최근 자연과 환경을 생각하는 관심도가 높아짐에 따라 웰빙문화, 클린 뷰티, 비건 뷰티 등 유해 성분을 배제하고 자연 환경을 고려하여 만드는 유기농 트렌드의 중요도가 높아지고 있다 [1]. 이에 따라 천연물 활용 가능성에 대해 중요도가 높아지고 있으며 기능성 화장품 소재로서의 연구가 활발히 진행되고 있다. 동백나무(Camellia japonica)는 동백나무과(Theaceae) 동백속(Camellia)에 속하는 상록교목이며, 서해안의 대청도에서 동해안의 울릉도까지 주로 해안과 섬에 분포하는데, 특히 전라남도 지역이 전국 식재 면적의 67%를 차지하고 있다 [2]. 동백에 관한 연구로는 토혈증에 사용한다는 보고가 있으며, 알코올 흡수억제 효과와 피부 미백 작용 등의 생리 활성이 보고되었다 [2]. 또한 동백유의 일반 성분분석과 유박의 아미노산 함량을 연구하여 동백 종실의 지방산이 스테아릭(stearic), 팔미틱(palmitic), 리놀레익(linoleic) 및 올레익산(oleic acid) 등으로 구성되어 있음을 밝혔다 [3]. 또한 동백나무 잎, 꽃, 종자 추출물에서 에피카테킨(epicathechin), 카테킨(cathechin), 멜린(mellin), 피페콜산(pipecolic acid), 오이게놀(eugenol), 트리테르펜(triterpene), 탄닌(tannin), 벤조노이느(benzenoid), 스테로이드(steroid), 플라보노이드(flavonoid), 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 등 항산화에 효능을 보이는 폴리페놀류 성분을 함유하는 것으로 보고되었다 [4]. 동백나무에 관한 연구로는 잎과 꽃 부위 메탄올 추출물에 대하여 항미생물 활성에 대한 연구가 진행되었고, 동백나무 잎 추출물의 피부질환균 항균효과에 대한 연구도 진행되었다 [5,6].

덖음이란 순우리말로 찻잎, 곡식, 약재 등을 첨가물 없이 볶아서 익힌다는 뜻이다. 차에서 덖음은 생잎의 수분, 풋내, 쓴맛 같은 향미를 감소시키고 새로운 향미와 맛을 증가시켜 녹차 등의 제품에서 주로 사용되고 있다 [7]. 덖음의 온도는 250-300°C에서 진행되고, 덖음 시간은 5-10분 정도로 알려져 있다 [8]. 기존의 연구에서 녹차와 비파 잎을 덖음 처리를 진행했을때 녹차의 카테킨을 산화시켜 테아플라빈(Theaflavin)과 테아시넨신(theasinensin)을 생성한다고 알려져 있다 [9]. 동백 나무 잎을 덖음 처리를 했을 때 폴리페놀(polyphenol)의 함량이 약 2배이상 높게 나타나고, tannin의 함량이 감소하는 것으로 알려져 있다 [8]. 또한 동백나무 Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Listeria monocytogenes 및 Staphylococcus aureus 등 항균에 효과를 보이는 것으로 보고되었다 [10]. 그러나 현재 동백 나무 덖음 잎 추출물에 대한 항산화 및 항균활성에 대한 연구는 미미한 실정이며, 특히 피부질환 유발균인 말라세지아 퍼퍼(Malasseiza furfur), 말레세지아 파키더마티스(Malasseiza pachydermaits), 스테플로코코스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)에 대해 염증과 백선에 관한 연구는 이뤄지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 동백 나무 덖음 잎을 추출 용매를 달리하여 각 추출물의 항산화 활성 및 HPLC 분석을 통해 다양한 유효 성분을 검증하고 미생물 3종을 접종하여 동백 나무 덖음 잎이 기능성 화장품의 천연 소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.

