나노입자는 10~1000 nm 범위의 크기를 갖는 고체 입자 또는 입자 분산체로 정의된다 [1]. 기존의 마이크로미터 단위 이상의 입자에 비해 나노미터 단위의 입자가 물리적/화학적으로 독특한 특성을 가짐을 알게 되면서, 지난 수십 년간 다양한 종류의 나노입자의 특성을 규명하고 이를 산업적으로 응용하기 위한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 나노미터 단위의 작은 크기로 인한 높은 비표면적 및 용해성, 양자제한효과에서 발생되는 독특한 장점은 나노입자의 다양한 분야로의 응용을 가능하게 하였다. 특히 DNA, 단백질 등 생체 분자와 비슷한 크기 수준에서의 상호작용을 통해 생체분자 진단용 센서 및 칩, 의료 영상화를 위한 조영제, 약물 전달, 목적 효소억제 등을 포함하는 생체 치료 등 생명과학과의 접목을 바탕으로 이루어지는 생물공학 분야에서의 응용이 각광을 받고있다 [2,3].

나노입자들 중 생물공학 분야에서 가장 보편적으로 활용되고 있는 금 나노입자는 합성 및 표면 기능화가 쉽고 효율적이며, 생체 친화적이면서 독특한 물리화학/광학적 특성을 가지고 있어 이를 활용한 다양한 연구가 활발히 보고되고 있다. Li 연구팀은 입자간 분산 정도에 따라 색이 달라지는 금 나노입자의 특성을 이용하며, cysteine을 정량적으로 검출하는 방법에 대해 보고하였다 [4]. 즉, cysteine이 Cu²⁺ 존재 하에 빠르게 금 나노입자에 결합, 응집하여 적색에서 청색으로 색상 변화를 일으키게 되는 현상을 기반으로 분광기를 사용하여 정량 분석하는 기술을 보고하였다. 이와 같은 금 나노입자의 응집현상에 따라 색 차이가 발생하는 현상은 DNA, 단백질, 세포 등 보다 댜앙한 생체분자 진단에 활용될 수 있다 [5]. 이 외로도 금 나노입자의 형광 소광 능력 및 전자전달능력을 이용한 바이오센서와 약물전달 및 치료제로의 응용도 활발히 연구되고 있다 [6]. 다만 금 나노입자는 그 높은 효용성에도 불구하고 환경 변화에 민감하여 안정성이 제한된다는 단점과 상대적으로 높은 생산 비용으로 인해 실제 활용이 제한되고 있다. 이에 비해 은 나노입자는 환원제 및 안정제의 조절, 전구체의 농도 등의 합성 조건 변화를 통해 입자를 원하는 크기 및 형태로 간편히 조절할 수 있는 장점을 가지고 있다 [7]. 다만 이러한 장점에도 불구하고, 분산 안정성이 떨어지는 단점이 있다 [8]. 자성 나노입자는 철, 니켈, 코발트와 같은 자성 원소로 구성된 입자이다. 자성 나노입자는 외부 자기장에 의해 유도되는 자기 공명 영상 (MRI), 약물전달, 세포 추적 및 분리 등 다양한 생물공학적 응용이 가능하며, 최근 과산화효소 등 효소 모사 나노입자 (나노자임)으로의 응용도 활발히 보고되고 있다 [9]. 다만 산화철을 제외한 자성 나노입자의 생분해 저항성 및 세포 독성 이슈의 해결 및 개선이 요구되고 있다 [10]. 이와 같이 최근 다양한 종류의 나노입자의 독특한 물리화학적 특성에 기반한 연구 및 기술들은 기존 한계점들을 탈피하고 보다 다양한 분야에서의 활용을 기대하게 하고 있다.

