(pHCE::IA, pHCE IIA, pHCE IB, pHCE II B vector)에 HcRNAV34 유전자를 클로닝하였다. 10 X ligation buffer (300mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP, pH 7.8)에 각각의 HcRNAV34 insert DNA와 T4 DNA ligase 1 unit을 첨가하여 총 반응액 부피를 10
HcRNAV34 캡시드 단백질의 최적발현 조건을 탐색하기 위해 배양온도 및 발현시간을 조절하였다. pHCE-HcRNAV34 플라스미드를 포함한 재조합 대장균을 배양온도 30, 37, 그리고 40°C에서 각각 16시간 동안 배양하면서 캡시드 단백질의 발현을 유도하였고, 생장단계에 따른 캡시드 단백질의 발현 정도를 확인하기 위하여 재조합 대장균을 24시간 동안 배양하였다. 각각의 재조합 대장균 배양액을 3시간 간격으로 채취하였으며, 각 시간별 캡시드 단백질 발현 양상을 12%(w/v) SDS-PAGE에서 비교하였다.
2.2.2.재조합 pHCE-HcRNAV34를 다양한
재조합 pHCE-HcRNAV34가 포함된 대장균 배양은 고가의 배지인 LB medium을 주로 사용하나 대량배양을 위해서는 경제성을 고려할 때 무기이온과 glucose로 구성된 M9 mineral medium을 사용하는 것이 유리하다고 판단하였다. M9 mineral medium의 조성 중 glucose, magnesium, calcium 농도에 따른 단백질 발현양의 변화를 조사하였고, 최소 영양배지인 M9 mineral medium에서는 배양 속도가 느릴 것으로 예상되어 이 배지에 yeast extract, tryptone을 농도별로 첨가하여 발현양상을 확인한 후 최적 배지 조성을 결정하였다.
앞선 실험에서 도출해 낸 최적조건을 기반으로 하여 30
pHCE-HcRNAV34(His-tagging) 캡시드 단백질을 발현시킨 후 Ni-NTA column chromatography를 이용하여 정제하였다.
pHCE-HcRNAV34를 포함한 플라스미드는 대장균에서 대량 발현 시 대부분이 inclusion body를 형성하여 aggregation되는 것으로 확인되었다. 이러한 불용성 HcRNAV34 캡시드 단백질을 정제하기 위해 물리적 원심분리 방법을 이용하였다. 즉, 원심분리기의 중력가속도 값을 조절하여 침전시키는 단순한 방법으로 비교적 고순도의 캡시드 단백질을 정제할 수 있을 것으로 예상하였다. 균체 wet wt. 10 g에 lysis buffer 30 ml를 넣고 Sonicator (Branson Sonifier 250)로 파쇄한 후 4°C, 10,000 × g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 불용성 캡시드 단백질이 포함된 pellet을 lysis buffer로 재현탁하였다. 재현탁한 불용성 단백질 시료를 4°C에서 원심분리 하되 속도를 150~7,500 × g로 조절하였다. Low speed로 원심분리할 경우 파쇄되지 않은 cell debris는 pellet으로 침전되고, 상층액에 단백질이 포함되어 있을 것으로 예측하였다.
2.5.2. Trypsin을 이용한 HcRNAV34 VLP의 proteolysisAggregation 상태인 HcRNAV34 VLPs를 denaturation 시키는 것 보다는 digestion 하여 작은 입자로 만들기 위한 목적으로펩타이드 c-terminal의 lysin과 arginine을 선택적으로 절단하는 trypsin을 이용하여 limited proteolysis을 수행하였다. 정제된 HcRNAV34 VLPs에 0.1% trypsin과 2X reaction buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM CaCl2, pH 8.0, at 25°C)를 처리한 후 반응 12시간까지는 2시간 일정한 간격으로 반응액을 채취하면서 최종 24시간까지 반응시켰다. 이를 통해 aggregated VLPs가 digestion되는지 여부를 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
2.5.3. HcRNAV34 VLPs의 FITC 표지부분 정제된 HcRNAV34 VLPs에 FITC를 표지하기 위하여 trypsin과 2X reaction buffer를 처리하고 6시간 동안 반응하였다. Digestion된 HcRNAV34 VLPs 용액에 100 mM FITC 100
FITC가 표지된 HcRNAV34 VLPs의 숙주 특이성 관찰을 위해 숙주인
정제된 HcRNAV34 VLPs에 유기합성 살조물질인 Thiazolidinedione(TD49)를 흡착하기 위해 trypsin을 이용하여 digestion을 유도하였다 [13]. HcRNAV34 VLPs에 trypsin과 2X reaction buffer를 처리한 후 6시간 동안 반응하여 digestion을 확인한 뒤, 167
VLP에 흡착된 살조물질 TD49를 정량하기 위해 Agilent사의 1200 series HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석 시 column은 Agilent Zorbax SB C-18 column을 사용하였으며, Diode Array Detector (DAD)를 이용하였고, 분석 온도는 30°C로 하였다. 이동상으로는 (A) 10% acetonitrile (ACN), 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)와 (B) 100% ACN, 0.1% TFA를 이용하여 linear gradient (0~3분 A 100%, 3~33분 A 100%→0%, 33~40분 A 0%)를 걸어주었다. 유량은 1.0 ml/min로 조절하였고, UV검출 파장은 340 nm의 조건에서 분석하였다.
