전세계적으로 다양한 바이러스가 창궐하고 있고 의학적 분자진단, 농업 및 식품 검사, 법의학 분석 등에 고감도 및 고특이성을 갖는 초저농도의 유전자 서열을 검출하기 위한 간단하고 정확한 분석 방법을 개발하는 것은 중요하다 [1]. 신속하고 정확한 진단 방법의 개발을 통해 질병의 확산을 막을 수 있다. 아프리카에서 시작되어 전세계적으로 확산된 아프리카 돼지열병 (African swine fever virus, ASFV)은 DNA 바이러스성 출혈성 돼지 전염병으로서 사람에게는 감염이 감염되지 않으나, 돼지가 감염될 시 치사율이 100%에 육박한다 [2,3]. 아프리카돼지열병 바이러스는 p72 유전자서열에 따라 24개의 유전형으로 분류된다 [4]. 2018년 아시아 최초로 중국에서 발생보고가 나온 후로, 국내에서도 2019년 아프리카돼지열병바이러스가 발병했다 [5]. 이러한 아프리카돼지열병 바이러스는 사람에게는 전염되지 않으나, 시중에 나와있는 백신이나 치료제가 없어 조기에 질병을 진단해야 대규모 전염을 막을 수 있다 [6]. 본 연구에서는 아프리카돼지열병을 질병 유무를 판별하기 위한 진단체로 금나노입자를 이용하였다.

금나노입자란 금의 입자 크기가 나노미터인 것으로 10^-9 m 정도의 사이즈에 있는 입자를 이르는 말한다 [1,7]. 크기가 매우 작아 일반적인 광학현미경으로 관찰이 어려우며, TEM, SEM 등 고해상도 현미경을 이용하여 관찰할 수 있다[8]. 금나노입자를 제작하는 방법은 1951년 Turkevitch에 의하여 처음으로 보고되었는데 이때 DW상에서 금 이온을 시트르산을 이용하여 환원시켜 약 20 nm의 나노 입자를 제작하였다 [1,9]. 이후 1973년 Frens는 환원제와 안정화 물질의 몰비를 조절하여 16에서 147 nm까지 다양한 크기를 가지는 금나노 입자를 제작하는데 성공하였다 [1,7,8, 10]. 이때 금 이온과 안정화 물질의 몰 비를 변화시켜 크기를 조절할 수 있다.

금나노입자는 표면 플라즈몬 특성으로 인해 가시광선 영역의 고유한 파장을 가지고 있다 [11]. 이러한 특성은 금나노 입자의 모양, 크기, 형태 등과 관련이 있으며, 산화환원 반응, pH 반응 등 다양한 물리·화학적 반응에 따라 변할 수 있다[11,12]. 이러한 환경에 의해 어떤 영역에 해당하는 파장을 어느정도 흡수하고 반사하는지에 따라 금나노입자 콜로이드 용액의 색이 결정된다. 환경에 의해 변화된 금나노입자는 콜로이드 용액의 색상이 본래의 붉은색에서 응집이 일어나면 보라색으로 변화하기 때문에 이를 기반으로 한 다양한 비색 유전자 검출 방법에 적용할 수 있다. 1996년 Markin과 그의 연구진들이 처음 금나노입자 기반 비색 검출 연구를 진행하였고, 이후 수십년 동안 학계에서는 금나노입자를 기반으로 한 다양한 비색 유전자 검출 방법을 개발이 진행되어 왔다 [13,14]. 이 시스템은 별도의 기기 없이 유전자 검출을 육안으로 확인할 수 있다. 금나노입자를 제조하기 위해서는 산화환원 반응을 이용하는데 염화금산 (HAuCl4)을 구연산 나트륨 (sodium citrate)으로 환원시켜 금나노입자를 제조한다. 용매의 온도를 끓는점까지 올려 환원시키는 방법을 이용한다. 본 연구에서 사용한 금나노입자는 HAuCl4와 Sodium citrate 기반으로 만들어졌다. 금나노입자는 생체 내에서 면역 거부반응 없고 생체 적합성 됨을 나타내며 표적 효율, 표면 가공성 측면에서 우수한 특성을 나타내기 때문에 바이오분야에 적용되기 적합하다 [11].