1700년대부터 염료로서 개발 및 사용된 프러시안블루(Prussian blue; PB)는 최근 나노입자로 개발되었을 때의 추가적인 독특한 특성이 밝혀지면서, 이를 활용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 [11]. 프러시안블루는 철 등 금속 이온과 유기 시안화물 (cyanide) 리간드로 구성된 Fe4[Fe(CN)6]3결정 구조를 갖는 다공성 배위 고분자 중합체 (coordination polymers)로서 독특한 정육면체 형태의 구조를 가진다. 이로인해, 넓은 비표면적, 3차원적 기공 및 제어 가능한 구조체로 가스 및 환경유해성 소분자 물질 흡착, 분리, 분해 및 저장,효소 모사 촉매 작용, 전극 제작 등에서 활발히 사용되고 있다 [12]. 또한 프러시안블루 나노입자는 활성산소 (reactive oxygen species; ROS)의 일종인 하이드록실 라디칼 (hydroxyl radical)의 높은 제거 활성을 가져 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있으며 과산화효소 (peroxidase; POD), 과산화수소분해효소 (catalase; CAT), 과산화물 제거효소 (superoxide dismutase; SOD)의 활성을 모방하는 나노자임 (nanozyme)의특성을 이용한 진단 분야에의 응용이 보고되고 있다 [13]. 또한 2000년 초반, 체내 방사성 세슘 및 티타늄을 제거하기 위한 경구용 해독제로서 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 승인됨으로써 생체 적합성이 입증된 바 있다 [14]. 이 외에도 구조적인 특이점으로 인해, 근적외선 영역 (NIR)에서 강한 흡수율을 보이는데, 이러한 특성을 이용한 자기공명영상 (MRI), 광음향영상 (PAI), 광열치료 (PTT)를 포함한 나노메디슨 등치료 분야에서도 매력적인 소재로서 주목되고 있다 [15]. 이러한 특성들과 더불어 높은 안정성, 간단한 제조 공정 및 낮은 생산 비용으로 인한 장점을 가지며, 의료, 환경, 진단 분야와 연관된 다양한 생물공학 분야에서의 응용 기술이 각광을 받고 있다 (Fig. 1) [13,15].

Figure 1. Illustration of the representative biotechnological applications of Prussian blue nanoparticles (PBNPs).

본 총설에서는 프러시안블루 나노입자의 대표적인 합성법과 이에 따른 물리화학적/촉매적 특성, 그리고 이러한 특성을 의료, 환경, 진단 분야에 응용한 최근 연구들을 소개하고, 프러시안블루 나노입자의 향후 연구 전망 및 해결할 과제에 대해 논하고자 한다.

프러시안블루 나노입자의 합성은 헥사시아노퍼레이트({Fe(CN)₆}^4-/{Fe(CN)₆}^3-)와 염화철 (FeCl₃, FeCl₂)의 혼합을 기반으로 하는 복합 전구체 합성법과 수열 반응을 기반으로 하여 헥사시아노퍼레이트를 전구체로 사용하는 단일 전구체 합성법으로 크게 두 가지 방법이 제시되어 있으며, 각기 다른 이점을 가지며 합성을 진행할 수 있다 [16]. 복합 전구체 합성법의 반응은 상온에서 진행되며, 염화철에서 비롯된 Fe³⁺ 또는 Fe²⁺와 헥사시아노퍼레이트의 반응 비율에 따라 청색 침전 또는 콜로이드 상태의 프러시안블루 나노입자를 수득할 수 있다. 복합 전구체 합성법은 반응 시간이 짧고 추가적인 환원제를 필요로 하지 않아 쉬운 합성법으로 입증되었지만, 분산 및 입자 형태의 불균일성과 낮은 재현성에 대한개선이 필요하다. 단일 전구체 합성법은 수열 반응을 기반으로 하여 고온에서 합성을 유도하여, 산성용액 내에서 전구체인 헥사시아노퍼레이트가 Fe³⁺ 또는 Fe²⁺ 를 서서히 방출하여 형성된 Fe 이온이 다시 헥사시아노퍼레이트와 반응함으로써 프러시안블루 나노입자의 합성이 일어난다. 위 반응에 소요되는 시간은 20시간 이상으로 상대적으로 느리게 진행되며, 고온 반응에서 기체 형태의 시안화수소의 발생으로 인해 대규모 생산에 어려움이 있다. 하지만 복합 전구체 합성법에 비해 균일한 나노입자를 얻어낼 수 있다는 장점이 있어 널리 이용되고 있다 [17].