2.5.7. 살조물질 TD49가 흡착된 HcRNAV34 VLP 숙주 특이성 살조효과TD49가 흡착된 HcRNAV34 VLPs를 이용하여 유해조류에 대한 숙주 특이성을 관찰하였다. HPLC 분석을 통해 VLP에 흡착된 TD49 존재여부를 확인하고, 숙주 특이성 살조효과를 관찰하기 위해 숙주인
HcRNAV34 캡시드 단백질의 유전자는 GenBank (Accession No. AB218608)로부터 얻은 nucleotide sequence를 기반으로 codon optimization한 후 화학적으로 합성되었으며, 이 유전자는 pUC57 vector에 클로닝되었다 (Genscript, Piscataway, NJ, USA). 전체 크기의 HcRNAV34 캡시드 유전자를 내포하고 있는 DNA fragment (1,087 bp)는 PCR로 증폭된 후 (Fig. 1(A)) 다시 상시발현 벡터인 pHCE expression vector (Bioleaders, South Korea)에 제한효소
발현조건을 최적화하기 위해 몇 가지 요소 즉, 배양온도, 배양시간,
HcRNAV34 단백질을 대장균에서 발현시킬 경우 대부분이 inclusion body로 형성되는 것으로 알려져 있다 [18]. Inclusion body 형성율을 낮추기 위하여 가장 많이 이용되는 것이 저온 배양방법이다. 따라서 본 실험에서도
본 실험에 사용한 pHCE 발현시스템은 HCE promoter를 이용하는 상시발현 벡터이다. 특히 HCE promoter의 경우 대장균 배양 초기부터 높은 수준의 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다 [19]. 본 연구에서 수행할 HcRNAV34 캡시드 단백질의 대량발현을 위해서는 배양시간에 따른 단백질 발현이 중요한 인자이다. 재조합
일반적으로 LB medium이
재조합
상시발현 벡터를 이용한 캡시드 단백질 발현은 대부분 불용성 단백질의 형태로 발현되고 있으며, 수용성 캡시드 단백질 발현을 위하여 많은 연구가 진행되고 있지만 아직 그 결과는 만족스럽지 못한 수준이다 [20]. pHCE IA-HcRNAV34를 사용한 본 연구의 재조합 대장균에서도 대부분의 캡시드 단백질은 불용성으로 발현되었다. 본 연구에서는 이렇게 불용성으로 발현된 다량의 캡시드 단백질을 쉽게 정제하여 직접 VLP로 이용하기 위한 새로운 방법을 개발하고자 하였다. 본 연구의 재조합 대장균에 의해서 발현된 불용성 캡시드 단백질은 균체를 파쇄하였을 때 aggregation 되는 특징을 나타내었고, 육안으로 확인이 가능한 상당한 크기의 particle을 형성하였다. 따라서 이들 particles을 원심분리기의 중력가속도 값을 조절하여 침전시키면 비교적 고순도의 캡시드 단백질을 정제할 수 있을 것으로 예상하였다. M9 배지 (0.2% glucose, 1 mM MgSO4, 그리고 0.1 mM CaCl2) 20 l가 들어있는 30 l 배양기에서 회수한 균체 wet wt. 10 g에 lysis buffer 30 ml를 넣고 Sonicator로 파쇄한 후 4°C에서 10,000 × g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 불용성 캡시드 단백질이 포함된 pellet을 lysis buffer에 재현탁하였다. 재현탁한 불용성 단백질 시료를 4°C에서 원심분리 하되 속도를 150~7,500 × g로 조절하였다. Low speed로 원심분리할 경우 파쇄되지 않은 cell debris는 pellet으로 침전되고, 상층액에 단백질이 포함되어 있을 것으로 예측하였다. 150 × g로 원심분리하였을 때 상층액에서 재현탁한 전체 단백질 중 불용성 단백질이 약 80% 정도가 회수되었으며, 이때 약 90% 이상의 순도를 가진 캡시드 단백질 (38 kDa)이 정제되었다. 반면 1,000 × g에서는 전체 단백질의 약 50%가 회수되었으며, 7,500 × g에서는 20% 미만의 단백질이 회수되었다. 이렇게 정제된 HcRNAV34 캡시드 단백질에 살조물질을 탑재하여 숙주조류에 이적으로 결합하는지 등의 실험에 사용하였다.
Virus-like particle (VLPs)은 하나 또는 그 이상의 바이러스 캡시드 단백질로 구성되며, 적절한 숙주 특이성을 갖는 자연에 존재하는 virion과 유사하다. 그러나 VLPs는 DNA 유전물질을 내포하지 않기 때문에 세포 내에서 증식할 수 없다. 이러한 이유로 VLPs를 적절한 구조체로 형성한 후 그 내부에 여러 화합물이나 펩타이드를 탑재하여 nanocarrier로 이용하려는 연구가 많이 수행되었다[15,16]. 본 연구는 살조물질을 특정 유해조류를 타겟으로 하는 조류 VLPs에 탑재한 후, 수 생태계에 살포하여 유해조류를 제거하는 것을 목표로 하고있다.
