유해조류의 대번식 (Harmful algal bloom, HAB)은 담수와 해수 생태계에서 유해조류 개체수의 급속한 증가나 축적을 의미하며, 환경, 식물 또는 동물 건강에 해를 끼칠 수 있다. HAB는 수중 산소를 고갈시키고, 주변 대기를 오염시키며, 물리적으로 어류의 아가미를 막히게 하고, 동물이나 인간에게 위험한 독소를 생산한다 [1-3]. HAB는 전 세계 해변 유역에서 발생하는 빈도가 높아지면서 전 지구적인 이슈가 되고 있다 [4-6]. 염소 처리, 오존 처리, 초음파 조사, 명반 또는 황산동 살포, 그리고 황토 살포 등과 같은 HAB를 제거하기 위한 재래식 물리화학적 기술 등은 효율이 높지 못하고 수중 생태계를 파괴하는 문제가 있다. 따라서 박테리아, 원생동물, 그리고 미세조류 바이러스를 이용하는 생물학적 대체기술이 제시되고 있다 [7-9]. 이 가운데 조류 바이러스는 수중 생태계에 가장 풍부해서 물 1 ml당 10⁶-10⁸개 정도 포함되어 있으며, 원생생물에 감염하는 40 여종의 바이러스가 분리되어 그 특성이 밝혀졌다 [10].

유해조류인 Heterocapsa circularisquama에 감염하여 파괴하는 single-stranded RNA virus인 HcRNAV는 H. circularisquama가 대번식하는 유역의 바닥 침전물에서 발견되었다 [11,12]. 독성이 있는 H. circularisquama의 대번식으로 양식조개, 홍합, 굴 등이 대량으로 폐사하였다. 살조 바이러스는 HAB를 생물학적으로 제어하기 위한 잠재적으로 중요한 방법이지만, 천연 바이러스를 조류가 대번식할 때 대량으로 살포하는 것은 바이러스의 번식으로 인해 수생생태계에 추가 교란을 일으킬 수도 있다 [8]. 이러한 이유로 인해 본 연구실은 하나 또는 그 이상의 바이러스 캡시드 단백질로 구성된 바이러스 유사입자 (virus-like particles, VLPs)를 사용하였다 [13]. 합성 VLPs는 숙주특이성을 갖는다는 점에서 천연 바이러스와 유사하지만 유전물질을 가지고 있지 않기 때문에 세포내에서 증식할 수 없다. 지난 수십년 동안 VLPs는 외부 화합물이나 펩타이드 물질을 적절한 구조 안에 넣어 운반하기 위한 나노입자로 지속적으로 이용되어왔다 [14-16]. 잠재적인 살조물질로 알려진 thiazolidinedione 49(TD49)를 VLPs에 넣어 특정 형태의 유해조류에 감염시킨 후 살조하기도 하였다 [17].

이전 실험에서 HcRNAV34의 캡시드 단백질을 대장균에서 발현/정제한 다음 in vitro에서 자가조립시킨 후 TD49의 운반체로 사용하였다. 흥미롭게도 TD49를 내포한 VLPs는 천연 HcRNAV34 바이러스와 동일한 숙주특이성을 보여 H. circularisquama의 생장을 억제하였다 [13]. 대장균 과발현 시스템에서, 코돈이 최적화된 합성 HcRNAV34 캡시드 유전자를 pBTX1벡터에 클로닝하였으며, 이 때 이 벡터는 캡시드 단백질의 C-말단에서 self-cleaving affinity tag으로 작용하는 chitin-binding domain과 결합된 intein을 포함하고 있었다. 이 시스템에서 80% 이상의 캡시드 단백질이 soluble 형태로 성공적으로 발현하였다. 하지만 이론적으로 이 시스템은 성공적이라고 할 수 있었으나 몇 가지 중요한 결점을 가지고 있었다. 즉, 이 시스템은 고가의 IPTG inducer를 필요로 하고, 소량 (전체 단백질의 20% 미만)의 단백질만 발현하였다. 그리고 대장균을 18°C에서 배양하기 때문에 균체량도 적었다. 또한 이 시스템은 affinity column chromatography로 VLP를 정제하기 때문에 고가이면서 시간이 많이 소요되기도 하였다. 따라서 본 연구는 HAB의 대번식을 억제할 수 있는 생물 제어자로써의 VLP로 HcRNAV34 캡시드 단백질을 사용하되, 상시 발현되고, 균체량이 많으며, 저가로 쉽게 단백질을 정제할 수 있는 시스템을 개발하고자 하였다.