프러시안블루는 Fe²⁺와 Fe³⁺ 양이온이 cyanide에 의해 교대로 연결된 입방체 구조를 갖는다. 프러시안블루의 일반적인형태는 Fe4[Fe(CN)₆]₃ · xH₂O 이며 수화 범위인 x는 10에서 16까지 다양하다. Fe³⁺ 이온은 시안화물의 질소 원자와 연결되어 있고, Fe²⁺는 시안화물의 탄소 원자에 의해 연결된 배위결합체를 형성하고 있다. 이러한 구조적 특성 때문에 프러시안블루 결정은 크고 균일한 공동의 직경을 갖는 열린 격자구조를 보인다. 격자의 공동에 다른 분자 또는 이온의 흡착이 가능한 제올라이트 (zeolite)와 유사한 성질을 갖는다. 이를 응용하여 방사성 이온의 흡착 및 약물전달 분야에 활용이 가능하다. 또한 격자 내에 Fe²⁺와 Fe³⁺가 서로 다른 배위 구역을 가지며 형성된 구조적 특이점에 의해 독자적인 특성이 파생된다. 구조 내 Fe²⁺와 Fe³⁺ 사이의 전하 이동에 의해 프러시안블루가 청색의 색상을 나타내게 되는데, 이와 같은 원리로650 nm에서 900 nm 사이의 근적외선 영역의 파장을 효율적으로 흡수할 수 있다 [18]. 또한 반응성이 높은 철 이온에 의해 산화적 특성과 자기적 특성이 나타나게 된다. 철 이온의 산화적 특성은 프러시안블루 나노입자가 효소의 촉매 기능을 모방하는 나노자임으로서의 특성을 갖게 한다. 천연 POD에서 기질로 사용되는 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB)혹은 2,2′-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)를사용한 실험에서 과산화수소의 존재 하에 프러시안블루 나노입자가 TMB와 ABTS의 산화를 유도하는 것이 관찰되었다 (Fig. 2) [19]. 이를 통해 프러시안블루 나노입자가 그 넓은표면적에 분포되어 있는 철 이온에 의해 산성 버퍼에서 과산화수소를 전자 수용체로서 사용하여 기질의 산화를 촉진하는 POD와 유사한 활성을 보임이 확인되었다 [20]. 또한 프러시안블루 나노입자가 중성 pH 조건에서는 POD 활성이 낮아지며, 알칼리성 환경에서는 거의 비활성 상태가 되는 것이 확인되었으며, 동시에 반응 용액에서 거품의 발생이 관찰되었다. 이를 통해 낮은 pH에서는 POD활성을 보이며 중성 pH이상의 높은 pH에서는 CAT와 유사한 활성을 보임이 확인되었다. 이는 높은 pH에서는 H₂O₂/O₂의 산화/환원 전위가 매우 낮기 때문에 H₂O₂가 O₂로 더욱 쉽게 산화될 수 있기 때문이며, CAT 유사 활성은 입자의 농도에 비례하여 나타났다[21]. 또한 xanthine/xanthine oxidase 시스템에서 생성된 초과산화물 (O^2-)이 프러시안블루 나노입자의 농도가 증가함에 따라 감소하는 것이 관찰되었으며, 이는 초과산화물의 환원이 프러시안블루 나노입자에 의해 촉진되어 과산화수소가 생성되는 SOD와 유사한 활성을 나타냄이 보고되었다 [20,21].이러한 프러시안블루 나노입자의 효소 활성을 모사하는 특성은 POD활성을 이용하여 H₂O₂를 감지하거나, CAT활성을이용하여 손상 부위에 ROS 제거 및 수준 조절과, 산소를 전달하여 치료를 보조하는 데 활용될 수 있다. 이처럼 프러시안블루 나노입자로부터 나타나는 다양한 특성은 진단/치료/환경 분야를 비롯한 생물공학 분야에 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다 [22].

Figure 2. Illustration of the enzyme-like activities by PBNPs. SOD catalyzes the conversion of superoxide into O₂ and H₂O₂; POD breakdowns H₂O₂ into the water; and CAT breakdowns H₂O₂ into oxygen and water [19]. Copyright © 2021, MDPI.

