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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2022; 37(4): 123-130

Published online December 30, 2022 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2022.37.4.123

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자를 이용한 알츠하이머병 바이오마커 검출

Detection of Alzheimer’s Disease Biomarker using Anti-NFL Antibody Conjugated Gold Nanoparticles

Hee-Won An1,2, Chi-Yeon Song1,2, Yu-Rim Ahn1,2, Ji-Yeon Park1,2, Miso Jeong3, Hyun-Hee Ryu3, Sukchan Lee3*, Hyun-Ouk Kim1,2*

1Department of Bioengineering, Division of Chemical Engineering and Bioengineering, College of Art, Culture and Engineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
2Department of Smart Health Science and Technology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
3Neurorive Inc. Suwon 16226, Korea

Correspondence to:Tel: +82-33-250-6272, E-mail : kimhoman@kangwon.ac.kr

Received: October 18, 2022; Revised: November 14, 2022; Accepted: November 15, 2022

Neurofilament light chain (NFL), one of the subunits of neurofilaments present inside neurons, is known as a biomarker of nerve axonal damage in early stage of Alzheimer's disease. Measuring the level of NFL is being actively studied worldwide because it can determine the extent of damage to nerve axons, especially in the early stages of Alzheimer's disease. However, ELISA based NFL detection techniques have several limitations because of expensive equipment and high cost. Herein, we perform the application of antibody conjugated Gold nanoparticles (ACNP) to detect NFL conveniently and efficiently. First, to conjugate Gold nanoparticles and antibody, carboxyl groups are modified on the particle surface to react the amine group of the antibody using EDC/NHS. Then, the prepared ACNP react with the NFL protein to detect NFL. ACNP were characterized by DLS, ELS, Microplate Reader and TEM. Detected NFL by ACNP was confirmed by Western blotting, and the detection efficiency and limit of detection were confirmed through the absorbance change. This platform for detecting NFL using ACNP, which provides a cheap, selective, and convenient response, is a promising tool for diagnosis of neuronal damage through NFL detection in the physiological-pathological range.

Keywords: Alzheimer&rsquo,s disease, gold nanoparticle, neurofilament light chain, antibody, surface modification, detection

알츠하이머병은 치매의 주요한 원인으로 노인인구 뿐만 아니라 모든 나이에 걸쳐 발생하며 전세계 치매 환자의 3분의2 이상을 차지한다고 알려져 있다 [1]. 알츠하이머병의 발병 원인은 다양하고 질병의 병리 생리는 매우 복잡하다 [2]. 알츠하이머병은 해마와 피질 영역의 측두엽 내측에서 신경 세포가 심하게 손실되어 신경 회로에 장애가 발생하는 질병으로 3단계로 진행된다. 무증상 단계, 경도인지장애 단계, 치매단계로 이루어지며 가장 두드러지는 증상은 기억력 장애이다 [3]. 무증상 단계에서는 기초적인 일상생활이 가능하지만, 운전 또는 요리에 어려움을 느낄 수 있으며, 평소 즐겨 하던 놀이나 활동에 흥미를 잃기도 하고, 기억력 저하로 최근의 일을 기억 못 하는 증상이 나타난다. 경도인지장애 단계에서는 혼자 일상생활을 하기에 어려움을 느끼며, 의사소통에 장애가 나타나 대화 도중 얼버무리게 되거나 티비나 책의 내용을 이해하는데 문제가 생긴다. 시공간 인지 능력 저하로 길을 찾기 어려우며, 단기적인 기억에 문제가 생기고, 우울감, 분노, 환각, 환청이 나타난다. 치매 단계에서는 혼자서는 일상생활이 불가능하며, 짧은 의사소통에도 어려움을 느끼고, 망상장애, 공격성 장애, 환각, 환청, 환시 등의 정신 이상 증상이 나타난다[4]. 알츠하이머병은 환자와 가족 및 간병인은 물론 건강 및 사회 복지 시스템과 사회 전반에 막대한 부담을 준다. 전세계적으로 수명이 증가함에 따라 알츠하이머병의 발병률이 증가하고 있지만 근본적인 치료제가 없는 상황이다 [5,6]. 알츠하이머병의 진단은 환자 및 모든 관련자들이 질병에 적응할 시간을 제공하고 재정적 지원, 비약물 및 약리학적 치료 등의 기회를 통해 환자들의 삶의 질을 개선하고 증상의 진행을 늦추는데 기여할 수 있다 [7].

