Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal

pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2022; 37(1): 32-40

Published online March 31, 2022 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2022.37.1.32

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

CHO 세포 부유배양용 플라스크의 산소전달속도 모델 개발

Oxygen Transfer Rate (OTR) Prediction Model for CHO Cell Culture in Shake Flasks

Hanchul Ko, Hyun Wook Yoo, and Jong Youn Baik*

Department of Biological Sciences and Bioengineering, Inha University, Incheon 22212, Korea

Correspondence to:Tel: +82-32-860-7513, Fax: +82-32-872-4046
E-mail: jybaik@inha.ac.kr

Received: December 29, 2021; Revised: February 27, 2022; Accepted: March 14, 2022

Shake flasks are widely used as small-scale mammalian culture vessels during cell line development and bioprocess optimization for the production of biopharmaceuticals. However, the lack of information as well as controllability on dissolved oxygen often leads to oxygen limitation that can adversely affect cell growth and productivity during cell culture, thereby challenging cell line development and scale-up processes. In this work, we report an oxygen transfer rate (OTR) prediction model of shake flasks using Chinese hamster ovary (CHO) cells to avoid oxygen limitation issues in shake flasks. First, we varied shaking speed and culture volume to measure maximum OTR (OTRmax) and created an OTRmax regression function. Then, we estimated theoretical maximum viable cell density with the specific oxygen uptake rate (sOUR) of CHO cells and the OTRmax values. Lastly, we tested if decreasing culture volume or increasing shaker speed could mitigate the adverse effect of oxygen limitation. In conclusion, we believe this OTR prediction model would provide information about the oxygen availability in shake flasks, presumably assisting to achieve better culture performances.

Keywords: dissolved oxygen (DO) concentration, oxygen transfer rate (OTR), Chinese hamster ovary (CHO) cell, shake flask

생물체에 기반하여 생산되는 바이오의약품은 2020년 글로벌 의약품 시장의 30%를 차지할 정도로 급성장하고 있으며, 이에 힘입어 바이오의약품 신약 및 바이오시밀러의 개발이 빠르게 증가하고 있다 [1,2]. 바이오의약품 개발공정은 바이오의약품 생산 세포주 및 배양 조건을 선별하는 upstream 공정과 배양 후 바이오의약품 정제 및 제형을 만드는 downstream 공정으로 구성된다. 바이오의약품 생산 세포주의 생산성이 높을수록 바이오의약품 생산비용이 감소하므로, upstream 공정에서 생산성이 높은 세포주를 선별하고 최적화된 공정을 수립하는 것이 매우 중요하다.

Upstream 공정의 초기 개발 단계는 수많은 세포주와 배양조건들을 선별하므로 일반적으로 배양에 필요한 인력과 비용이 적고 실험 처리량이 높은 shake flask를 사용하여 소규모 배양 환경에서 바이오의약품 개발을 수행한다. 하지만, 단순한 구조를 가지는 shake flask는 배지의 dissolved oxygen(DO) concentration, pCO2, pH등의 배양 공정 변수에 대한 모니터링 및 제어 시스템이 존재하지 않기 때문에 이러한 공정변수를 조절하기 어렵다. 이로 인해 바이오의약품 생산을 위한 대규모 배양에 사용되는 bioreactor와 다른 배양 환경이 형성되어 세포 성장, 생산성, 대사, 유전자 발현 등 배양에서 상당한 차이가 발생하는 것으로 보고되었다 [3,4].

동물 세포 배양에서 세포는 에너지 생산을 위해 세포 대사에 산소를 소비한다. Shake flask에서 산소 공급은 배지와 대기 표면에서 산소 농도차로 산소가 이동하는 surface aeration 현상에 의해 공급되며, 이때 시간당 배지에 공급되는 산소량은 oxygen transfer rate (OTR)로 나타낸다. 동물 세포 배양 중 시간당 세포가 소비하는 산소량인 oxygen uptake rate (OUR)만큼의 산소가 배지로 공급되지 않으면 (OUR > OTR), 배지의 DO는 점차 감소한다. 배지의 DO가 감소하면 배지와 대기 중의 산소 농도차가 증가하면서 확산의 원리에 따라 OTR이 상승하여 OUR과 같은 수준에 도달한다. 시간이 지남에 따라 세포가 증식하면서 소비하는 산소량이 증가하여 배양배지의 DO가 0mg/L가 되면 OTR은 maximum oxygen transferrate(OTRmax)가 되며 더 이상 증가하지 못한다. 만일, shake flask의 OTRmax가 세포의 OUR 보다 충분히 높지 않으면 배지의 DO가 빠르게 고갈될 수 있다. 동물 세포 배양 중 배지 DO 고갈은 세포의 성장, 유지, 단백질 생산 등에 필수적인 세포 호흡에 의한 에너지 대사를 크게 저해하여 결과적으로 세포의 사멸, 바이오의약품 생산성 및 품질 감소를 야기한다[5-8]. 따라서, shake flask의 낮은 OTRmax는 동물 세포 배양에서 주요 한계점이 될 수 있다.