2.1. HcRNAV34 발현 vector 제작 및 형질전환

상시발현 벡터인 pHCE 벡터 4종(pHCE::IA, pHCE IIA, pHCE IB, pHCE II B vector)에 HcRNAV34 유전자를 클로닝하였다. 10 X ligation buffer (300mM Tris-HCl, 100mM MgCl₂, 100 mM DTT, 10 mM ATP, pH 7.8)에 각각의 HcRNAV34 insert DNA와 T4 DNA ligase 1 unit을 첨가하여 총 반응액 부피를 10 μL로 한 후 4°C에서 16시간 동안 반응시켜 ligation 반응을 수행하였다. Calcium chloride를 이용하여 제조한 각각의 competent cell에 반응이 완료된 DNA 10 μL를 첨가하고 얼음에 30 분간 방치한 후 42°C에서 80 초 동안 heat shock을 주었다. 다시 얼음 속에서 2분간 방치한 후 900 μL LB medium을 넣고 37°C에서 35분간 배양하였다. 배양액 100 μL을 ampicillin (100 μg/ml)이 첨가된 1.5% LB agar plate에 도말평판하여 37°C에서 배양한 후 형질전환된 대장균을 선별하였다. 재조합 대장균으로부터 ligation 된 플라스미드 DNA를 Nde I, Hind III 제한효소를 처리하고 37°C에서 2시간 동안 반응한 후 1%(w/v) agarose gel를 이용한 전기영동을 통해 HcRNAV34 유전자의 존재여부를 확인하였다.

2.2. 배양조건에 따른 pHCE-HcRNAV34 VLP의 발현

HcRNAV34 캡시드 단백질의 최적발현 조건을 탐색하기 위해 배양온도 및 발현시간을 조절하였다. pHCE-HcRNAV34 플라스미드를 포함한 재조합 대장균을 배양온도 30, 37, 그리고 40°C에서 각각 16시간 동안 배양하면서 캡시드 단백질의 발현을 유도하였고, 생장단계에 따른 캡시드 단백질의 발현 정도를 확인하기 위하여 재조합 대장균을 24시간 동안 배양하였다. 각각의 재조합 대장균 배양액을 3시간 간격으로 채취하였으며, 각 시간별 캡시드 단백질 발현 양상을 12%(w/v) SDS-PAGE에서 비교하였다.

재조합 pHCE-HcRNAV34를 다양한 E. coli strains BL21(DE3), ROSSETA, DH5α 및 TOP10 숙주에서 형질전환 하였다. 각각의 재조합 대장균을 ampicillin (100 μg/ml)이 포함된 50 ml LB medium에 접종하고, 37°C에서 16시간 동안 배양하면서 발현을 유도한 후, 12% (w/v) SDS-PAGE를 통해 발현양이 높은 균주를 최적의 단백질 발현 E. coli strain으로 결정하였다.

재조합 pHCE-HcRNAV34가 포함된 대장균 배양은 고가의 배지인 LB medium을 주로 사용하나 대량배양을 위해서는 경제성을 고려할 때 무기이온과 glucose로 구성된 M9 mineral medium을 사용하는 것이 유리하다고 판단하였다. M9 mineral medium의 조성 중 glucose, magnesium, calcium 농도에 따른 단백질 발현양의 변화를 조사하였고, 최소 영양배지인 M9 mineral medium에서는 배양 속도가 느릴 것으로 예상되어 이 배지에 yeast extract, tryptone을 농도별로 첨가하여 발현양상을 확인한 후 최적 배지 조성을 결정하였다.

2.3. 30 L 발효기를 이용한 HcRNAV34 캡시드 단백질 생산

앞선 실험에서 도출해 낸 최적조건을 기반으로 하여 30 l 발효기를 이용한 HcRNAV34 캡시드 단백질을 대량생산 하였다. pHCE-HcRNAV34를 포함한 E. coli BL21(DE3)를 ampicillin(100 μg/ml)이 포함된 200 ml LB medium에서 37°C로 12시간 동안 전 배양하였다. 30 l 발효기에 20 l LB medium를 넣고 멸균한 뒤 ampicillin (100 μg/ml)과 전 배양한 배양액 1%를 접종하고 37°C에서 200 rpm, 1 vvm의 공기를 주입하여 20시간 동안 배양하였다. 최적 발현시간과 발현양을 알아보기 위해 접종 후 4시간 간격으로 배양액을 회수하였다. 회수한 균체를 600 nm 파장에서 흡광도를 확인하고, 원심분리하여 파쇄한 후 12% (w/v) SDS-PAGE를 이용하여 단백질 발현여부를 확인하였다.

2.4. pHCE-HcRNAV34 캡시드 단백질 정제

pHCE-HcRNAV34(His-tagging) 캡시드 단백질을 발현시킨 후 Ni-NTA column chromatography를 이용하여 정제하였다. E. coli 균체 10 g을 원심분리하여 회수한 후, 8 M urea가 포함된 buffer A (8 M urea, 20 mM Tri-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0)에 현탁시켜 denaturation을 유도한 다음 파쇄하였다. 세포파쇄액을 원심분리한 후 soluble fraction을 Ni-NTA resin이 충진되어 있는 open column에 붓고 column의 10배 용량의 washing buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)을 흘려주었다. 충분한 washing이 이루어 진 후 elution buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 200 mM imidazole, pH 8.0.)로 결합되어 있던 HcRNAV34 캡시드 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질을 12% (w/v) SDS-PAGE를 통해 확인한 후, imidazole을 제거하기 위해 cut off 3.5 K dialysis cassette를 이용하여 dialysis buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0)에서 투석하였다. 정제된 HcRNAV34 단백질을 다양한 종류의 단백질 정제방법의 positive control로 사용하였다.