이러한 VLPs는 dissociation/reassociation buffer의 조성 변화를 이용하여 monomer형태인 capsomer로의 분해 및 재조립이 가능하다. 이와 같은 과정을 통하여 캡시드 내부에 특정 물질을 흡착할 수 있는 것으로 알려져 있다 [21,22]. 그러나 덩어리 형태의 불용성 캡시드 단백질의 경우 물질 흡착에 상당한 제약을 가지고 있다. 본 연구에서는 불용성으로 발현된 캡시드 단백질에 비록 수율은 낮지만 직접 살조물질을 흡착하기 위하여 trypsin 효소를 이용하여 단백질을 무작위로 분해한 후 재조립하는 과정에서 특정 물질을 흡착할 수 있는지 그 가능성을 조사하였다. 정제된 HcRNAV34 VLPs 용액에 trypsin과 2X reaction buffer를 처리한 후 37°C에서 24시간 동안 반응하였다. 일정한시간 간격으로 일정량의 반응액을 채취하여 12% (W/V) SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 38kDa의 HcRNAV34 VLPs는 반응 4시간까지 20% 정도 분해되는 것을 확인하였으나, 그 이후에는 더 이상 분해되지 않았다. 이렇게 준비된 6시간 반응액에 표지물질인 FITC와 살조물질 TD49의 탑재 가능성을 조사하였다.
다음으로 이렇게 만들어진 VLPs가 적절한 숙주에 특이적으로 결합하는 능력이 있는지 조사하였다. 먼저 VLPs를 fluorescein isothiocyanate (FITC)로 표지하였다. FITC는 자외선 영역에서 녹색 형광을 나타내는 물질로 만일 FITC가 표지된 VLPs가 특정 숙주 조류에 결합한다면 조류 표면에 녹색 형광이 나타남으로써 결합 여부를 확인할 수 있다. 앞서 부분정제된 HcRNAV34 VLP를 trypsin으로 37°C에서 6시간 동안 digestion시킨 200 μL에 100 mM의 FITC 100 ml를 주입하여 1시간 동안 교반하였다. 반응 후 10 K dialysis cassette를 이용해 4°C에서 3일 동안 빛이 차단된 상태로 dialysis를 수행하였다. Dialysis 과정은 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0)를 사용하였으며, 12시간 간격으로 buffer를 교체해주었다. Dialysis 과정이 끝난 후 10 K Centricon으로 표지되지 않은 FITC는 제거하였다.
3.6.2. 표지된 VLPs의 숙주특이적 결합FITC가 표지된 HcRNAV34 VLP를 유해조류와 반응시켜 숙주에 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위해 4종의 유해조류를 이용하여 실험하였다. HcRNAV34의 숙주로는
여과 살균된 F/2 배지를 이용하여 세 번의 washing 과정을 거쳐 잔여 FITC를 제거하였다. 살아있는 조류 세포는 chlorophyll를 가지고 있어 붉은색 형광을 나타내며, FITC가 표지된 HcRNAV34 VLP가 결합하게 되면 녹색형광을 나타나게 된다. 이와 같은 특징을 이용하여 형광현미경을 통해 숙주에 대한 HcRNAV34 VLP의 숙주 특이적 결합을 관찰하였다. 그 결과 숙주인
HPLC를 통해 HcRNAV34 VLP의 살조물질 TD49 흡착율을 확인하고, 유해조류에 대한 숙주 특이적 살조효과를 관찰하였다. Reaction buffer에 정제된 HcRNAV34 VLP와 trypsin을 넣고 6시간 동안 반응시킨 후 일부 VLP가 digestion된 상태에서 TD49를 첨가하고 3시간 동안 반응시켜 살조물질을 흡착시켰다. 그 후 dialysis를 수행하여 TD49의 흡착 유무를 HPLC로 분석하였다. 그 결과 초기에 처리해준 농도 대비 약 40% 정도의 TD49가 HcRNAV34 VLPs에 흡착된 것으로 분석되었다. 살조물질을 흡착한 VLPs를 이용해 유해조류 살조 실험을 수행하였다. 사용한 유해조류는 숙주 조류인
사용한 네 종류의 상시발현 벡터에 HcRNAV34 gene을 클로닝한 후 대장균에 형질전환하여 발현을 유도한 결과 재조합 pHCE IA-HcRNAV34에서 가장 높은 단백질 (38 kDa) 발현양을 보였다. 재조합 pHCE IA-HcRNAV34 캡시드 단백질의 발현조건을 탐색한 결과, 배양온도 37°C, 배양시간 16~18시간에서 높은 발현양을 보였다.
이 연구는 한국연구재단 중견연구과제 연구비 (NRF-2018R1A2B2001006)의 지원으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.
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