미생물 분야의 연구들과 다르게 동물 세포 분야에서는 shake flask의 OTRmax와 OUR에 대한 연구가 많이 수행되지 않았다 [9-16]. 이는 미생물 분야의 경우 OUR이 매우 높아 산소 공급이 미생물 배양에서의 주요 제한인자로 인식되어 관련 연구가 활발히 수행된 반면, 동물세포의 OUR은 미생물에 비해 매우 낮아 이전까지의 일반적인 동물세포의 배양 중 농도 (일반적으로 107 cells/mL 이하)에서는 산소 공급이 제한인자로 인식되지 않았던 것에 기인한다. 동물 세포 배양 중 OUR 측정 방법에는 크게 3가지 방법이 존재한다 [17]. 첫번째 방법인 global mass balance는 in-let gas와 out-let gas의 산소 농도를 비교하여 OUR을 계산하는 방법이다. 두 번째 방법인 dynamic method는 배양 용기의 headspace에 질소 가스를 주입하여 OTR를 0로 한 뒤 일정 시간 동안의 배지의 DO 감소를 통해 OUR을 측정하는 방법이다. 마지막 방법인 stationary liquid phase balance는 동물 세포 배양 중 DO를 측정하고 배양 환경의 OTRmax를 통해 OTR를 계산하고 이를 OUR로 계산하는 방법이다. Bioreactor의 경우 3가지 방법 모두를 사용할 수 있으나, 일반적인 shake flask는 어떠한 방법도 사용할 수 없다. 비록, shake flask에서 respiration activity monitoring system과 dynamic method를 사용하여 일정 시간 산소 공급을 중단하고 시간 당 shake flask headspace의 산소농도 감소량을 측정하여 OUR 모니터링을 방법을 구축하고 동물 세포 배양 중 세포 상태를 모니터링한 연구가 존재하나 특수한 장비를 필요로 하여 널리 사용하기 어렵다 [18]. 또한, non-invasive oxygen probe를 추가한 shake flask가 개발되어 배양 중 배지의 DO를 측정할 수 있게 되었으나, 이 역시 특수한 장비를 필요로 하고, 또한 동물 세포 배양 환경에 따른 shake flask의 OTRmax에 대한 연구가 수행되지 않아 배양 중 세포에게 산소가 충분히 공급되는지 확인하기 어렵다.

본 연구에서는 CHO 세포의 shake flask 배양에서의 산소 공급속도를 모델링하여 세포주 및 공정개발에 도움을 주고자 하였다. 먼저, 다양한 shaker rotation speed와 filling volume 조건에서 OTRmax를 측정하여 배양 환경에 따른 OTRmax를 계산하는 공식을 구축하였다. 다음으로, OTRmax가 낮은, 중간, 높은 배양 환경에서 CHO 세포를 배양하여 산소공급(혹은 제한)이 세포 성장과 대사에 미치는 영향을 분석하였다. 마지막으로, 다양한 OTRmax 조건에서 세포 배양 중 DO를 측정하여 세포 성장이 저해되는 시점의 DO를 확인하였다.

2.1 Sodium sulfite oxidation방법을 통한 OTRmax 측정

Shake flask에서 산소 공급은 배지와 대기 표면에서 산소 농도차로 산소가 이동하는 surface aeration 현상에 의해 공급되며 이 과정은 다음과 같다.

OTR = KLa(C*-CL)

KL은 물질 전달 계수이며 a는 배지와 대기의 표면적이다. C*는 용액의 산소 용해도로 포화된 배지의 DO와 동일하며, CL은 배지의 DO다. 배지의 DO가 0 mg/L가 되면 OTR은 최대가 되며 이는 다음과 같다.