2.5. HcRNAV34 불용성 캡시드 단백질 정제

pHCE-HcRNAV34를 포함한 플라스미드는 대장균에서 대량 발현 시 대부분이 inclusion body를 형성하여 aggregation되는 것으로 확인되었다. 이러한 불용성 HcRNAV34 캡시드 단백질을 정제하기 위해 물리적 원심분리 방법을 이용하였다. 즉, 원심분리기의 중력가속도 값을 조절하여 침전시키는 단순한 방법으로 비교적 고순도의 캡시드 단백질을 정제할 수 있을 것으로 예상하였다. 균체 wet wt. 10 g에 lysis buffer 30 ml를 넣고 Sonicator (Branson Sonifier 250)로 파쇄한 후 4°C, 10,000 × g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 불용성 캡시드 단백질이 포함된 pellet을 lysis buffer로 재현탁하였다. 재현탁한 불용성 단백질 시료를 4°C에서 원심분리 하되 속도를 150~7,500 × g로 조절하였다. Low speed로 원심분리할 경우 파쇄되지 않은 cell debris는 pellet으로 침전되고, 상층액에 단백질이 포함되어 있을 것으로 예측하였다.

Aggregation 상태인 HcRNAV34 VLPs를 denaturation 시키는 것 보다는 digestion 하여 작은 입자로 만들기 위한 목적으로펩타이드 c-terminal의 lysin과 arginine을 선택적으로 절단하는 trypsin을 이용하여 limited proteolysis을 수행하였다. 정제된 HcRNAV34 VLPs에 0.1% trypsin과 2X reaction buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM CaCl₂, pH 8.0, at 25°C)를 처리한 후 반응 12시간까지는 2시간 일정한 간격으로 반응액을 채취하면서 최종 24시간까지 반응시켰다. 이를 통해 aggregated VLPs가 digestion되는지 여부를 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

부분 정제된 HcRNAV34 VLPs에 FITC를 표지하기 위하여 trypsin과 2X reaction buffer를 처리하고 6시간 동안 반응하였다. Digestion된 HcRNAV34 VLPs 용액에 100 mM FITC 100 μL를 주입하여 상온에서 1시간 동안 천천히 교반하고, 10 K dialysis cassette (Thermo)를 이용하여 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0.)로 4°C에서 3일 동안 dialysis 하였다. 반응 후 10 K Centricon (Sartorius)을 이용하여 농축하였고, FITC가 표지된 HcRNAV34를 12% SDS-PAGE gel에 전기영동 한 후 UV-visible lamp을 이용하여 FITC의 형광을 확인하였다.

FITC가 표지된 HcRNAV34 VLPs의 숙주 특이성 관찰을 위해 숙주인 H. circularisquama HU9433-P과 HA92-1, 그리고 숙주가 아닌 H. circularisquama HY9423과 Heterosigma akashiwo 4종의 조류를 사용하였다. FITC가 표지된 HcRNAV34 VLP 용액과 각각의 조류 배양액을 1 : 4의 비율로 혼합하고, 접촉시간을 늘리기 위해 교반기로 3시간 동안 천천히 교반하며 반응시켰다. 반응이 끝난 후 150 X g에서 3분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였고, F/2 배지로 2 번의 washing 단계를 거쳐 잔여 FITC를 제거하였으며, F/2배지 100 μL에 재현탁한 후 형광현미경을 통해 숙주에 대한 HcRNAV34 VLP의 숙주 특이성을 관찰하였다.

정제된 HcRNAV34 VLPs에 유기합성 살조물질인 Thiazolidinedione(TD49)를 흡착하기 위해 trypsin을 이용하여 digestion을 유도하였다 [13]. HcRNAV34 VLPs에 trypsin과 2X reaction buffer를 처리한 후 6시간 동안 반응하여 digestion을 확인한 뒤, 167 μM의 TD49를 첨가하여 반응시킨 후 dialysis 과정을 수행하였다. Dialysis 과정은 10 K dialysis cassette (Thermo)를 이용하여 4°C에서 3 일 동안 수행하였고, dialysis 중 쉽게 aggregation되는 성질을 이용하여 TD49가 흡착되었는지 HPLC를 통해 확인하였다.