프러시안블루 나노입자의 격자 구조 내부에서 금속 이온인 Fe²⁺와 Fe³⁺ 사이의 전자 전달로 인하여 650 nm에서 900 nm 사이의 파장에 위치한 근적외선 영역에서 강한 흡수를 보이는 특징을 이용하여 광열 반응에 기반한 치료 분야로 응용하려는 다양한 시도가 보고되고 있다. 일반적으로 암 치료에 사용되는 화학요법은 암 조직뿐만 아니라 근처의 정상 조직에도 심각한 부작용을 초래한다는 단점을 가지고 있다. 때문에 최소 침습적 접근을 통한 종양 치료의 필요성이 대두되면서 광열 반응에 기반한 치료법이 주목받기 시작했다. 그러나 광열 치료를 단독으로 시행하는 경우 조직내 불균일한 열 분포의 문제로 인해 종양을 완벽하게 제거하기가 어려운 문제점이 남아 있었다. 이를 해결하기 위해 Xiaojun 연구팀은 프러시안블루 나노입자의 다공성 구조에 초음파 모니터링의 조영제 역할인 perfluoropentane (PFP)와 항암제인 doxorubicin (DOX)을 적재한 후, 높은 근적외선 흡수율을 이용하여 약물전달 및 광열 치료를 동시에 수행할 수 있는 플랫폼을 개발하였다 [23]. 프러시안블루의 많은 유효 결합 부위와 기공성에 의해 DOX가 1782.2 mg/g의 적재 용량 및 98%의 적재 효율을 보였다. 이러한 결합은 중성 pH에서 프러시안블루의 철 이온과 DOX의 작용기 (아미노기 및 카르보닐기)의 배위결합에 의해 이루어졌다. pH 7.4와 37.5°C에서는 48시간 후4.4%만 방출되었으며, pH 5.0과 37.5°C에서는 48시간 후34.7%가 방출되었고, pH 5.0과 42.5°C에서는 48시간 후 방출비율이 41.8%로 증가하였다. 이는 낮은 pH와 높은 온도에서 결합이 약해져 방출이 증가되는 것을 보여 주며 암세포 주변의 pH가 산성을 띄는 것과 레이저를 통한 광열 효과에 의해항암제의 방출을 효율적으로 조절할 수 있음을 보고하였다. 이를 통해 항암제의 부작용을 최소화하고 항암 효율을 높일수 있으리라 기대된다.

하지만 기존의 광열 치료는 고온의 반응을 유도하여 암 세포를 사멸시키기에 필수적으로 주변의 조직에도 간접적인 손상을 일으킬 수 있는 단점이 남아 있다. 이러한 문제를 개선하기 위해 Xian 연구팀은 다른 항암제인 Lonidamine (LN)과 비교적 적은 온도 변화로 기화를 유도할 수 있는, 약물 방출 차단제로서 DL-menthol (DLM)이 프러시안블루 나노입자 내부에 적재된 PBLM@CCM을 개발하였다 [24]. LN은ATP 생성을 저해하는 특성이 있는데, 이를 통해 열충격 단백질(Heat Shock Protein; HSP)이 ATP 가수분해를 통해 샤페론활성을 갖을 수 없게 되고 세포의 내열성 하락으로 이어져 보다 낮은 온도에서의 광열 치료를 유도할 수 있다. 연구 결과, PBLM@CCM은 정상 세포에는 낮은 독성을 보였지만, 4분 동안의 레이저 조사를 통한 광열 반응에서는 PBLM@ CCM의 농도 의존적으로 정상 세포 생존율이 감소 하였고20 μg/mL에서 12%로 가장 낮은 세포 생존율을 보였다. 이러한 결과는 LN이 적재되지 않은 PBM@CCM을 같은 농도로 사용하였을 때의 생존율인 45%보다 낮았다. 이를 통해 온도상승을 통해 PBLM@CCM 내부의 DLM이 기화되면서 내부의 LN이 세포에 방출되고, 방출된 LN이 ATP 생성을 저해하여 세포 사멸을 촉진하는 것을 입증하였다. 이후 연구진은 PBLM@CCM이 암세포에 내열성의 하락을 유도함을 입증하기 위해 세포 내 HSP90과 HSP70의 발현을 조사하였다. PBM@CCM과 레이저를 이용해 광열 효과를 유도한 그룹에서는 HSP90과 HSP70가 각각 24%, 34%씩 증가함을 보였고, 일반 가열을 통해 42°C의 온도를 맞춰준 그룹에서는 각각30%, 34%가 올라 온도에 따른 HSP의 샤페론 활성을 확인하였다. 이후 PBLM@CCM과 레이저를 이용해 광열 효과를 유도한 그룹에서는 HSP90과 HSP70가 모두 약 37% 감소하는것을 확인할 수 있었다. 이는 LN이 추가됨에 따라 HSP 활성을 감소시켜 내열성을 하락시킬 수 있음을 입증하였다. 최종적으로, 실제 종양 세포에 PBLM@CCM를 이용한 광열 치료를 실행하였고, 그 결과 치료된 종양의 평균 온도는 33.4°C에서 43.8°C로 급격히 증가하였으며 이는 내열성 하락의 결과로 해석된다. 이를 통해 낮은 온도에서 종양의 광열 치료가 가능함이 입증되었으며 이러한 계속적인 연구를 통해 프러시안블루 나노입자를 이용한 광열 치료가 임상적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