OTRmax= KLa(C*)

배양 환경에 따른 OTRmax를 sodium sulfite oxidation 방법을 사용하여 측정하였다 [19-21]. Cobalt sulfate 농도가 10-7M이 되도록 10-5 M cobalt sulfate 용액을 첨가한 0.5 M sodium sulfite 용액 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 mL을 shake flask에 각각 분주하고, shaker rotation speed를 100, 130, 150, 200, 250 rpm으로 설정하였다. 촉매 역할을 하는 cobalt가 첨가되면 sodium sulfite (Na2SO3)는 산소와 빠르게 반응하여 sodium sulfate (Na2SO4)가 되며, sodium sulfite 용액의 DO는 0 mg/L로 빠르게 감소한다. 용액의 DO가 0 mg/L로 감소하면 OTR은 OTRmax가 되며, 시간에 따른 sodium sulfite 농도 감소를 통해 OTRmax를 계산하였다.

2Na2SO3 + O2 → 2Na2SO4

Sodium sulfite 농도 감소량은 iodine 적정을 이용하여 간접 측정하였다. 1시간 마다 37°C sodium sulfite 용액을 1 mL 샘플링하고 0.05 M iodine (I2) 용액 10 mL과 반응시켰으며, 각 조건당 5회씩 측정하였다.

2Na2SO3 + 2I2 + 2H2O → 2Na2SO4 + 4HI

Sodium sulfite와 반응하고 남은 iodine 용액을 0.1M sodium thiosulfate (Na2S2O3) 용액으로 적정하였다.

4Na2S2O3 + 2I2 → 2Na2S4O6 + 4NaI

적정에 소비된 sodium thiosulfate 용액의 양을 시간에 대한 그래프로 나타냈으며, 그래프의 기울기를 통해 시간에 따른 배양 환경의 OTRmax를 계산하였다. 본 연구는 다음 물질들을 사용하여 수행하였다 : sodium sulfite (DAEJUNG, Korea), cobalt sulfate heptahydrate, sodium thiosulfate pentahydrate, iodine, potassium iodide (SAMCHUN, Korea).

2.2. OTRmax 회귀분석을 통한 계산 공식 구축

Sigmaplot version 10.0 (Systat Software, Inc., USA) 의 회귀분석을 사용하여 배양 환경에 따른 OTRmax 계산 공식을 구축하였다. OTRmax는 shaker rotation speed에 비례하고 filling volume에 반 비례하므로 [14-16,22] OTRmax= a × (shaker rotation speed)b × (1/filling volume)c 형태의 회귀 분석 함수를 user define regression function을 이용하여 구축하였다.

2.3. 세포 배양

본 연구에서는 CHO K1 세포주를 유가식 배양 방법으로 배양하였다. 125 mL Erlenmeyer flask with vent cap (Corning, USA)에 Actipro media (Cytiva, USA)를 25, 50 mL 분주하고 L-glutamine (Sigma, USA)를 6 mM가 되도록 첨가하고, seeding density가 0.3, 1.5, 3 × 106 cells/mL 되도록 세포를 접종하였다. BB 15 CO2 incubator (Thermo, USA)에서 shaker rotation speed를 100, 150, 200 rpm로 설정하고 37oC 5% CO2에서 배양하였다. Feed 배지로 Cell Boost 7a와 b (Cytiva, USA)를 사용하였다. Cell Boost 7a, b는 배지의 glucose 농도가 4 g/L 이하로 감소하는 배양일부터 filling volume의 3, 0.3% 씩 매일 첨가하였다. 배양 중 glucose 고갈을 방지하기 위해 feed 배지 첨가 이후 glucose 농도가 6 g/L가 되도록 glucose solution (100 g/L)를 첨가하였다. Feed 배지 첨가 직전 0.8, 1.6 mL을 샘플링 한 뒤, 세포를 trypan blue dye(Gibco, USA)로 염색하고 Countess II (Invitrogen, USA)로 viable cell density (VCD)와 viability를 측정하였다.

2.4. 배양액 분석

샘플링한 배양액을 500 g, 30 sec 원심 분리하여 상층액을 회수한 뒤 생화학 분석기 Cedex Bio (Roche, Swiss)의 Glucose Bio (06343732001), Lactate Bio (06343759001)를 사용하여 흡광도 분석을 통해 배양액의 glucose, lactate 농도를 측정하였다. 배지 및 배양액의 DO는 DO meter SEN0237-A (DFRobot, China)를 사용하여 매뉴얼에 따라 측정한 후 용해도를 계산하였다.