최근 몇 년 동안 신경필라멘트 경쇄 단백질은 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 축삭 경화증, 파킨슨병 및 다발성 경화증을 비롯한 여러 신경 장애에서 축삭 손상의 잠재적인 혈액바이오마커로 부상했다 [8]. 신경필라멘트는 분자량에 따라 신경필라멘트 H-중쇄 (NFH, ≒200 kDa), 신경필라멘트 M-중쇄 (NFM, ≒145 kDa), 신경필라멘트 경쇄 (NFL, ≒68 kDa)로 이루어져 있고 N-terminal 머리 도메인, α-나선 막대 중심 도메인, C-terminal 꼬리 도메인을 가진다[9]. 신경필라멘트 단량체는 막대 중심 도메인 사이의 결합을 통해 평행 이량체를 형성하고, 두개의 이량체는 역평행 사량체를 형성한다. 8개의 사량체는 원통형 구조로 결합하여 신경필라멘트의 최소 단위를 이루고 미세섬유(≒6-8 nm) 및 미세소관 (≒24 nm)과 함께 세포골격을 형성하여 세포에 구조적 지지를 제공한다[10]. 신경 손상의 과정에서 NFL은 간질액으로 방출되어 뇌척수액을 거쳐 혈액으로 이동한다. 따라서 경도인지장애 및 초기 치매단계에서 알츠하이머병 환자의 혈장 샘플에서 NFL 수치가 증가한다 [11-13]. 최근 연구에 따르면 다발성 경화증 환자의 혈장 또는 혈청에서 NFL 수준이 증가했으며, 이는 NFL이 뇌 손상의 지표를 나타내는 유망한 혈액 바이오마커임을 나타낸다 [14,15]. 알츠하이머병 진단 시 아밀로이드베타, 타우, 인산화 타우 검출과 더불어 추가적인 하위 신경세포 손상 마커의 분석 역시 필요하다. 따라서 교섬유 산성 단백질 및 신경필라멘트 경쇄 같은 신경 독성에 따른 바이오마커 역시 무증상 단계에서 알츠하이머병을 진단하는 선별 바이오마커로 사용할 수 있다 [16].

기존 알츠하이머병 바이오마커 진단 기술에는 뇌 조직에 아밀로이드베타가 침착되어 있는 것을 바로 볼 수 있는 아밀로이드 PET/CT 방법이 있으며, 효소를 이용하여 항원과 항체 간의 반응 여부와 정도를 측정할 수 있는 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELSIA) 기반 알츠하이머병 바이오마커 검출법, 전극의 표면에서 항원-항체 및 전기화학 반응에 의해 특이적으로 발생하는 화학발광을 측정하여 알츠하이머병 바이오마커를 검출하는 전기화학발광 면역분석법이 있다. 현재 연구되고 있는 대부분의 비침습적이거나 최소 침습적인 알츠하이머병 진단 기술은 혈액에서 검출할 수 있는 아밀로이드베타, 타우, 인산화 타우 등을 이와 같은 방법으로 검출하는 방식이다 [17]. 기존 NFL 검출법 역시 ELISA 및 전기화학발광 면역분석법을 이용하여 뇌척수액이나 혈액에서 분포하는 NFL을 검출하는 것을 목표로 한다. 그러나 뇌척수액의 경우 요추천자의 침습적 방법으로 인해 환자에게 불편함을 줄 수 있어 질병 초기단계에서 혈액을 기반으로 하는 바이오마커 검출 기술에 대해 관심이 높아지고 있다 [18]. 따라서, 알츠하이머병에 대한 이상적인 진단 기술은 높은 정확도와 신뢰성을 가지며 비침습적이거나 최소 침습적이고, 대량 스크리닝에 사용하기 편리해야 한다 [19]. 본 연구에서는 NFL 검출을 위해 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자의 흡광 변화를 이용하였다.