VLP에 흡착된 살조물질 TD49를 정량하기 위해 Agilent사의 1200 series HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석 시 column은 Agilent Zorbax SB C-18 column을 사용하였으며, Diode Array Detector (DAD)를 이용하였고, 분석 온도는 30°C로 하였다. 이동상으로는 (A) 10% acetonitrile (ACN), 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)와 (B) 100% ACN, 0.1% TFA를 이용하여 linear gradient (0~3분 A 100%, 3~33분 A 100%→0%, 33~40분 A 0%)를 걸어주었다. 유량은 1.0 ml/min로 조절하였고, UV검출 파장은 340 nm의 조건에서 분석하였다.

TD49가 흡착된 HcRNAV34 VLPs를 이용하여 유해조류에 대한 숙주 특이성을 관찰하였다. HPLC 분석을 통해 VLP에 흡착된 TD49 존재여부를 확인하고, 숙주 특이성 살조효과를 관찰하기 위해 숙주인 H. circularisquama HU9433-P과 HA92-1, 그리고 숙주가 아닌 H. circularisquama HY9423과 Heterosigma akashiwo 4종의 조류를 사용하였다. Control은 HcRNAV34가 클로닝 되지 않은 pHCE 공벡터를 사용하였다.

3.1. pHCE-HcRNAV34 VLP의 클로닝

HcRNAV34 캡시드 단백질의 유전자는 GenBank (Accession No. AB218608)로부터 얻은 nucleotide sequence를 기반으로 codon optimization한 후 화학적으로 합성되었으며, 이 유전자는 pUC57 vector에 클로닝되었다 (Genscript, Piscataway, NJ, USA). 전체 크기의 HcRNAV34 캡시드 유전자를 내포하고 있는 DNA fragment (1,087 bp)는 PCR로 증폭된 후 (Fig. 1(A)) 다시 상시발현 벡터인 pHCE expression vector (Bioleaders, South Korea)에 제한효소 NdeI과 HindIII를 이용하여 subcloning되어 최종적으로 HCE-HcRNAV34로 만들어졌다(Fig. 1(B)). 본 실험은 pHCE-HcRNAV34(DE3)에서 캡시드 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여 네 종류의 pHCE vectors (pHCE IA, IB, IIA, and IIB)가 이용되었다. SDS_PAGE와 western blot 확인 결과, 이 중 pHCE IA-HcRNAV34, pHCE IIA-HcRNAV34, 그리고 pHCE IIB-HcRNAV34에서 38 KDa 크기의 캡시드 단백질이 성공적으로 발현되어 다음 실험에 이용되었다 (Fig. 2).

Figure 1. Agarose gel electrophoresis of PCR product (1087 bp) of codon optimized HcRNAV34 gene (A) and construction of recombinant plasmid pHCE-HcRNAV34 gene (B).

Figure 2. SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analyses of expression level of recombinant pHCE-HcRNAV34 capsid protein in E. coli using four types of pHCE vectors. Symbols: M, molecular marker; lane 1, control (no vector); lane 2, pHCE IA; lane 3, pHCE IIA; lane 4, pHCE IB; and lane 5, pHCE IIB.

3.2. 배양조건에 따른 pHCE-HcRNAV34 VLP의 발현

발현조건을 최적화하기 위해 몇 가지 요소 즉, 배양온도, 배양시간, E. coli 숙주, 그리고 배지 조성 등이 조사되었다. 앞서 선별한 E. coli BL21(DE3)-pHCE IA-HcRNAV34, E. coli BL21(DE3)-pHCE IIA-HcRNAV34, 그리고 E. coli BL21(DE3)-pHCE IIB-HcRNAV34를 다양한 온도인 30, 37, 그리고 40°C에서 16시간 동안 동일하게 배양하였다. 배양온도를 30°C로 조절하여 배양한 결과 모두에서 캡시드 단백질이 발현되지 않는 것을 확인하였다. 그러나 배양 온도를 37°C와 40°C로 하여 배양한 결과 실험에 사용한 모든 재조합 대장균에서 HcRNAV34 캡시드 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (data not shown). 배양 온도를 37°C로 조절하였을 때가 40°C에서 배양하였을 때보다 HcRNAV34 캡시드 단백질이 약 5배 이상 많이 발현되었다.

HcRNAV34 단백질을 대장균에서 발현시킬 경우 대부분이 inclusion body로 형성되는 것으로 알려져 있다 [18]. Inclusion body 형성율을 낮추기 위하여 가장 많이 이용되는 것이 저온 배양방법이다. 따라서 본 실험에서도 E. coli BL21(DE3)-pHCE IA-HcRNAV34로부터 발현되는 HcRNAV34 단백질의 inclusion body 형성을 막기 위하여 배양 온도를 16, 25, 30, 37°C로 설정하여 OD600값이 2.0에 도달할 때까지 배양하였다. 그 결과 16, 25, 30°C에서도 대장균의 생장은 이루어졌으나 SDS-PAGE 결과에서 HcRNAV34 캡시드 단백질이 발현되지 않았으며, 선행 결과와 같이 37°C에서 배양한 E. coli BL21(DE3)-pHCE IA-HcRNAV34에서 단백질 (38 kDa)이 가장 많이 발현되었다 (Fig. 3). 이는 HcRNAV34 캡시드 단백질 발현을 위한 대장균의 배양온도는 37°C가 최적임을 의미한다.