프러시안블루 나노입자는 생체 내의 주요 질병 원인 중의 하나인 ROS 제거에도 효과적으로 활용될 수 있다. Zhao연구팀은 열 민감성 하이드로겔 (poly (d,l-lactide)-poly(ethylene glycol)-poly(d,l-lactide) hydrogel; PLEL)을 프러시안블루와 결합하여 PBNPs@PLEL 시스템을 개발하여 ROS 제거를 통한 상처 치료법을 제시했다 [25]. 열 민감성 하이드로겔은 상온에서 용액 상태로 존재하기 때문에 약물을 쉽게 첨가할 수 있고 체온(37°C)에서는 응고되는 성질을 가져, 체내 다양한손상 유형에 적응하여 변형될 수 있으며, 응고 후에는 외부미생물의 침입을 막는 등 매개체로서 약물 전달을 통제할 수 있다는 장점이 있다. 또한 하이드로겔은 전단 속도가 증가함에 따라 점도가 감소하는 특성을 가지는데, 이를 이용하여주입형 치료제로써 다양한 손상 형태에 적응할 수 있게 조절할 수 있다. 연구진은 6시간 동안 H₂O₂ 처리를 받은 세포와 대조군 세포의 ROS 수준을 비교하였는데, 100 μg/mL 프러시안블루 나노입자 복합체로 처리된 세포에서의 ROS 수준이 더 낮게 나왔으며, 이는 대조군 세포와 비슷한 수준으로 떨어질 수 있음이 관찰되었다. 또한 실제 쥐의 임상 모델에서 진행된 손상 치료평가에서도 같은 결과를 보이면서100 μg/mL의 프러시안블루 나노입자 복합체로 처리되었을 때 상처 치료 효과가 증가함을 확인하였다. 이와 같이 프러시안블루 나노입자가 생체 내 ROS 제거를 통한 치료 활성을 띄는 것이 입증되면서 프러시안블루 나노입자가 염증 예방 및 세포 치료에 잠재적으로 기여할 수 있음이 기대된다.

프러시안블루의 결정성 격자 내부에 존재하는 다공성 구조는 넓고 균일한 기공으로 인해 이온, 소분자 물질 및 가스 흡착에 이점을 가지고 있다. 이에 기반하여 유기물 흡착 및 방사성 원소 제거와 같은 환경 분야에서 많은 응용이 이루어지고 있다. 특히 원자력 에너지와 방사성 물질을 기반으로 하는 산업이 활발해짐에 따라, 핵 폐기물 처리방법에 대한 연구의 필요성이 높아지면서 오염물질의 효율적인 제거를 위해 프러시안블루 나노입자의 특성을 이용한 연구가 활발히 이루어지고 있다 [26].