이 실험은 금나노입자와 DNA Probe로 구성되었고, 금나노입자와 DNA Probe의 아데닌 (A) 사이의 관계성은 이전 논문에 의해 보고되었다 [9,10,13]. DNA의 염기 흡착 에너지 순위는 A > C > G > T 로 이루어져 금 표면과 흡착한다 [9]. 금나노입자와 DNA Probe는 모두 음전하이기 때문에 DNA가 장거리 정전기 반발을 극복하기 위해서는 염이 필요하다[13]. 이 방법은 낮은 농도의 염을 금나노입자와 천천히 반응시켜 금나노입자와 DNA Probe의 부착을 유도한다. 또한 DNA Probe와 상보적인 염기서열을 가진 Target DNA를 이용하면 금나노입자의 응집을 이뤄낼 수 있다 [1,8,9]. 이를 이용하여 후에 특정 질병의 유무를 판별하는 기술로 적용할 수 있다. 따라서 금나노입자를 형성한 뒤, 금나노입자에 DNA Probe를 부착한다. 금나노입자와 DNA Probe는 낮은 염 처리를 통해 정전기 반발에 대해 저항한 뒤, 부착된다 [13,14]. 금나노입자에 부착된 DNA Probe와 상보적인 염기서열을 가진 Target DNA인 합성된 ASFV DNA를 첨가하여 금나노입자의 응집을 유도한다.

우리는 최종적으로 금나노입자를 통해 아프리카돼지열병을 진단하는 것을 목표로 하며, 이를 위해 본 실험에서는 합성된 ASFV DNA와 상보적인 DNA Probe 서열을 제작하였고, (합성된 ASFV DNA: CCCCAAACTCCAGTAATGTC, DNA Probe 1: AAAAAAAAAATTTTTCGTTTGGGGTTTGAG, DNA Probe 2: AAAAAAAAAATTTTTATGATGACATTACTG) 금나노입자-DNA Probe와 합성된 ASFV DNA의 상보적인 결합을 확인, 환경에 따른 조건 실험을 진행하였다. 우리는 금나노입자에 DNA Probe 부착 후 용매의 양을 달리하는 조건 실험을 진행했을 때, 용매의 양이 적어질수록, 응집되는 금나노입자의 응집 크기가 커지는 것과 비색 변화가 나타나는 것을 성공적으로 검출할 수 있었다.

2.1. 재료

Gold(III) chloride trihydrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Sodium citrate tribasic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), DNA Probes and ASFV DNA Fragment (Bioneer, South Korea), 50 K Amicon tube (Millipore, Middlesex County, Massachusetts, USA)ELSZ-2000S (Otsuka Electronics Korea Co., Ltd., Seongnam-si, Republic of Korea), Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (Agilent Technologies, Inc., California, USA), Field Emission Transmission Electron Microscope (JEOL Ltd. , Tokyo , Japan), IKA® C-MAG HS hotplate stirrers (IKA Works, Staufen, Germany), Centrifuge(LaboGene, Lillerød, Danmark)

2.2. 금나노입자 제조

97°C 실리콘오일에 1 mM HAuCl4 수용액 100 ml을 넣고, 38.8 mM Sodium citrate 수용액 10 ml을 가해준 뒤 30분간 교반하며 중탕했다. 금나노입자를 충분히 식힌 후, 50 K Amicon Tube를 이용하여 농축 및 정제했다. 만들어진 금나노입자 용액은 4°C에 보관했다.

2.3. 금나노입자 – DNA Probe 부착

합성된 ASFV DNA와 이에 상보적으로 결합하는 서열을 가진 DNA Probe를 제작, 각 DNA Probes를 100 uM DNA Probe 15 ul을 금나노입자 용액 300 μL과 섞은 뒤, 16시간동안 4°C에서 반응시켰다. 이후, 0.1 M NaCl in 10 mM Phosphate buffer를 가해 준 후 40시간동안 4°C에서 반응시켰다. 0.1 MNaCl in 10 mM Phosphate buffer로 washing 3회 진행 후 마지막에 0.3M NaCl in 10 mM Phosphate buffer를 가해주었다.