Figure 3. Expression of pHCE-HcRNAV34 capsid protein at different temperatures. Symbol: M, molecular marker; lane 1, 16°C; lane 2, 25°C; lane 3, 30°C; and lane 4, 37°C.

본 실험에 사용한 pHCE 발현시스템은 HCE promoter를 이용하는 상시발현 벡터이다. 특히 HCE promoter의 경우 대장균 배양 초기부터 높은 수준의 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다 [19]. 본 연구에서 수행할 HcRNAV34 캡시드 단백질의 대량발현을 위해서는 배양시간에 따른 단백질 발현이 중요한 인자이다. 재조합 E. coli BL21(DE3)-pHCE HcRNAV34의시간에 따른 HcRNAV34 캡시드 단백질의 발현양을 확인하였다. 배양 초기인 접종 후 3~6시간부터 많은 양의 HcRNAV34 캡시드 단백질 (38 kDa)이 발현되었고, 16~18시간에서 가장 많은 단백질이 발현되었으며 그 이후부터 다시 발현량이 감소하였다. 대부분의 캡시드 단백질과 같이 본 실험에서 발현한 HcRNAV34 캡시드 단백질도 약 95% 이상의 단백질이 불용성 단백질로 확인되었다. 접종 후 6~15시간에서 소량의 수용성 HcRNAV34 캡시드 단백질이 발현되었으나, 15시간 이후에는 수용성 단백질 발현이 사라졌다(data not shown).

E. coli 숙주 균주에 따라 HcRNAV34 캡시드 단백질이 발현되는 양상을 확인하기 위하여 다양한 종류의 E. coli strain(DH5α, BL21(DE3), TOP10 및 ROSETTA)를 이용하였다. 각각의 재조합 대장균에서 HcRNAV34 캡시드 단백질 발현을 유도한 결과, E. coli BL21(DE3)-pHCE IA-HcRNAV34 및 E. coli ROSETTA-pHCE IA-HcRNAV34에서 38 KDa의 캡시드단백질이 발현되었다 (Fig. 4). 두 재조합 대장균에서 발현된 캡시드 단백질은 대부분 불용성 단백질이었으며, 소량의 수용성 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. E. coli TOP10과 E. coli DH5α에서는 캡시드 단백질이 발현되지 않았다. 실험에 사용한 4종류의 E. coli strain 중 E. coli BL21(DE3)에서 가장 많은 단백질이 발현되어 이후 실험에는 E. coli BL21(DE3)-pHCE IA-HcRNAV34를 사용하였다.

Figure 4. Expression of pHCE IA-HcRNAV34 capsid protein in several recombinant E. coli strains; (A) BL21(DE3); (B) DH5α; (C) ROSETTA; and (D) TOP10. Symbol: M. Molecular marker; lane 1, control soluble fraction; lane 2, control insoluble fraction; lane 3, HcRNAV34 soluble fraction; lane 4, HcRNAV34 insoluble fraction.

일반적으로 LB medium이 E. coli cells의 배양에 사용되지만 저가의 포도당을 함유하는 M9 mineral medium에 비해 값이 비싸다. E. coli cells의 대량배양 관점에서 볼 때 기질의 단가는 매우 중요하기 때문에 LB와 M9 medium에서의 E. coli BL21(DE3)-pHCE IA-HcRNAV34를 배양한 후 캡시드 단백질 발현량을 비교하였다. 이 때, M9 medium 조성을 다음과 같이 약간 변형하여 사용하였다: glucose (0.2, 0.4 및 0.6%, w/v), MgSO₄ (0.2, 1.0 및 5.0 mM) and CaCl₂ (0.05, 0.1 및 0.5 mM). 기질인 glucose의 첨가량이 증가됨에 따라 캡시드 단백질의 발현양이 증가하였으나 그 폭은 크지 않았고, Mg²⁺ 및 Ca²⁺ ion 농도에 따라서도 단백질 발현량의 변화는 크지 않았다 (data not shown). 캡시드 단백질 발현을 위한 M9 mineral medium의 최적 조성 값은 각각 0.2% glucose, 1 mM MgSO₄, 그리고 0.1 mM CaCl₂인 것으로 확인하였다. 예상한대로 E. coli cells의 생장속도는 LB 배지에서 보다 M9 배지에서 느렸으며, 따라서 최종 배양시간도 LB 배지 (18시간)보다 약 1.5배 긴 27시간이었다. 이와 같은 E. coli cells의 생장률과 단백질 발현량을 증가시키기 위하여 M9 배지에 yeast extract와 tryptone 등의 복합영양원을 공급하여 발현시간을 단축시키고자 하였다. 각각의 yeast extract (0.05, 0.1 및 0.5%, w/v) 또는 tryptone (0.1, 0.5 및 1.0%, w/v)을 농도별로 첨가하여 캡시드 단백질의 발현양을 비교한 결과, yeast extract의 첨가에 따른 단백질의 발현량 변화는 없었으나, 0.5와 1.0%의 tryptone을 첨가 시 발현양이 증가하였다. 특히 0.5%의 tryptone을 첨가했을 때 LB 배지와 비슷한 수준의 캡시드 단백질 발현양을 확인할 수 있었다 (data not shown).