바이오센서 분야에서 금속으로 만든 플라즈몬 나노입자는 높은 표면적 대 부피 비율과 입사광의 파장보다 작은 전도성 나노입자에 입사광파가 갇힐 때 발생하는 LSPR현상으로 인해 큰 관심을 불러일으켰다 [20]. 플라즈몬 나노입자 중에서 금나노입자는 합성 및 기능화의 용이성, 높은 안정성, 생체적합성 및 불활성으로 인해 바이오센서에 널리 사용되고 있다 [21,22]. 일반적으로 금나노입자는 흡수 계수가 매우 높고 표면 플라즈몬 공명에서 발생하는 독특한 광학적 특성으로 인해 기존 염료보다 광학 검출 방법에서 더 높은 감도를 가진다[23]. 표면 플라즈몬의 흡수 파장은 물질의 크기와 모양 그리고 나노입자 사이의 거리 등에 의해 변하며, 이와 같이 환경에 따른 민감한 변화를 가진 금나노입자는 센서 분야에서의 중요한 활용 가능성을 가진다 [24].

본 연구에서는 알츠하이머병의 혈액 바이오마커인 NFL을 검출하기 위해 항 신경필라멘트 경쇄 항체가 접합된 금나노 입자를 제작하였다. 금나노입자 표면은 CM-PEG-SH로 PEGylation하여 표면 카르복실화하였고, EDC/NHS 반응을 통해 항 신경필라멘트 경쇄 항체를 접합시켜 항체 접합 금나노입자를 제작하였다. 만들어진 항체 접합 금나노입자와 NFL을 반응시킨 후 흡광 변화를 측정하였으며, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 항체 접합 금나노입자와 NFL의 결합을 웨스턴 블랏에서 확인하였고, 이때 흡광 변화가 나타나는 것을 확인하였다. 최종적으로 제작된 항 신경필라멘트 경쇄 접합 금나노입자가 성공적으로 NFL을 검출하는 것을 확인하였다 (Scheme. 1)

Figure 8. Scheme. 1. Schematic illustration of the synthesis procedure of the antibody conjugated gold nanoparticles (ACNP) and absorbance change after reaction with neurofilament light chain.

2.1. 재료

본 실험에 사용한 시약인 Gold(III) chloride trihydrate, Sodium citrate tribasic, EDAC Hydrochloride는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 추가 정제 과정은 시행하지 않았다. CM-PEG-SH (molecular weight, Mw 3400)는 Laysan Bio Inc (Arab, AL, USA)에서 구입하였다. NHydroxysulfosuccinimide Sodium Salt는 TCI (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 50 K Amicon tube는 Millipore (Middlesex County, MA, USA)에서 구입하였다. Neurofilament (NM_006158) Human Recombinant Protein, Neurofilament Mouse Monoclonal Antibody [Clone ID: OTI3G2]는 Origene (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 2차 항체로 사용한 Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (ab205719)는 Abcam (UK)에서 구입하였다. 모든 합성 공정에서는 초순수 탈이온수 (DI water)가 사용되었다.

2.2. 금나노입자의 제조

구형 금나노입자를 제조하기 위해 구연산염 환원법을 사용하였다. 1 mM HAuCl4 수용액 100 mL을 97°C까지 중탕하여 온도를 올린 후 38.8 mM Sodium citrate 수용액 10 mL을 빠르게 첨가해준 뒤 30분간 교반하였다. 만들어진 금나노입자는 상온에서 식힌 후 50 K Amicon Tube를 사용하여 7,000 g에서 10분간 원심분리하여 정제 및 농축하였다.