2.4. 합성된 ASFV DNA와의 결합

금나노입자-DNA Probe 용액에 합성된 ASFV DNA Fragment(0.3 M NaCl in 10mM Phosphate buffer를 가해 o/n)를 가해준 후 60°C heating block에서 5분간 반응시킨 후, 얼음에서 30분간 반응시켰다.

3.1. 금나노입자 형성 및 DNA Probe 부착 확인

입자의 직경은 동적광산란법 (Dynamic Light Scattering, DLS)을 통해 측정되었으며 입자에 레이저를 조사하여 브라운 운동을 하는 입자에 산란된 정도를 이용하여 크기를 측정한다. 입자의 크기는 38.12 ± 0.66 nm로 측정되었으며, 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)은 전자선을 사용해 물질을 투과하여 형태나 분자구조를 확인하는 것으로, 구형의 금나노입자가 형성되었음을 보여준다. 콜로이드 상태의 금나노입자는 비색이 붉으며, DNA Probe 부착 후에도 붉은 빛을 유지하는 것을 확인할 수 있다. 금나노입자에 DNA Probe를 부착시킨 후 0.1 M NaCl in Phosphate buffer를 이용하여 washing한다. 이후 금나노입자-DNA Probe의 비색은 붉은색으로 유지되었지만, 금나노입자는 응집되어 비색이 보랏빛으로 바뀐 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 금나노입자-DNA Probe 1을 부착시킨 후 측정한 직경은 110.33 ± 7.56 nm이고, 금나노입자-DNA Probe 2는 123.79 ± 4.29 nm, 금나노입자-DNA Probe 1, 금나노입자-DNA Probe 2를 섞어 측정한 직경은 116.06 ± 6.25로 측정되었다. (Fig. 2 (a), (b), (c)). 이러한 결과는 금나노입자에 DNA Probe가 부착되어 그 크기가 증가하였음을 보여준다. 또한 투과전자현미경을 통해 각 금나노입자와 DNA Probe 부착물의 형태, 분산도 등을 확인하였다.

Figure 8. Scheme. 1. Colorimetric change using complementary binding of GNP and target DNA. When the DNA attached to the GNP and the target DNA are combined, it is aggregated and negative, and the non-target DNA are dispersed without binding, it is positive.

Figure 1. TEM images of (a) GNP (Bare) and it was determined by DLS. (b) From the left of each image, bare GNP, GNP-DNA Probe 1, GNP-DNA Probe 2. Bare GNPs to which DNA is not attached are aggregated when buffer is added. (c) ICP data after synthesizing gold nanoparticles. Indicates the concentration of gold nanoparticles.

Figure 2. TEM images of (a) GNP-DNA Probe 1, (b) GNP-DNA Probe 2 and (c) (a), (b) mix and it were determined by DLS.

3.2. 합성된 ASFV DNA 첨가 후 금나노입자 크기 변화 확인

입자의 직경은 동적광산란법을 통해 측정되었으며 (a) 금나노입자-DNA Probe 1, 금나노입자-DNA Probe 2 mix 150 μL과 합성된 ASFV DNA 10 μL를 부착시킨 후 크기는 443.22 ± 47.49 nm, (b) 금나노입자-DNA Probe 1, 금나노입자-DNA Probe 2 mix 75 μL과 합성된 ASFV DNA 10 μL를 부착시킨 후 크기는 763.21 ± 30.02 nm, (c) 금나노입자-DNA Probe 1, 금나노입자-DNA Probe 2 mix 75 μL과 합성된 ASFV DNA 20 μL를 부착시킨 후 크기는 682.01 ± 51.23 nm, (d) 금나노입자-DNA Probe 1, 금나노입자-DNA Probe 2 mix 37.5 μL과 합성된 ASFV DNA 10 μL를 부착시킨 후 크기는 975.50 ± 172.55 nm로 확인되었다. (Fig. 3)

Figure 3. Size for each volume (a) GNP 150 μL, ASFV DNA 10 μL, (b) GNP 75 μL, ASFV DNA 10 μL (c) GNP 75 μL, ASFV DNA 20 μL and (d) GNP 37.5 μL, ASFV DNA 10 μL were determined by DLS.