Zhaoyong 연구팀은 프러시안블루와 graphene oxide (GO), polyethylene glycol (PEG)를 polysulfone (PSf) 기질에 통합하여 오염수로부터 방사성 이온을 흡착, 처리하기 위한 나노여과막을 제작하였다 [27]. 이러한 막 분리 기술은 2차 오염이적고 조작이 간단하며 적응성 및 유지 효율이 높다는 장점이 있지만 비선택적 여과와 높은 에너지 소비, 낮은 물 투과성으로 인하여 활용 분야가 제한되는 단점이 존재한다. 도입된 나노여과막은 더 낮은 압력에서 더 높은 물 투과성을 제공하기 때문에, 기존의 단점을 보완하여 더 많은 분야에 응용될 수 있다는 장점이 있다. 연구진이 도입한 나노여과막에서 프러시안블루는 0.32 nm 크기의 다공성 격자 구조로 인해 효율적인 Cs⁺ 이온의 흡착 부위를 제공하였다. GO는 카복실, 카르보닐, 하이드록실 및 에폭시 등의 풍부한 산소 그룹을 통해 여과막의 친수성 및 전기음성도를 향상시켰다. 향상된 전기음성도는 용액 내 음이온에 대한 반발력으로 작용하여 더많은 양이온의 차단을 유도할 수 있다. PEG는 막의 입체적장애와 결합된 입자 간의 정전기적 상호작용에 의해 큰 표면적을 제공함으로써 프러시안블루 나노입자의 균일한 분산을 촉진하였다. 실험 결과 Cs⁺와 Sr²⁺에 대해 각각 99.5%, 97.5%에 이르는 제거율이 측정되었으며, 다양한 무기염과 유기물을 함유한 천연수의 처리에서도 높은 선택적 흡착의결과를 유지하였다. 이러한 우수한 여과 성능을 통해 프러시안블루 나노입자와 GO를 이용한 나노여과막이 실제 오염수에서 방사성 이온을 효과적으로 제거하는 데 큰 잠재력을 가질 수 있음이 보고되었다.

또한 프러시안블루 나노입자 구조체의 변형을 통하여 비표면적을 높여 방사성 이온의 흡착율을 높이려는 연구가 진행되었다 (Fig. 3) [28]. Na 연구팀은 chloroplatinic acid을 식각액으로 사용하여 농도에 따라 입방체 형태 입자의 표면을식각하여 각기 다른 모양의 입자를 형성시키고 그에 따른 비표면적과 활성의 변화를 보고하였다. 해당 연구에서 식각액은 합성 과정에 관여하여 그 농도별로 높은 표면 에너지를 갖는 입방체의 꼭지점, 모서리 그리고 면을 차례로 식각하여 꼭지점만 파인 구조 (truncated corners)부터 돌출면을 갖는 구조 (protrusive faces), 육각별 구조 (hexapods stars)까지 형성됨이 관찰되었다. 식각에 의한 형태적인 변화는 비표면적의 증가 외에도 표면 거칠기에 영향을 미쳐, 기공의 부피도 개선될 수 있다. 이를 통해 활성 부위인 철 이온의 외부 노출이 증가하면서 프러시안블루 나노입자의 활성과 흡착율이 유의미하게 증가됨이 보고되었다. 이를 활용한 Rhodamine B (RhB)의 광-펜톤 분해가 모델 반응으로 제시되었는데, 철이온의 반응에 의해 환원된 과산화수소가 RhB의 분해를 촉매하는 과정을 통해 입자의 활성을 비교한 결과, 비표면적의증가에 따라 RhB의 분해가 획기적으로 증가하였다. 60분 동안 일반 입방체 구조에서 16.6%의 제거가 이루어진것에 비해 동일 조건의 육각별 구조에서 97.1%의 제거가 이루어져 입자의 분해 효율이 크게 향상된 것이 입증되었다. 이를 통해 프러시안블루 나노입자의 오염수로부터 유기물질을 흡착, 분해하는 광-펜톤 시약으로서의 가능성과 함께, 입자의안정성을 향상시키는 데 기여함이 보고되었다.

Figure 3. SEM images of etched PBNPs by increasing chloroplatinic acid (a) PB-cubs, (b) PB-mtcs, (c) PB-mtes, (d) PB-mpfs, (e) PB-hpds, and (f) PB-hpss [28]. Copyright © 2019, American Chemical Society.

POD, CAT 및 SOD 등 자연 효소의 활성을 모방하는 특성을 보유한 프러시안블루 나노입자는, 자연 효소에 비해 우수한안정성과 활성, 그리고 낮은 생산 비용의 장점으로 인해, 유력한 나노자임으로서 진단 분야에 활용하는 연구들이 보고되고 있다. 특히 POD 모사 활성을 통해 H₂O₂를 매개로 TMB같은 기질을 산화시키는 반응은 비색법을 통하여 다양한 물질들을 검출하는데 활용될 수 있다. 또한 프러시안블루 나노입자는 풍부한 산화환원 전위를 갖는 특성으로 인해 ROS에 대한 제거 능력 또한 가지고 있음이 입증되었다. 이러한 특성으로 ROS를 진단하거나, 혹은 ROS에 의해 발생된 손상을 치료하거나 완화하는 분야에의 응용이 가능하다 [29].