제조된 금나노입자의 표면을 카르복실화시키기 위해 금나노입자 용액 (1.17 mg of Au/mL) 2 mL에 CM-PEG-SH 30 mg을 첨가하여 상온에서 24시간동안 교반 하에 반응시켰다. 얻어진 표면 카르복실화 개질 금나노입자는 14,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 결합되지 않은 CM-PEG-SH를 제거하였다.

금나노입자와 표면 카르복실화 개질 금나노입자의 흡광도는 마이크로플레이트 리더 (Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader, Agilent Technologies Inc, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 금나노입자의 형태는 고해상도 투과전자현미경(FE-TEM, JEM 2100F, Jeol Ltd, Japan)을 이용하여 평가하였고, 입자크기와 표면전하는 나노 입도 분석기 (ELSZ-2000S, Otsuka Electronics Co, Japan)와 제타 전위 측정기 (Zetasizer Nano ZSP, Malvern Panalytical, UK)를 이용하였다. 표면 카르복실화 개질 금나노입자의 표면 작용기 특성 분석에는 적외선 분광기 (ALPHA II, Bruker, Germany)를 이용하였다.

2.3. 항체 접합 금나노입자의 제조

항 신경필라멘트 경쇄 항체와 표면 카르복실화 개질 금나노 입자를 접합시키기 위하여 EDC/NHS 반응을 사용하였다. 표면 카르복실화 개질 금나노입자 용액 2 mL에 EDC (2.9 μmol) 5 μL, Sulfo-NHS (2.5 μmol) 5 μL, Anti-NFL Antibody(0.1 mg/mL) 10 μL를 첨가하여 4°C에서 6시간동안 교반 하에 반응시켰다. 이후 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 14,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후에 초순수 탈이온수에 재분산하였다.

2.4. 항체 접합 금나노입자와 NFL 반응 실험

제조된 항체 접합 금나노입자 용액 100 μL와 농도별 NFL 시료 (1.63/0.82/0.41/0.20/0.10 nM) 10 μL를 상온에서 1시간동안 반응하였다. 반응 후 금나노입자의 변화는 TEM으로, 흡광도의 변화는 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정하였으며, 웨스턴 블랏을 통해 밴드 형성 여부에 따른 반응성 확인을 수행하였다. NFL과 반응 후의 금나노입자 용액은 14,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 반응하지 않은 NFL을 제거하였다. 원심분리한 금나노입자는 웨스턴 블랏을 위해 SDS buffer와 혼합 후 100°C Heating block에서 5분간 가열하고 14,000 rpm, 4°C에서 10분간 원심분리하여 상층액을 사용하였다. 추출한 상등액은 12% acrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 5% Skim milk를 이용해 1시간 동안 blocking하고, 1차 항체를 상온에서 2시간 처리한 후에 2차 항체를 결합시켜 1시간 동안 반응시킨 후 Opti-4CN Substrate Kit (BioRad, CA, USA)를 사용해 관찰하였다. 웨스턴 블랏에서 얻은 밴드 강도는 ImageJ software (Rasband, 1997-2014)를 이용해 정량화하였다.

3.1. 금나노입자의 특성

금나노입자는 가열한 HAuCl4 수용액에 Sodium citrate를 첨가하여 구형 금나노입자를 제조하는 구연산염 환원법으로 제조되었다. 본 연구에서 합성된 금나노입자의 제조 과정에서의 색 변화를 Fig. 1(a)에 나타냈다. 초기 노란색을 띠는 금수용액은 Sodium citrate 수용액을 첨가 후 투명한 색으로 변하고, 점차적으로 짙은 남색에서 레드 와인색으로 변한다. 금 수용액에 첨가하는 Sodium citrate는 금 이온을 환원시키는 환원제이자, 금나노입자 표면을 둘러싸는 계면활성제 및 pH를 높이는 염기로서 작용한다.