3.3. 30 L 발효기에서의 캡시드 단백질 대량발현

재조합 E. coli BL21(DE3)-pHCE IA-HcRNAV34를 이용한 캡시드 단백질 대량생산을 위하여 30 l 발효기 (KoBioTech, KF-30L)에 LB 또는 M9 mineral medium을 공급한 후 배양하였다. 배양온도를 37°C로 고정하였고, 배양 중 공기주입량과 교반속도를 조절하면서 실험 수행하였다. 20 l 용량의 LB배지와 M9 배지를 배양기에 주입하고 교반속도 200 rpm과 1 vvm의 공기량을 주입해 20시간 동안 배양하였다. 재조합대장균은 LB배지에서 배양초기부터 생장속도가 빨랐으며, 최종 균체량은 wet weight로 95.8 g을 얻어 수율은 4.79 g/l이었다 (Fig. 5(A)). M9 배지에서 같은 조건으로 배양한 결과 균체량은 wet weight 65.0 g으로 3.25 g/l의 수율을 보였다 (Fig. 5(B)). 위 조건에서 배양한 대장균의 캡시드 단백질 발현량을 비교하였을 때, 비록 불용성 단백질로 발현되었지만 M9 배지에서 보다 LB배지에서 배양할 경우 배양초기부터 단백질이 다량 발현하였다 (Fig. 5(C), Fig. 5(D)). 또한 배지에 주입 공기량과 교반 속도를 증가시키면 발현양이 늘어날 뿐만 아니라 발현시간도 상당히 단축된다는 것을 확인할 수 있었다.

Figure 5. Effect of medium composition on the growth of recombinant E. coli cells (A, B) and the expression of HcRNAV34 capsid protein (C, D) in a 30 l fermenter. LB medium (A & C) and M9 mineral medium (B & D) were used. M, molecular marker; lane 1, 4 h; lane 2, 8 h; lane 3, 12 h; lane 4, 16 h; and lane 5, 20 h.

3.4. 캡시드 단백질의 정제

상시발현 벡터를 이용한 캡시드 단백질 발현은 대부분 불용성 단백질의 형태로 발현되고 있으며, 수용성 캡시드 단백질 발현을 위하여 많은 연구가 진행되고 있지만 아직 그 결과는 만족스럽지 못한 수준이다 [20]. pHCE IA-HcRNAV34를 사용한 본 연구의 재조합 대장균에서도 대부분의 캡시드 단백질은 불용성으로 발현되었다. 본 연구에서는 이렇게 불용성으로 발현된 다량의 캡시드 단백질을 쉽게 정제하여 직접 VLP로 이용하기 위한 새로운 방법을 개발하고자 하였다. 본 연구의 재조합 대장균에 의해서 발현된 불용성 캡시드 단백질은 균체를 파쇄하였을 때 aggregation 되는 특징을 나타내었고, 육안으로 확인이 가능한 상당한 크기의 particle을 형성하였다. 따라서 이들 particles을 원심분리기의 중력가속도 값을 조절하여 침전시키면 비교적 고순도의 캡시드 단백질을 정제할 수 있을 것으로 예상하였다. M9 배지 (0.2% glucose, 1 mM MgSO4, 그리고 0.1 mM CaCl2) 20 l가 들어있는 30 l 배양기에서 회수한 균체 wet wt. 10 g에 lysis buffer 30 ml를 넣고 Sonicator로 파쇄한 후 4°C에서 10,000 × g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 불용성 캡시드 단백질이 포함된 pellet을 lysis buffer에 재현탁하였다. 재현탁한 불용성 단백질 시료를 4°C에서 원심분리 하되 속도를 150~7,500 × g로 조절하였다. Low speed로 원심분리할 경우 파쇄되지 않은 cell debris는 pellet으로 침전되고, 상층액에 단백질이 포함되어 있을 것으로 예측하였다. 150 × g로 원심분리하였을 때 상층액에서 재현탁한 전체 단백질 중 불용성 단백질이 약 80% 정도가 회수되었으며, 이때 약 90% 이상의 순도를 가진 캡시드 단백질 (38 kDa)이 정제되었다. 반면 1,000 × g에서는 전체 단백질의 약 50%가 회수되었으며, 7,500 × g에서는 20% 미만의 단백질이 회수되었다. 이렇게 정제된 HcRNAV34 캡시드 단백질에 살조물질을 탑재하여 숙주조류에 이적으로 결합하는지 등의 실험에 사용하였다.