2.1. 동백 덖음 잎 추출물 제조

본 연구에 사용된 동백 나무(Camellia japonica) 잎은 전라남도 산림자원연구소에서 제공받았다. 동백나무 잎은 100°C에서 60분간 autoclave를 사용하여 찌고, 그 후 40°C dry oven에서 건조시켰다. 건조된 동백나무 잎을 frying pan을 이용해 240°C, 5분간 덖는 과정을 2회 거쳐 동백 덖음 잎을 제조하고 분쇄하여 사용하였다. 추출 용매에 따른 동백 덖음 잎의 활성을 확인하기 위해 열수, 70% EtOH, 100% EtOH을 용매로 사용하여 추출을 진행하였다. 열수 추출물(hot water)은 동백덖음 잎 분말 30 g을 증류수 300 mL에 혼합시킨 후 auto clave를 이용하여 100°C, 10분 동안 추출하였다. 추출물은 여과지 (Whatman No. 2)와 감압 장치를 이용하여 여과한 후 회전감압 농축기 (rotary vacuum evaporator)로 농축 후 동결 건조하여 사용하였다. 70% EtOH 추출물은 동백 덖음 분말 30 g을 70% EtOH 300 mL에 혼합시킨 후 80°C, 600 rpm으로 6시간동안 환류 추출을 진행하였다. 추출물은 여과지(Whatman No. 2)와 감압 장치를 이용하여 여과한 후 회전 감압 농축기(rotary vacuum evaporator)로 농축 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다. 100% EtOH 추출물은 동백 덖음 분말 30 g을 100% EtOH 300 mL에 혼합시킨 후 80°C, 600 rpm으로 6시간 동안 환류 추출을 진행하였다. 추출물은 여과지(Whatman No. 2)와 감압 장치를 이용하여 여과한 후 회전 감압 농축기(rotary vacuum evaporator)로 농축 후 동결 건조하여 사용하였다. 수득률을 구하는 식은 다음과 같다.

Yield%=건조 후 시료의 무게g/추출 전 시료의 무게g×100

Figure 1. Isolation diagram of Camellia japonica leaves extracts.

2.2. 항산화 활성

2.2.1. DPPH free 라디칼 소거능 측정

동백나무 덖음 잎 추출물의 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능을 측정하기 위하여 Blois의 방법을 참고하여 진행하였다 [11]. 항산화 활성을 측정하기 위해 동백덖음 잎 열수, 70% EtOH, 100% EtOH 시료를 50-800 μg/mL 농도로 제조하여 사용하였다. 각 농도별 시료 200 μL에 0.25 mM DPPH 시약 800 μL를 혼합하여 암실에서 15분 동안 반응시킨 후, Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader를 이용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 라디칼 소거능은 다음과 같은 식을 이용하여 얻어졌다.

Radical scavenging activity%=Acontrol−Asample/Acontrol×100

2.2.2. ABTS 라디칼 소거능 측정

동백나무 덖음 잎 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 확인하기 위하여 Lee의 방법을 참고하여 진행하였다 [12]. 7 mM ABTS 시약과 2 mM potassium peroxodisulfate 각각 1 : 1 비율로 혼합 후 암실에서 19시간동안 ABTS radical를 형성시켰다. 이후 PBS (pH 7.4)를 이용해 ABTS 시약을 4배 희석하여 ABTS 용액의 흡광값이 0.80 ± 0.02가 되도록하였다. 동백덖음 잎 열수, 70% EtOH, 100% EtOH을 50-800 μg/mL 농도로 제조하여 사용하였다. 각 농도별 시료 200 μL에 ABTS 시약 1,000 μL를 혼합하여 암실에서 15분 반응시킨 후, Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader를 사용하여 730 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 라디칼 소거능은 다음과 같은 식을 이용하여 얻어졌다.

Radical scavenging activity%=Acontrol−Asample=Acontrol×100

2.3. 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량 분석은 Folin-Ciocalteu 방법을 활용하여 측정하였다 [13]. 표준물질로 gallic acid를 사용하였으며 표준물질을 각 농도별로 희석하여 검량 곡선을 작성하여 총 폴리페놀 함량 분석에 이용하였다. 추출물의 농도는 1 mg/mL로 제조하였고 제조된 시료 500 μL, 0.2 M Folin-Ciocaltue’s phenol 시약 500 μL, 2% sodium carbonate(w/v)를 차례대로 혼합하였다. 상온에서 30분동안 반응시킨 후 흡광도는 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader를 이용하여 750 nm에서 측정하였다.

2.4. 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량 분석은 Jo의 방법을 사용하여 측정하였다 [14]. 표준물질로 quercetin를 사용하였으며 각 농도별로 희석한 표준물질을 사용한 검량 곡선을 작성하여 총 플라보노이드 함량 분석에 이용하였다. 추출물의 농도는 1 mg/mL로 제조하였고 제조된 시료 500 μL, methanol 1.5 mL, 1 M potassium acetate 100 μL, 증류수 1.4 mL를 차례대로 혼합하였다. 상온에서 40분동안 반응시킨 후 흡광도는 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader를 이용하여 415 nm에서 측정하였다.