자연계에서 중금속 이온인 구리를 검출하기 위하여 질량분석 및 크로마토그래피 등을 이용하여 검출이 주로 진행되는데, 이는 민감한 검출이 가능하다는 장점이 있지만, 복잡한 절차 및 정교한 기술을 필요로 하며 부피가 큰 기기를 동반해야만 하는 제약이 있다. 최근, Kavitha 연구진은 기존 방식의 한계점을 보완하기 위해 프러시안블루 나노입자의 POD 활성을 이용하여 cysteine과 복합체를 형성하여 구리이온을 검출하는 기술을 보고하였다 [30]. 항산화 특성을 가지고 있는 cysteine은 프러시안블루 나노입자의 POD 활성으로 인한 TMB의 산화를 방해하지만 구리 이온이 용액에 존재할 때, cysteine의 티올기와 상호작용하여 티올-구리 복합체를 형성하면서 라디칼에 의한 TMB의 산화 반응이 정상적으로 이루어져 선택적으로 구리를 검출할 수 있는 비색법이 가능하다. 이러한 비색법은 기존 방식과는 다르게, 휴대가 가능하고 육안으로 변화를 확인할 수 있기 때문에 쉽고 빠른 검출이 가능하다는 장점이 있다. 652 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과, 다른 금속 이온보다 구리 이온에서 최대 흡광도를 보였고 그 결과가 구리 이온의 농도에 따라 선형적으로 증가하는 것이 확인되었다. 이러한 TMB + 프러시안블루 나노입자 + cysteine의 구리 이온 감지 시스템은 0.007 mM의 낮은 검출 한계를 보여 실제 환경에서 사용 가능함을 보고하였다.

천연 효소인 horseradish peroxidase (HRP)를 이용하여 면역 진단을 수행하는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)에서도 프러시안블루 나노입자가 활용된 기술이 보고되었다 [31]. 기존 ELISA에서 TMB 산화를 위한 과산화수소의 환원에는 HRP가 주로 사용되어 왔다. 이를 통해 일반적으로 높은 감도와 정확도가 가능하지만, 효소의 고질적인 문제점인 높은 비용과 낮은 안정성 및 고체 표면에 대한 결합이 제한적으로 형성되는 단점이 있어 개선의 필요성이 논의되어 왔다 [32]. Khramtsov 연구진은 이러한 문제를 극복할 수 있는 대안으로서 항체에 HRP 대신 프러시안블루 나노입자를 활용하는 방법을 고안하였고, 이를 통해 보다 낮은 가격과 높은 안정성을 갖는 프러시안블루 나노입자 기반 면역진단 기술의 개발을 보고하였다. 전립선 종양의 표지자로 사용되는 prostate-specific antigen (PSA)에 대한 항체를 프러시안블루 나노입자에 수식하고, 면역 진단을 수행한 결과, 700 nm에서 높은 흡광도를 보였고 중성 pH에서 우수한 안정성으로 생리학적 조건에 적합한 성질을 갖는 면역 진단의 분석 라벨로 적용될 수 있었다. 그 결과 PSA 분석에서0.064 ng/mL의 검출 한계를 측정할 수 있었으며 임상적으로 전립선 종양의 위험도를 판단하기 위한 4ng/mL보다 낮은 값을 얻어 실제 진단에 적용될 수 있음이 보고되었다.