3.1. Sodium sulfite oxidation을 통한 배양 환경에 따른 OTRmax 예측 모델 구축

다양한 shaker rotation speed와 filling volume 조건에서 일정 시간마다 sodium sulfite 용액의 농도를 측정하고, 시간에 따른 sodium sulfite 농도 감소량을 통해 OTRmax를 계산하였다 (Supplementary Table 1). 선행 연구에서, shaker rotation speed가 증가하면 배지와 대기가 접촉하는 표면적이 증가하고 filling volume이 증가하면 배지의 부피 대비 접촉 표면적이 감소하므로 OTRmax는 shaker rotation speed와 양의 상관관계가, filling volume과는 음의 상관관계가 있다고 나타났다[12,21,23,24]. 본연구에서도 선행연구와 동일하게 OTRmax가 shaker rotation speed에 비례하고 filling volume에 반비례함을 확인하였다 (Fig. 1). User define regression function을 사용하여 측정한 OTRmax를 회귀분석 하였고 다음 공식이 도출되었다.

Figure 1. Maximum oxygen transfer rate with shaker rotation speed and filling volume at shaking diameter = 20 mm.

OTRmax = 12.4709 × (shaker rotation speed)0.5677 × (1/filling volume)0.9343 (R2 = 0.9715) (1)

다만, 선행 연구의 OTRmax계산 공식들에 비해 OTRmax에 대한 shaker rotation speed의 영향이 더 적은 것으로 계산되었다 (Table 1). 이는, OTRmax측정에 사용한 shake flask의 재질, 크기, 형상과 shaking diameter등의 여러 변수가 OTRmax에 영향을 미치나 [12,21,23,24], 선행 연구와 본 연구의 여러 변수들이 동일하지 않아 차이가 발생한 것으로 사료된다.

Table 1 Correlation of OTRmax to shaker rotation speed(n) and filling volume(VL) found in literature and rearranged for OTRmax

Correlation of shaker rotation speed and filling volume Literature
OTRmax ~ n0.88 ⅹVL−0.8[14]
OTRmax ~ n1[15]
OTRmax ~ n1.16 ⅹVL−0.83[16]
OTRmax ~ n1.1ⅹVL−8/9[22]


3.2. 배양 환경에 따른 Actipro 배지의 OTRmax 예측 모델 구축

배양 환경에 따른 Actipro 배지의 OTRmax 계산 공식은 sodium sulfite 용액과 Actipro 배지의 KLa가 동일하다고 가정하여 다음 과정을 통해 구축하였다.

OTRmax(sodium sulfite)= KLa(C*(sodium sulfite)), OTRmax(Actipro)=KLa(C*(Actipro))

OTRmax(Actipro)= [OTRmax(sodium sulfite)/ C*(sodium sulfite)]*C*(Actipro)

37°C Actipro 배지의 산소 용해도는 포화된 배지의 DO를 측정하여 계산하였다. 측정된 배지의 DO는 6.645 mg/L이며, 계산된 산소 용해도는 0.208 mmol O2/L이다. 37°C 0.5 M sodium sulfite 용액의 산소 용해도는 선행 연구의 값인 0.1365mmol O2/L을 사용하였다 [23].

OTRmax = 19.005 × (shaker rotation speed)0.5677 × (1 / filling volume)0.9343 (R2 = 0.9715) (2)

OTRmax계산 공식과 CHO 세포의 sOUR을 사용하여 배양환경의 VCDmax를 예측하고자 CHO 세포의 sOUR을 측정한 논문들을 비교하였다 (Table 2) [25-29]. 측정된 sOUR 값이 대부분 2~3 × 10-10mmol O2/cell*h 사이에 존재함을 확인하여 CHO 세포의 sOUR 값을 2.5 × 10-10 mmol O2/cell*h으로 가정하여 VCDmax를 계산하였다 (Table 3). 다만, 본 연구는 DO가 0 mg/L가 될 때까지 세포 성장이 저해되지 않는다고 가정하여 VCDmax를 계산하였으나, CHO 세포 배양 중 배지의 DO가 최적 농도보다 낮게 유지될 때 세포 성장이 저해되는 것이 보고되어 [7], 예측한 VCDmax와 배양에서 측정된 VCDmax는 일치하지 않을 수 있다.