2.5. HPLC를 이용한 폴리페놀 함량 분석

동백나무 덖음 잎 추출물에 함유된 폴리페놀류와 비타민류의 정량분석을 하기 위하여 HPLC (SPD-20A, SHIMADZU CO., Japan)를 이용하여 유효성분을 확인하였다. 이때 폴리페놀 표준물질로 gallic acid, catechin, (-)-epicatechin, rutin, tannic acid, quercetin, kaempferol, 4-hydroxybenzoic acid를 사용하였고, 비타민 표준물질로 thiamine hydrochloride, nicotinamide, niacin, L-ascorbic acid, folic acid, B12를 사용하였다. 표준 물질은 100 μg/mL 농도로 실험을 진행하였으며, 추출물은 1,000 μg/mL 농도로 제조한 후 0.45 μm syringe filter로 여과하여 사용하였다. HPLC 분석조건은 다음과 같다. Column은 Shimpack GIS-ODS (C18, 4.6 × 250 mm, 5.0 μm, Shimadzu Co., Japan), flow rate는 1.0mL/min, injection volume은 20 μL로 분석하였다. 이동상은 water (A, in 0.1% phosphoric acid)와 acetonitrile (B)를 사용하였다. 이동상의 gradient 조건은 이동상 (B)를 기준으로 0-10min: B(8-8%), 10-14 min: B (8-16%), 14-20 min: B (16-16%), 20-25 min : B (16-19%), 25-30min : B (19-22%), 30-40min : B(22-100%), 40-45 min : B(100-100%)로 하였으며 wavelength는 280 nm에서 측정하였다.

2.6. 항균활성 측정

2.6.1. 사용 균주 및 배지

동백 덖음 잎의 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH의 항균활성을 탐색하기 위해 피부염증 관련 균주 Staphylococcus epidermidis (KCTC 3958), 백선 관련 균주 Malassezia pachydermatis (KCTC 27587), 비듬 유발 관련 균주 Malassezia furfur (KCTC 7743)의 총 3종의 균주를 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 실험에 사용하였다. S. epidermidis는 Tryptic soy agar (TSB + 1.5% Agar; BD DifcoTM, USA) 배지로 37°C에서 24시간 배양하였다. M. pachydermatis는 Sabouraud dextrose agar (SDB + 1.5% Agar; BD DifcoTM, USA) 배지로 37°C에서 4일간 배양하였다. M. furfur는 modified Leeming & Notman agar (LNB + 1.5% Agar; Kisan bio MB Cell, Korea) 배지로 30°C에서 4일간 배양하였다. 모든 균주는 각각 3회씩 계대 배양하여 활성도를 높여 사용하였다.

2.6.2. Disk diffusion assay

동백 덖음 잎의 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물의 항균활성 유무를 확인하기 위해 disk diffusion assay를 활용하였다. 각각의 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 100 mg/mL 농도로 제조하였으며, 121°C에서 15분간 멸균 후 건조시킨 8 mm paper disc에 1.25 mg/mL, 2.5 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL 농도의 paper disc를 제작하였다. 이후 TSA, SDA, mLNA를 제작 후 121°C에서 15분간 멸균하여 90 mm petri dish에 굳혔으며, 액체배지에서 활성화된 3종의 균주를 고체배지에 골고루 도말하였다. 균이 도말된 petri dish에 각각 control과 동백나무 덖음 잎 추출물 샘플 disc를 배치하였으며, S. epidermidis는 37°C에서 24시간, M. pachydermatis는 37°C에서 4일, M. furfur은 30°C에서 4일 배양 후 결과를 관찰하였다. 항균 활성의 유무는 paper disc 주위로 생기는 저해환 (inhibition zone)의 지름을 측정하였으며, 모든 실험은 5회 반복하여 측정하였다.

2.6.3. 최소저해농도 (Minimum inhibition concentration, MIC) 측정

최소저해농도 측정은 Elshikh, Grela, Perumal의 방법을 변형하여 micro plate에서 수행되었다 [15-17]. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5–diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 멸균수에 0.5 mg/mL로 희석하여 제조하고, 동백나무 덖음 잎 추출물을 100% dimethylsulfoxide (DMSO, v/v) + 0.5% tween 80 용액으로 희석하여 제조하였다. 96 well에 순서대로 NB 배지를 50 μL씩 분주하고 농도별로 희석된 시료를 100 μL씩 분주하였다. 배양된 균 S. epidermidis, M. pachydermatis, M. furfur를 순서대로 50 μL씩 접종하였다. 24시간 배양 후 0.5 mg/mL MTT 50 μL를 각 well에 분주해 30분간 발색반응을 진행하였다. 색 변화의 정도에 따라 균의 성장을 파악하였고 색 변화가 없는 마지막 농도를 최소저해농도로 하였다.

2.7. 통계처리

본 실험에서 얻어진 모든 결과값은 3 회 이상의 반복 실험을 통하여 실험 결과값의 평균±표준오차로 나타내었다. 이에 대한 통계적 분석은 SPSS 26 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 사용하여 Duncan 방법으로 one-way ANOVA 분석을 통하여 통계분석을 실시하였으며, p<0.05 이내가 되는 값을 선별하여 유의성이 있다고 판단하였다.