3.5. 불용성 캡시드 단백질의 전처리

Virus-like particle (VLPs)은 하나 또는 그 이상의 바이러스 캡시드 단백질로 구성되며, 적절한 숙주 특이성을 갖는 자연에 존재하는 virion과 유사하다. 그러나 VLPs는 DNA 유전물질을 내포하지 않기 때문에 세포 내에서 증식할 수 없다. 이러한 이유로 VLPs를 적절한 구조체로 형성한 후 그 내부에 여러 화합물이나 펩타이드를 탑재하여 nanocarrier로 이용하려는 연구가 많이 수행되었다[15,16]. 본 연구는 살조물질을 특정 유해조류를 타겟으로 하는 조류 VLPs에 탑재한 후, 수 생태계에 살포하여 유해조류를 제거하는 것을 목표로 하고있다.

이러한 VLPs는 dissociation/reassociation buffer의 조성 변화를 이용하여 monomer형태인 capsomer로의 분해 및 재조립이 가능하다. 이와 같은 과정을 통하여 캡시드 내부에 특정 물질을 흡착할 수 있는 것으로 알려져 있다 [21,22]. 그러나 덩어리 형태의 불용성 캡시드 단백질의 경우 물질 흡착에 상당한 제약을 가지고 있다. 본 연구에서는 불용성으로 발현된 캡시드 단백질에 비록 수율은 낮지만 직접 살조물질을 흡착하기 위하여 trypsin 효소를 이용하여 단백질을 무작위로 분해한 후 재조립하는 과정에서 특정 물질을 흡착할 수 있는지 그 가능성을 조사하였다. 정제된 HcRNAV34 VLPs 용액에 trypsin과 2X reaction buffer를 처리한 후 37°C에서 24시간 동안 반응하였다. 일정한시간 간격으로 일정량의 반응액을 채취하여 12% (W/V) SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 38kDa의 HcRNAV34 VLPs는 반응 4시간까지 20% 정도 분해되는 것을 확인하였으나, 그 이후에는 더 이상 분해되지 않았다. 이렇게 준비된 6시간 반응액에 표지물질인 FITC와 살조물질 TD49의 탑재 가능성을 조사하였다.

3.6. HcRNAV34 VLPs의 숙주특이적 살조

다음으로 이렇게 만들어진 VLPs가 적절한 숙주에 특이적으로 결합하는 능력이 있는지 조사하였다. 먼저 VLPs를 fluorescein isothiocyanate (FITC)로 표지하였다. FITC는 자외선 영역에서 녹색 형광을 나타내는 물질로 만일 FITC가 표지된 VLPs가 특정 숙주 조류에 결합한다면 조류 표면에 녹색 형광이 나타남으로써 결합 여부를 확인할 수 있다. 앞서 부분정제된 HcRNAV34 VLP를 trypsin으로 37°C에서 6시간 동안 digestion시킨 200 μL에 100 mM의 FITC 100 ml를 주입하여 1시간 동안 교반하였다. 반응 후 10 K dialysis cassette를 이용해 4°C에서 3일 동안 빛이 차단된 상태로 dialysis를 수행하였다. Dialysis 과정은 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8.0)를 사용하였으며, 12시간 간격으로 buffer를 교체해주었다. Dialysis 과정이 끝난 후 10 K Centricon으로 표지되지 않은 FITC는 제거하였다.

FITC가 표지된 HcRNAV34 VLP를 유해조류와 반응시켜 숙주에 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위해 4종의 유해조류를 이용하여 실험하였다. HcRNAV34의 숙주로는 H. circularisquama HU9433-P와 HA92-1를 사용하였고, 대조군으로는 숙주가 아닌 H. circularisquama HY9423를 사용하였다. FITC가 표지된 VLP 100 μL를 유해조류 배양액 400 μL에 첨가한 후 3시간 동안 서서히 교반하면서 반응시킨 다음,

여과 살균된 F/2 배지를 이용하여 세 번의 washing 과정을 거쳐 잔여 FITC를 제거하였다. 살아있는 조류 세포는 chlorophyll를 가지고 있어 붉은색 형광을 나타내며, FITC가 표지된 HcRNAV34 VLP가 결합하게 되면 녹색형광을 나타나게 된다. 이와 같은 특징을 이용하여 형광현미경을 통해 숙주에 대한 HcRNAV34 VLP의 숙주 특이적 결합을 관찰하였다. 그 결과 숙주인 H. circularisquama HU9433-P와 HA92-1에서는 25~30%의 숙주특이성을 갖는 녹색형광이 관찰되었고, 숙주가 아닌 H. circularisquama HY9423에서는 5% 미만의 조류에서 녹색형광이 관찰되었다 (Fig. 6). 대조군과의 비교 결과 FITC가 표지된 HcRNAV34 VLP를 처리할 경우 유효한 수준의 숙주특이적 결합을 나타내는 것으로 분석되었다.