Table 2 Literature values for CHO cell sOUR (sOUR : 10-10 mmol O2/cell*h)

sOURCell lineMediaLiterature
1.998CHO cell (DG44)Chiron CHO cell medium[25]
3.1CHO cellDMEM:F12-based media[26]
1.8~3.2CHO cell (T-CHO ATIII)CHO-S-SFM II media[27]
0.288~2.16CHO cell (CHO K1)DMEM media[28]
5~8.04CHO cellDMEM:Coons F12[29]


Table 3 Comparison of predicted VCDmax and measured VCDmax (OTRmax : mmol O2/L*h VCDmax : 107 cells/mL)

Culture condition100 rpm150 rpm200 rpm
25 mL50 mL25 mL50 mL25 mL50 mL
OTRmax12.836.718.4516.159.9519.01
VCDmax(predicted)5.132.6843.386.463.987.60
VCDmax(measured)2.41.12.42.43.13.1


3.3. CHO 세포의 성장에 대한 배양 환경의 OTRmax의 영향

Shake flask에서의 CHO 세포 배양에서 배양 환경의 낮은 OTRmax에 의한 세포 성장의 저해를 확인하고자 하였다. OTRmax가 낮은, 중간, 높은 배양 환경으로 shaker rotation speed는 100, 150, 200 rpm 세 조건과, filling volume은 25, 50 mL 두 조건을 설정하였다. 또한, OUR이 OTRmax 보다 높은 조건을 형성할 수 있도록 0.3, 1.5, 3 × 106 cells/mL seeding density 조건으로 설정하여 배양하였다 (Fig. 2).

Figure 2. Effect of OTRmax on VCD (A, C, E), Viability (B, D, F) at different seeding density. 100 rpm 25 mL (●), 100 rpm 50 mL (▼), 150 rpm 25 mL (●), 150 rpm 50 mL (▼), 200 rpm 25 mL (●), 200 rpm 50 mL (▼).

Bioreactor에서 다양한 seeding density로 CHO 세포를 배양한 연구의 경우 seeding density와 상관없이 maximum VCD(VCDmax)가 동일하였으나 [30,31], 본 연구에서는 seeding density에 따라 VCDmax가 달라짐이 확인되었다. 이는 shake flask의 낮은 배양 환경 조절 능력으로 인해 seeding density에 따라 세포의 에너지 (Fig. 3, Fig. 4) 및 생합성 대사가 서로 다르게 일어나 세포 성장에 영향을 준 것으로 판단하였다.

Figure 3. Effect of OTRmax on lactate concentration at 0.3, 1.5, 3×106 cells/mL (A), (B), (C). 100 rpm 25 mL (●), 100 rpm 50 mL (▼),
150 rpm 25 mL (●), 150 rpm 50 mL (▼), 200 rpm 25 mL (●), 200 rpm 50 mL (▼).

Figure 4. Effect of OTRmax on lactate production rate at 0.3, 1.5, 3 × 106 cells/mL (A), (B), (C). 100 rpm 25 mL (●), 100 rpm 50 mL (▼), 150 rpm 25 mL (●), 150 rpm 50 mL (▼), 200 rpm 25 mL (●), 200 rpm 50 mL (▼).

OTRmax가 가장 낮은 100 rpm 50 mL 배양에서 VCDmax가 1.1 × 107 cells/mL이상 증가하지 못함을 확인하였다. 반면, 100 rpm 25 mL 배양에서 VCDmax가 2.4 107 cells/mL으로 증가한 것을 확인하여, 100 rpm 50 mL 배양은 높은 filling volume으로 인해 배양 환경의 OTRmax가 낮아져 배양 중 저산소 환경이 형성되면서 세포 성장이 저해되었다고 판단하였다. 다음으로, shaker rotation speed를 증가시킨 150 rpm 25 mL, 150 rpm 50 mL 배양을 수행하였다. 150 rpm 25 mL 배양과 150 rpm 50 mL 배양 사이에 세포 성장의 차이는 확인되지 않았으며, VCDmax는 2.4 × 107 cells/mL으로 100 rpm 25 mL과 동일하게 측정되었다. 마지막으로, shaker rotation speed를 더욱 증가시킨 200 rpm 25 mL, 200 rpm 50 mL 배양을 수행하였다. 200 rpm 25 mL 배양과 200 rpm 50 mL 배양사이에 세포 성장의 차이는 확인되지 않았으나, VCDmax가 3.1 × 107 cells/mL으로 100 rpm 25 mL 보다 1.29배 증가하였다 (Fig. 2 (A), Fig. 2 (C), Fig. 2 (E)).