프러시안블루 나노입자는 마이크로 모터에도 성공적인 응용이 보고되었다 [23]. 마이크로 모터는 마이크로 및 나노 크기의 소자이며 효소 활성을 이용하는 나노 물질의 일종이다(Fig. 4). 효소 활성을 통해 과산화수소의 분해로부터 생성되는 산소를 연료로 사용하는 자율 운동의 특성을 나타내며, 반응에 따라 특정 위치에 고정되거나 이동하는 속도를 기반으로 기질을 정량 분석할 수 있다. 마이크로 모터 내부에 효소의 사용은 생체 내 약물 전달과 물질 분석 및 감지에 높은 가능성을 가지고 있지만, 안정성 및 효율에 대한 개선이 지속적으로 요구되어 왔다. Roberto 연구진은 마이크로 모터에프러시안블루 나노입자를 적용하여 효율성을 높인 방식을 고안하였고, 이를 통해 범죄 현장에서 분석 대상 물질인 신경작용제 neostigmine을 정량 하여 범죄 수사에 적용될 수 있는 가능성을 제시하였다 [33]. 5 μm 직경의 원뿔형 기공을 갖는 polycarbonate 막에 증착된 키토산을 주형으로 하는 프러시안블루/키토산 마이크로 모터를 제조한 뒤, 외부 hydrogel층에 글루타르알데하이드를 통해 acetylthiocholinesterase (ATChE)를 기능화하였다. 이렇게 마이크로 모터 표면에 접착된 ATChE가 중성농도에서 thiocholine (TCh)으로 분해되며, 분해된 TCh의 티올기가 프러시안블루 나노입자와 결합하여 POD 활성을 억제하게 되지만 neostigmine이 존재할 때 ATChE에서 TCh로 변환되는 반응이 저해되어 프러시안블루나노입자의 POD 활성이 정상적으로 작동되어 neostigmine을 성공적으로 검출할 수 있다. 정량 한계를 측정하기 위해, 프러시안블루/키토산 마이크로 모터를 neostigmine이 담긴 샘플에 15분간 배양 후 TMB와 과산화수소를 첨가하여 실시한 비색 반응에서 정량 한계(LOQ)로는 0.30 μM의 값을 얻었다. 이는 Neostigmine의 추정 치사량인 0.45 μM보다 낮은 값을 보임으로써, 프러시안블루 나노입자를 활용한 마이크로모터가 범죄 현장에서도 응용될 수 있음을 보고하였다.

Figure 4. Illustration of the enzyme mimicking PBNPs/chitosan/ACThE micromotors. (A) catalytic mechanisms of neostigmine sensor, (B) chemical process of inhibition in the presence of TCh [33]. Copyright © 2022 American Chemical Society.

프러시안블루 나노입자는 그 결정 및 화학 구조와 나노미터수준의 입자 크기로부터 유발되는 다양한 물리화학적 장점으로 인해 최근 다양한 분야에서 활발히 연구되고 있다. 특히, 생체 분자와 상호작용이 원활하고 생체 친화적인 특성으로 인해 의료, 환경, 진단 분야를 포함하는 생물공학 분야에서의 응용 기술이 각광을 받고 있다. 기존에 주로 사용되어온 금속 나노입자들은 합성 및 표면 수식이 까다롭다는 단점과 입자 자체의 독성을 가지고 있어 생체를 기반으로 이용하기에는 어려움이 있었지만, 프러시안블루 나노입자는 상대적으로 손쉬운 합성법을 통해 대량생산이 가능하며, 크기 및 구조를 다양하게 조절함으로써, 물리화학적/촉매적 활성을 조절할 수 있는 장점이 있으며, 생체 친화적이기 때문에, 체내/체외에서의 바이오마커 감지 및 치료, 유해물질 흡착 및 약물전달, 광열치료 등 다양한 생물공학적 응용 기술이 활발히 보고되고 있다.

프러시안블루 나노입자가 생물공학 분야에서 널리 사용되기 위해서는 다음과 같은 방향의 연구/기술 개발이 진행되어야 할 것이라 생각된다. 먼저 프러시안블루 나노입자의 효소모사 활성의 경우, 아직까지는 천연 효소에 미치지 못하고 있기 때문에, 그 활성을 획기적으로 향상시킨다면, 기존의 천연 효소를 광범위하게 대체할 수 있으리라 기대된다. 또한 생리적 환경에서의 분산 안정성이 상대적으로 떨어지는 문제가 존재한다. 이의 해결을 위해, 키토산 등을 안정제로 이용하여 프러시안블루 나노입자의 표면 에너지를 감소시키고 응집을 억제함으로써, 분산 안정성의 개선이 가능하리라 기대된다 [15,16]. 마지막으로 산업적인 활용을 위해서, 프러시안블루 나노입자의 안정적인 대량생산 공정 확립이 꼭 필요하다. 이와 같은 후속 기술개발을 통해 프러시안블루 나노입자가 보다 활발히 생물공학 기술개발 및 산업 현장에서 사용되리라 기대된다.

본 연구는 한국기초과학지원연구원의 지원을 받아 수행되었으며 (C280300), 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로한국연구재단의 지원을 받아 수행되었음 (NRF-2019R1A2C1087459).