Figure 1. Color change in the process of preparing GNP (a). GNP solution is initially yellow and after the addition of sodium citrate solution, it is transparent, then gradually changes from dark blue to red wine. TEM image of GNP. The TEM image displays clear lattice fringes and spherical shape of GNP (b). Particles sizes were determined by DLS (c). Absorbance spectra of GNP (d).

Fig. 1(b)의 TEM 이미지는 금나노입자의 특성과 형태를 보여준다. 제조된 금나노입자는 20 nm 내외의 균일한 크기와 구형 형태를 가지며 고유의 격자 무늬 특성이 나타났다. 금나노입자의 유체역학적 직경 (Hydrodynamic Diameter)와 흡광도는 나노 입도 분석기와 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 유체학적 직경은 입자 자체의 직경뿐만 아니라 입자표면에 흡착된 분자층의 두께 및 용매화 층의 두께도 포함하며, 금나노입자의 평균크기는 26.5 ± 2.3 nm, 최대 흡광값은 520 nm로 측정되었다 (Fig. 1(c), Fig. 1(d)).

3.2. 항체 접합 금나노입자의 특성

금나노입자 표면에 카르복실기를 개질하기 위해 CM-PEGSH로 PEGylation하였고, 항체를 금나노입자에 접합하기 위해 EDC/NHS 가교법을 사용하였다. CM-PEG-SH를 이용해 금나노입자 표면을 개질한 후 FTIR을 이용해 입자 표면 작용기 특성 분석을 Fig. 2에 나타내었다. 3505 cm-1와 3362 cm-1에서는 O-H stretching, 2989 cm-1와 2975 cm-1에서는 alkanethiol에서 alkyl group의 C-H stretching, 1568 cm-1에서는 카르복실기의 C = O stretching, 1388 cm-1에서는 alkyl group의 C-H deformation, O-H bending에 대한 1241 cm-1 피크와 alcohol terminated group의 C-OH stretching에 해당하는 1078 cm-1 피크를 확인하였다. FTIR 스펙트럼의 해당 결과로 금나노입자표면에 CM-PEG-SH가 잘 개질 되었음을 확인할 수 있다.

Figure 2. FTIR spectra of (ⅰ) GNP, (ⅱ) Carboxylated GNP.

아민기가 풍부한 항 신경필라멘트 경쇄 항체는 EDC/NHS가교결합을 통해 표면 카르복실화 개질 금나노입자의 카르복실기와 공유결합이 일어난다. EDC, NHS는 zero-linker로 불리며, 반응 중간에 잠시 개입했다가 최종적으로는 떨어져 나가는 물질로 작용기 사이의 공유결합을 도와주는 조력자 역할을 한다. Fig. 3(a), Fig. 3(b), Fig. 3(c)에서는 제조된 금나노입자의 TEM 이미지를 나타내었다. 항체 결합 후의 금나노입자 이미지에서는 입자 표면에 항체 결합으로 인한 명암대비가 발생하여 코팅층이 관찰되었다. TEM에서의 명암대비 현상은 시편의 두께차이 또는 구성성분의 차이에 의해 산란값이 달라져 일어난다. 금나노입자의 유체역학적 크기는 초기상태에서 평균크기는 26.5 ± 2.3 nm (Fig. 3(d)), 표면 카르복실화 개질 후 56.1 ± 11.5 nm (Fig. 3(e)), 항체 접합 후 124.3 ± 1.0 nm (Fig. 3(f))로 제조 과정에 따라 증가하였으며 단일 피크로 높은 균등성을 가짐을 확인하였다. TEM 이미지상의 금나노입자의 크기와 DLS로 측정한 유체역학적 크기의 차이는 금나노입자 표면에 카르복실기 및 항체를 개질하였을 때 나타나는 표면 흡착 분자층 및 용매화층의 변화로 인해 증가한 유체역학적 지름으로 인한 결과이다. 한편, 제조 과정에서 표면 개질된 금나노입자의 흡광도와 표면전하를 Fig. 4에 보였다. 초기 금나노입자의 최대 흡광값은 520 nm이고, 표면 카르복실화 개질 후 529 nm, 항체 접합 후 535 nm로 증가하였다 (Fig. 4(a)). 입자 크기가 증가함에 따라 흡수 피크는 더 긴 파장으로 이동한다. 일반적으로 구형 금나노입자는 520 nm에서 강한 흡수를 가지며, 용액은 선명한 붉은색을 띤다. 표면 전하는 초기 금나노입자는 −34.5mV이고, 표면 카르복실화 개질 후 −21.7mV, 항체 접합 후 −14.0mV로 표면 개질 과정에 따라 증가함을 확인하였다 (Fig. 4(b)). 금나노입자의 표면 전하는 입자의 특성 분석에 중요한 지표가 될 수 있는데, 표면 음전하는 금나노입자 표면에 적용된 Sodium citrate 이온에 의한 것으로 이는 입자 형성에 영향을 주는 요인이다.