Shake flask에서의 CHO 세포 배양에서 배양 환경의 낮은 OTRmax에 의해 세포 성장이 저해될 수 있음을 확인하였다. 다만, 배양 환경을 조절하여 OTRmax를 증가시켜도 VCDmax가 일정 이상 증가하지 않는 것을 확인하였다. 이는, 배양 환경의 OTRmax가 OUR보다 높을 경우 세포는 산소를 충분히 공급받아 세포 성장이 저해되지 않아 VCDmax가 감소하지 않으나, 영양분 고갈 및 노폐물 축적 등 다른 배양 변수들 또한 세포 성장에 영향을 미치므로 VCDmax가 일정 이상 증가하지 않는 것으로 사료된다.

3.4. 세포 대사에 대한 OTRmax의 영향

충분한 산소가 공급되지 않는 저산소 환경에서(hypoxia) 동물 세포는 hypoxia inducible factor1 (HIF-1)를 활성화한다. HIF-1은 해당과정의 효소의 발현을 상향 조절하며 동시에 pyruvate dehydrogenase kinase (PDK), lactate dehydrogenase(LDH)를 활성화한다. PDK는 pyruvate를 아세틸-CoA로 전환시키는 pyruvate dehydrogenase (PDH)의 E1 subunit을 인산화하여 PDH를 비활성화한다. LDH는 해당과정을 통해 축적된 pyruvate를 lactate로 전환하여 결과적으로 저산소 환경에서 lactate가 축적되게 하며 [32-37], 이러한 현상은 CHO 세포에서도 동일하게 일어나는 것이 확인되었다 [38]. 따라서, 낮은 rpm 및 높은 filling volume 등으로 인해 OTRmax가 낮아진 배양에서는 산소 부족으로 인해 CHO 세포 성장이 저해되면서 lactate 축적이 증가하였을 것으로 가정하였으며, 이를 알아보기 위해 각 배양환경에서의 lactate 농도를 측정하였다 (Fig. 3). 각 배양 환경마다 VCD가 다르므로 정확한 세포당 lactate 생산량 비교를 위해 lactate production rate(PL)을 다음과 같이 계산하였다 (Fig. 4).

IVCDi= [(VCDi + VCDi-1) / 2] × (ti – ti-1) + IVCDi-1

PL = (Lactatei – Lactatei-1) / (IVCDi− IVCDi-1)

100 rpm 50 mL 배양에서 세포 성장이 저해된 시점은 seeding density 조건마다 달랐다. 0.3 × 106 cells/mL 조건은 4일차에, 1.5 × 106 cells/mL 조건은 2일차에, 3 × 106 cells/mL 조건은 1일차에 세포 성장이 저해되었다. 배양액의 lactate 농도의 경우 세포 성장이 저해되기 전에는 다른 배양 환경의 lactate 농도와 같았으나, 세포 성장이 저해된 다음날부터 lactate 농도가 증가하는 것이 확인되었다 (Fig. 3). 정확한 비교를 위해 100 rpm 50 mL 배양에서 세포 성장이 저해되기 전과 저해된 후의 PL을 다른 배양 환경들의 PL과 비교하였다 (Table 4). 세포 성장이 저해되기 전 100 rpm 50 mL 배양의 PL은 0.3 × 106 cells/mL 조건에서는 다른 배양 환경의 1.14~1.88배, 1.5 ×106 cells/mL 조건에서는 1.09 ~ 1.98배, 3 × 106 cells/mL 조건에서는 0.84 ~ 1.17배였으나, 세포 성장이 저해된 후에는 PL이 0.3 × 106 cells/mL 조건에서는 다른 배양 환경의 3.07 ~ 5.25배, 1.5 × 106 cells/mL 조건에서는 2.36 ~ 3.71배, 3 × 106 cells/mL 조건에서는 1.86 ~ 10.29배까지 증가하였다. 이를 통해, CHO 세포 배양 중 배양 환경의 낮은 OTRmax에 의해 세포가 산소를 충분히 공급받지 못하는 저산소 환경이 형성되어 세포 성장이 저해되고 lactate 생산량이 증가한 것으로 판단하였다.