3.3. 합성된 ASFV DNA 첨가 후 금나노입자 흡광 변화 확인

입자를 UV spectrophotometer를 통해 측정한 결과 금나노입자와 금나노입자-DNA Probe 1, 금나노입자-DNA Probe 2, 금나노입자- DNA Probe 1-금나노입자- DNA Probe 2 mix의 흡광이 520 nm로 DNA Probe 부착 후에도 흡광이 변하지 않고 유지되는 것을 통해 금나노입자가 응집되지 않은 것을 확인하였다. (Fig. 4(a)) 금나노입자-DNA Probe에 상보적인 합성된 ASFV DNA를 첨가하였을 때 각각 금나노입자-DNA Probes 150 μL와 합성된 ASFV DNA 10 μL, 금나노입자-DNA Probes 75 μL와 합성된 ASFV DNA 10 μL, 금나노입자 -DNA Probes 75 μL와 합성된 ASFV DNA 20 μL, 금나노입자-DNA Probes 37.5 μL와 합성된 ASFV DNA 10 μL의 흡광은 520 nm에서 공통적인 peak가 나타났고, 금나노입자-DNA Probes 37.5 μL와 합성된 ASFV DNA 10 μL에서 649 nm로 장파장으로 이동한 것을 확인하였다 (Fig. 4(b)).

Figure 4. Absorbance spectra (a) GNP and GNP-DNA Probes. Absorbance is maintained after binding. (b) GNP-DNA Probes-ASFV DNA. Absorbance spectrum (Green) is red shifted.

3.4. 합성된 ASFV DNA 첨가 후 금나노입자의 비색 변화 및 이미지 확인

금나노입자에 DNA Probes 부착 후 상보적인 서열의 합성된 ASFV DNA 첨가 시, 각 용량에 따라 금나노입자의 비색 변화가 관찰되었다. 금나노입자-DNA Probes 37.5 μL, 합성된 ASFV DNA 10 μL 첨가한 입자의 경우, 용액의 비색이 붉은 빛에서 푸른빛으로 변화한 것을 확인하였다. 또한 투과전자 현미경을 통해 금나노입자-DNA Probes 37.5 μL, 합성된 ASFV DNA 10 μL를 첨가한 입자를 관찰하였을 때 입자들이 응집한 모습을 확인하였다 (Fig. 5).

Figure 5. (a) Colorimetric by volume of GNP. From left: GNP-DNA Probes 150 μL + ASFV DNA 10 μL, GNP-DNA Probes 75 μL + ASFV DNA 10 μL, GNP-DNA Probes 75 μL + ASFV DNA 20 μL, GNP-DNA Probes 37.5 μL + ASFV DNA 10 μL. TEM images of (b) GNP-DNA Probes-ASFV DNA (GNP Volume 37.5 μL).

3.5. 비표적 바이러스와의 비색 및 흡광 차이 확인

Target에 상보적인 DNA Probes를 부착한 금나노입자가 ASFV에 특이적인지 확인하기 위해 우리는 비표적 바이러스(Non Target: 5’-TCCTAAACACCACAACGAAC-3’)와의 비교 실험을 진행하였다. 금나노입자-DNA Probes 부착 후 표적 (ASFV)의 샘플은 응집이 되어 비색이 푸른색으로 변한 반면, 비표적 (Non Target)의 샘플은 비색이 붉은색으로 유지되었다. 또한 흡광 역시 표적 샘플은 장파장으로 흡광 값이 이동하였으나, 비표적 샘플은 금나노입자의 흡광값을 유지하는 것을 확인하였다 (Fig. 6). 또한 실험군과 시중에서 사용되고 있는 A사, B사의 제품과의 비교를 통해 실험군이 가장 효율적인 결과를 나타내는 것을 확인하였다 (Table 1).