Figure 3. TEM images of (a) GNP, (b) Carboxylated GNP, (c) Antibody conjugated GNP and Particles sizes of (d) GNP, (e) Carboxylated GNP, (f) Antibody conjugated GNP.

Figure 4. Absorbance spectra of Gold nanoparticles (a) and Zeta potential for (i) GNP, (ii) Carboxylated GNP, (iii) Antibody conjugated GNP (b).

3.3. 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자를 이용한 NFL 검출

항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자에 NFL 첨가 후, 항원 항체 반응에 의한 금나노입자의 응집 반응을 수행하였다. NFL을 첨가하지 않은 항체 접합 금나노입자의 경우에는 입자들이 단분산으로 잘 분포되어 있으나 (Fig. 5 (a)), NFL을 첨가한 항체 접합 금나노입자의 경우에는 입자 사이의 응집이 일어남을 확인하였다 (Fig. 5 (b)). 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자와 NFL 시료의 반응 전 후의 흡광변화를 분석하였으며 Fig. 6에 나타내었다. NFL과 반응하지 않은 control ACNP를 기준으로 1.63 nM NFL을 첨가한 ACNP에서 흡광 변화가 가장 크게 관찰되었으며, NFL 농도가 줄어들수록 흡광 변화의 크기가 감소함을 확인하였다. NFL 농도 별 반응 결과 0.41 nM 이하의 농도에서는 흡광 변화가 크게 나타나지 않음을 통해 검출 한계 농도 (Limit of Detection, LOD)를 LOD = 0.82 nM로 설정하였다. 이는 금나노입자 표면의 항체와 NFL 단백질 사이의 항원 항체 반응으로 인해 입자 표면에 NFL이 결합하여 금나노입자의 국소 표면 플라즈몬 공명에 변화를 유도해 나타나는 현상이다. 항신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자를 이용한 NFL 검출 시스템의 검출 한계 농도는 0.82 nM로 기존 ELISA 기반 NFL 검출 키트 (Neurofilament-Light Chain ELISA Kit [MBS9399603], MyBioSource, CA, USA)의 검출 한계 농도 0.05 nM 보다 높으나 기존 ELSIA 기반 키트의 검출 범위 (0.05 nM-1.6 nM)에 준한다. 따라서 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자 기반 검출 방법은 측정 과정이 간단하고 검출시간이 짧아 기존 ELISA 키트의 한계를 극복할 수 있는 새로운 검출 플랫폼으로 적용할 수 있다.

Figure 5. TEM images of Anti-NFL Antibody conjugated GNP (a) without NFL protein, (b) with NFL protein.

Figure 6. Absorbance spectra of anti-NFL antibody conjugated GNP(ACNP) without NFL protein (control) and with NFL protein.