Table 4 Comparison of lactate production rate (PL : 10-9 mg/cells*day)

Culture condition100 rpm150 rpm200 rpm
25 mL50 mL25 mL50 mL25 mL50 mL
0.3 × 106Day 3218.95299.98189.94171.97191.39185.14
Day 485.1797.0962.7959.4855.3751.62
Day 512.5966.0421.2121.4915.3316.05
1.5 × 106Day 1322.46467.71367.96386.79428.36415.58
Day 291.33162.5890.79121.6582.1190.57
Day 319.2971.5421.1330.3321.1021.45
3 × 106Day 1220.78257.30259.35226.86299.20307.46
Day 238.95128.4147.1069.1944.0438.81
Day 35.7754.157.0612.318.825.26


3.5 CHO 세포 배양 중 DO 측정 및 sOUR 계산

100 rpm 50 mL 배양에서 세포 성장이 저해되는 것을 확인하였으나, 예측한 VCDmax와 실제 VCDmax는 일치하지 않았다. 이는 배지의 DO가 기준 농도 이하로 감소하였을 때부터 세포 성장이 저해되어 이러한 차이가 발생하였다고 판단하였다. 따라서, 세포 성장이 저해되는 시점의 DO를 측정하고자 CHO 세포 배양 중 3, 5, 7 일차의 배지의 DO를 측정하고(Fig. 5), sOUR을 다음과 같이 계산하였다 (Table 5).

Table 5 Measured DO(%) and sOUR (DO(%) : %, sOUR : 10-10 mmol O2/cellsxh)

Culture condition100 rpm
30 mL50 mL
DO(%)measuredsOURDO(%)measuredsOUR
0.3 × 106Day 385.385.2856.158.01
Day 559.913.6639.196.03
Day 764.182.5940.984.86
3 × 106Day 337.583.8436.237.51
Day 552.703.2463.955.59
Day 782.801.3480.523.00


Figure 5. Effect of OTRmax on DO at 0.3, 3 × 106 cells/mL (A), (B). (VCD : 100 rpm 25 mL (●), 100 rpm 50 mL (■), DO : 100 rpm 25 mL (□), 100 rpm 50 mL (□))

sOUR = OUR/VCD

OUR = OTR = KLa(C*− CL)

OUR = KLa(C*)(1 − (CL/ C*)), OTRmax= KLa(C*)

OUR = OTRmax(1 − (DO(%) / 100)), DO(%) = (CL/ C*)*100%

DO 측정 결과로부터, DO(%)가 40%까지 감소한 후 세포성장이 저하되는 것을 확인하였다. 또한, sOUR이 seeding density 및 배양 기간에 따라 변화하는 것을 관찰하였는데(Table 5), 이는 oxygen limitation으로 인해 산화적 인산화에서 해당과정으로 에너지 대사가 변화하기 때문으로 추론된다 (Fig. 3, 4). 다만, sOUR은 산소공급이 유지되는 bioreactor 배양에서는 sOUR이 seeding density와 상관없이 비슷한 값을 나타낸다고 보고되었다 [26].

Shake flask는 배양에 필요한 인력, 비용이 적고 실험 처리량이 높아 다양한 동물 세포 배양 연구에 사용된다. 그러나, shake flask는 surface aeration에 의해서만 산소가 공급되어 OTRmax가 낮으며, 배양 중 배지의 DO를 측정할 수 없어 세포배양 중 세포에게 산소를 충분히 공급하는지 확인하지 못한다. 본 연구에서는 이러한 문제의 해결을 위해 sodium sulfite oxidation 방법을 사용하여 다양한 배양 환경에서 OTRmax를 측정하고 배양 환경에 따른 OTRmax 예측 모델을 구축하였다. 이후, OTRmax가 낮은, 중간, 높은 조건에서의 CHO 세포 배양을 통해 낮은 OTRmax 배양 환경에서 세포 성장이 저해되며, lactate 생산이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 OTRmax 예측 모델과 sOUR 값을 이용하여 shake flask에서 산소 결핍의 문제를 회피하고, bioreactor 등 larger scale 배양과의 scalability 격차를 줄이는데 기여할 것으로 기대한다.

이 논문은 2020년도 인하대학교의 지원 및 2019, 2020년도 정부 (과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (No. NRF-2019R1G1A1100213, NRF-2020R1C1C1006056)

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