Table 1 Detdction limited comparison table with commercially available products. The experimental group showed the most efficient results

	Measured Value	Result
Experimental Group	10 μL	Positive
Company A	106−107TCID 50/ml	Positive
Company B	50 μL	Positive

Figure 6. Colorimetric change by adding 10 μL each of target and non-target to gold nanoparticles by binding complementary DNA probes to the target. (b) Confirmation of absorbance of the samples in (a). The absorbance of the sample with the target (ASFV) changed.

3.6. 금나노입자-DNA Probe 기반 아프리카돼지열병(ASFV) 조기 진단 키트 시제품

금나노입자-DNA Probe 기반 아프리카 돼지열병 조기 진단키트 시제품을 구성하였다. 구성은 금나노입자-DNA Probe 부착 용액 및 용액 통과 멸균 면봉, 바이러스 용해 완충액, 일회용 스포이드의 구성이다. 멸균 면봉을 통해 돼지의 체액을 채취하고, 바이러스 용해 완충액을 통해 아프리카돼지열병바이러스를 용해시킨 뒤, 스포이드를 통해 금나노입자-DNA Probe 부착 용액에 넣으면 금나노입자-DNA Probe와 ASFV DNA가 결합하며 응집되어 비색이 붉은빛에서 푸른빛으로 바뀌게 된다 (Fig. 7).

Figure 7. A kit for early diagnosis of African swine fever based on a gold nanoparticle-DNA probe. It consists of a gold nanoparticle-DNA probe solution and a sterile cotton swab. Red is negative, blue is positive.

본 연구에서는 금나노입자에 DNA Probe를 부착시켜 Target DNA인 아프리카돼지열병 서열 (합성된ASFV DNA)와 결합하며 비색 변화를 확인하였다. 금나노입자에 Target DNA인 합성된 ASFV DNA와 상보적인 서열을 가진 DNA Probe를 부착하였고, 이를 TEM 및 DLS, UV spectrophotometer 측정으로 확인하였다. 부착 후 입자의 크기는 증가하였고, 흡광도를 통해 금나노입자와 금나노입자-DNA Probes 부착 후에도 흡광도 변화가 없으므로, 입자가 응집된 상태가 아닌 콜로이드 상태로 분산되어 있음을 확인하였다. 또한, 0.1MNaCl in 10 Mm Phosphate buffer로 Washing을 진행하였는데, DNA Probe가 부착된 금나노입자의 경우 응집이 일어나지 않고 붉은색으로 비색이 유지된 반면, 금나노입자는 0.1MNaCl in 10 mM Phosphate buffer 첨가 후 푸른빛으로 비색이 변화하며 응집된 것을 확인할 수 있었다. 금나노입자와 합성된 ASFV DNA 결합 이후, 입자의 크기와 흡광이 변하며 장파장으로 이동한 것을 확인하였고, TEM 이미지에서 입자의 응집을 확인하였다. 총 용량이 낮아질수록 금나노입자-DNA Probe-합성된 ASFV DNA의 비색이 푸른빛을 띠는 것을 확인하였다. 확인한 연구결과를 바탕으로 현장에서 기기 없이 비색 변화를 통해 육안으로 확인할 수 있는 아프리카돼지열병 조기진단 플랫폼을 개발하였다.

이 작업은 농림축산식품부에서 지원하는 ‘가축질병대응기술개발사업’ (320056021HD020) 지원을 받았습니다. 또한, 2021년도 강원대학교 대학회계 학술연구조성비로 연구하였습니다. (This study was supported by 2021 Research Grant from Kangwon National University) 본 연구는 2022년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신 사업의 결과입니다. (2022RIS-005). 본 연구는 2020년도 중소벤처기업부의 기술혁신개발사업(S2846050) 지원에 의한 연구입니다.