Figure 6. Host-specific binding of HcRNAV34 VLPS. Fluorescent micrographs taken with red/green (A), red (B), and green (C) filters (for chlorophyll and FITC, respectively) of H. circularisquama HU9433-P, H. circularisquama HY92-1 and H. circularisquama HY9423 treated with FITC-labelled HcRNAV34 VLPs.

HPLC를 통해 HcRNAV34 VLP의 살조물질 TD49 흡착율을 확인하고, 유해조류에 대한 숙주 특이적 살조효과를 관찰하였다. Reaction buffer에 정제된 HcRNAV34 VLP와 trypsin을 넣고 6시간 동안 반응시킨 후 일부 VLP가 digestion된 상태에서 TD49를 첨가하고 3시간 동안 반응시켜 살조물질을 흡착시켰다. 그 후 dialysis를 수행하여 TD49의 흡착 유무를 HPLC로 분석하였다. 그 결과 초기에 처리해준 농도 대비 약 40% 정도의 TD49가 HcRNAV34 VLPs에 흡착된 것으로 분석되었다. 살조물질을 흡착한 VLPs를 이용해 유해조류 살조 실험을 수행하였다. 사용한 유해조류는 숙주 조류인 H. circularisquama HU9433-P와 HA92-1를, 대조군으로는 비숙주인 H. circularisquama HY9423와 H. akashiwo이었다. TD49가 흡착된 HcRNAV34 VLPs를 해당 유해조류와 부피 1 : 4의 비율로 첨가하고 2시간 반응시킨 후 광학현미경으로 관찰한 결과, 숙주인 H. circularisquama 9433-P와 H. circularisquama 92-1에서 2시간 경과 후 약 절반의 조류가 파괴되는 양상을 보였으며, 6시간 후에는 80% 이상의 유해조류가 유동성이 사라지고 사멸하는 것으로 관찰되었다. 비숙주인 H. circularisquama 9423은 2시간 후 20% 정도 사멸되었고, 6시간 후에는 30% 정도 사멸되었지만시간이 지나도 더 이상 증가하지 않았다. 한편 H. akashiwo의 경우 2시간 후에 10%의 사멸율을 보였지만, 6시간이 지나도 사멸율이 증가하지 않았다 (Fig. 7). 비숙주인 H. circularisquama 9423에서 비교적 높은 사멸율을 보인 이유는 완벽하게 정제되지 않은 VLPs 외에도 잔여 단백질에 TD49가 흡착되어 비특이적으로 유해조류를 사멸시킨 것으로 판단된다.

Figure 7. Time-dependent host-specific algicidal effects of HcRNAV34 VLPs encapsulated with TD49 on several hosts and non-hosts.

사용한 네 종류의 상시발현 벡터에 HcRNAV34 gene을 클로닝한 후 대장균에 형질전환하여 발현을 유도한 결과 재조합 pHCE IA-HcRNAV34에서 가장 높은 단백질 (38 kDa) 발현양을 보였다. 재조합 pHCE IA-HcRNAV34 캡시드 단백질의 발현조건을 탐색한 결과, 배양온도 37°C, 배양시간 16~18시간에서 높은 발현양을 보였다. E. coli strain에 따른 발현 조건에서는 BL21(DE3)가 최적발현 균주인 것으로 결정되었다. 캡시드 단백질의 대량발현 및 저가 생산을 위해 기존 M9 mineral medium 조성 중 glucose, MgSO₄ 그리고 CaCl₂의 농도를 다르게 첨가한 결과 주목할 만한 발현양의 증가를 보이지는 않았지만, M9 medium에 0.5와 1.0%의 tryptone을 첨가한 결과 기존에 사용하던 LB medium과 비슷한 단백질 발현양을 확인할 수 있었다. 이 때 발현된 캡시드 단백질의 경우 세포 파쇄 시 aggregation 되었으며, 원심분리기 중력가속도 값의 조절을 통해 비교적 고순도의 불용성 캡시드 단백질을 부분정제할 수 있었다. 정제한 HcRNAV34 VLPs에 FITC를 표지한 후 유해조류와 반응시켜 숙주 특이적 결합을 관찰한 결과, 숙주조류에만 녹색 형광을 관찰할 수 있었다. 또한 살조물질 TD49가 흡착된 HcRNAV34 VLPs를 유해조류에 처리하였을 때에도 숙주 조류에만 6시간 후 약 80%의 살조효과를 나타냈다. 이러한 결과는 살조물질을 흡착할 수 있는 VLPs를 대량생산한 후 부분정제만 하고 살조물질을 흡착하더라도 다른 조류에는 영향을 미치지 않고 특정 유해조류만 살조할 수 있는 가능성이 있음을 제시하고 있다.

이 연구는 한국연구재단 중견연구과제 연구비 (NRF-2018R1A2B2001006)의 지원으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.