항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자와 NFL 단백질의 반응은 웨스턴 블랏을 통해 정성 및 정량분석하였다(Fig. 7). 시료는 각각 항체 접합 금나노입자로 검출한 NFL, 원심분리로 제거된 반응하지 않은 잔여 NFL, Control NFL(0.09 μg/μL)로 구성하였다. 잔여 NFL에서는 밴드가 나타나지 않았으며, 항체 접합 금나노입자로 검출된 NFL 밴드를 ImageJ로 수치화한 결과는 Control (100%) 기준 40%로 확인되었다. 이와 같은 결과로 보아, 제조된 항 신경필라멘트 경쇄 접합 금나노입자가 NFL 검출에 적합함을 확인할 수 있다.

Figure 7. Comparison of detection levels of NFL protein by Western blot analysis.

본 연구에서는 평균 크기가 20 nm인 구형 금나노입자를 제조하였고 기능성 PEG를 이용해 표면 카르복실화 개질하였다. EDC/NHS 반응을 통해 금나노입자 표면 카르복실기와 항체의 아민기를 결합시켜 금나노입자 표면에 항 신경필라멘트 경쇄 항체를 접합하였다. 금나노입자에 표면 카르복실화 개질 및 항체 접합의 과정에서 입자의 크기는 증가하였고, 흡광 파장이 장파장으로 이동하였다. 제조된 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자와 NFL 단백질의 반응 후 웨스턴 블랏을 통해 만들어진 입자가 높은 반응성으로 NFL과 결합함을 확인하였다. 또한, NFL과의 반응 이후 흡광값이 감소하며 LOD= 0.82 nM의 검출한계를 가진다. 기존의 ELISA 기반 NFL 검출 기술은 Sandwich ELISA를 기반으로 하기 때문에 포획 항체, 검출 항체와 같이 2가지의 항체가 필요하며, 검출 과정에서 여러 번의 Washing 및 분석과정을 거쳐야 하므로 분석시간이 길고 비용이 높은 단점이 있다. 전기화학발광 면역분석법 역시 Sandwich 방법으로 인해 발광물질이 결합된 항체와 바닥에 고정된 항체가 필요하며, 절연체에서 전자를 발생하여 발광을 일으키기 전 투과막 통과 및 Washing 과정이 필요하다. 본 연구에서의 항 신경필라멘트 경쇄 항체접합 금나노입자를 이용한 NFL 검출 기술은 별도의 과정 없이 제작된 항체 접합 금나노입자를 NFL 시료와 반응시켜 흡광 변화를 통해 간단하게 검출할 수 있으며, 모든 과정이 1시간 내외로 측정이 가능하다는 장점이 있다. 우리는 제작된 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자가 생물학적 시료에서의 NFL 검출에 적용되기 전에 추가적인 최적화가 필요하다는 것을 알고 있습니다. 특히 다양한 단백질이 존재하는 체액에서 작동할 때도 선택성이 유지되는지 확인하기 위해 혈청 및 혈장과 같은 고도로 복잡한 시료를 사용한 검증이 수행되어야 합니다. 추후 생물학적 시료에서 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자의 NFL 검출 특이도 및 정확도 검증이 필요하고 혈청, 혈장 및 뇌척수액 시료를 통하여 검증을 진행할 계획이다. 그럼에도 불구하고, 본 연구에서의 항 신경필라멘트 경쇄 항체 접합 금나노입자는 알츠하이머병의 혈액 바이오마커인 NFL의 검출을 통한 알츠하이머성 치매 진단의 플랫폼으로 사용하는데 매우 유망한 후보라고 판단된다. 또한, 제조한 금나노입자에 다른 종류의 항체 또는 형광 염료를 접합할 경우 다양한 분야에도 응용이 가능할 것으로 기대된다.

본 연구는 2022년도 산학협동재단의 지원을 받아 수행되었음. 또한, 2021년도 강원대학교 대학회계 학술연구조성비로 연구하였습니다. (This study was supported by 2021 Research Grant from Kangwon National University)

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