3.1. 동백 덖음 잎 추출물 수율

본 연구에서는 동백나무 덖음 잎을 용매에 따라 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물로 제조하였고, 각 추출물의 수득률은 Table 1에 나타내었다. 70% EtOH 추출물이 4.73%로 가장 높았으며, hot water 4.60%, 100% EtOH 2.76%로 확인되었다. 기존의 연구에서 100°C에서 60분 추출한 열수추출물과 70% methanol을 사용하여 25°C에서 48시간동안 추출한 추출물의 수율은 5.3-16.5%였으며, 동백나무 잎은 추출 용매에 따라 추출 수율에 차이를 보이는 것으로 확인되었다[18].

Table 1 Yield results of heat-treated Camellia Japonica leaves

Sample	Weight (g)	Yield (%)
Hot water	1.36	4.60
70% EtOH	1.42	4.73
100% EtOH	0.827	2.76

3.2. 항산화 활성 측정 결과

3.2.1. DPPH 라디칼 소거능 측정 결과

DPPH free radical은 폴리페놀과 같은 항산화 물질과 반응하게 되면 전자를 내어주면서 안정한 분자가 되는데 항산화 활성을 측정하는데 비교적 간편하고 육안으로 확인할 수 있다는 점에서 널리 사용되는 방법 중 하나이다 [19]. 본 연구에서는 추출 용매별 동백 덖음 잎 추출물의 DPPH free radical 소거능을 확인하고 IC₅₀ 값을 측정하였으며, 실험 결과는 Fig. 2과 Table 2에 나타내었다. 각 추출물의 DPPH radical 소거능은 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 동백나무 덖음 잎 70% EtOH 추출물의 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 동백나무 덖음 잎 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물의 IC₅₀값은 각각 443.17 μg/mL, 262.99 μg/mL, 324.10 μg/mL으로 확인되었다. 추출 용매에 따라 활성도의 차이를 보이는 이유는 물은 에탄올 보다 비교적 극성이고 에탄올은 비교적 비극성이다. 이에 생리 활성을 나타내는 성분이 70% EtOH의 극성도에 분포하여 추출 시 활성 성분이 비교적 더 많이 함유되었다고 판단된다 [20]. 기존의 연구에서 동백나무 잎 70% EtOH 추출물의 IC₅₀값은 197.65 μg/mL로 확인되었다 [6]. 또 다른 연구에서는 동백나무 꽃, 어린잎, 성숙한 잎, 종자 100% methanol 추출물의 IC₅₀ 값은 7.16-60.44 mg/mL 농도로 확인되었다 [5].

Table 2 Antioxidant activity results, total polyphenol contents (TPC) and total flavonoid contents (TFC) of several extracts from heattreated C. japonica leaves

Sample	DPPH IC50 (μg/mL)	ABTS IC50 (μg/mL)	TPC (GAE mg/g)	TFC (QUE mg/g)
Hot water	443.17 ± 5.99	463.03 ± 4.54	89.75 ± 1.38	32.76 ± 1.42
70% EtOH	262.99 ± 1.83	260.09 ± 0.65	167.88 ± 1.57	39.50 ± 0.39
100% EtOH	324.10 ± 3.45	319.97 ± 8.54	132.43 ± 2.62	32.86 ± 0.45
Gallic acid	16.85 ± 0.31	32.93 ± 0.40	-	-

Figure 2. Antioxidant activity results of heat-treated C. japonica leaves solvent extracts. (A) DPPH free radical scavenging activity; (B) ABTS radical scavenging activity.

3.2.2. ABTS radical 소거능 측정 결과

ABTS radical은 폴리페놀과 같은 항산화 물질과 반응하게 되면 radical이 소거되면서 투명한 색으로 변하게되고 항산화 활성을 측정하는데 비교적 간편하고 육안으로 확인할 수 있다는 점에서 널리 사용되는 방법 중 하나이다 [21]. 본 연구에서는 추출 용매별 동백 덖음 잎 추출물의 ABTS radical 소거능을 확인하여 그에 따른 IC₅₀ 값을 측정하였으며, 실험결과는 Fig. 2와 Table 2에 나타내었다. 본 실험에서의 ABTS radical 소거능은 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있으며, DPPH free radical activity 결과와 동일하게 동백나무 덖음 잎 70% EtOH 추출물의 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 동백나무 덖음 잎의 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물의 IC₅₀값은 각각 463.03 μg/mL, 260.09 μg/mL, 319.97 μg/mL 으로 확인되었다. 이러한 결과는 DPPH free radical과 비교하여 ABTS cation radical이 친수성과 친유성 화합물의 항산화능을 동시에 측정할 수 있기 때문에 IC₅₀값이 비교적 더 우수한 결과를 나타낸 것으로 보인다 [22].

3.3. 총 폴리페놀 함량 측정 결과

식물계에 널리 알려진 폴리페놀 화합물의 hydroxy group은 강한 환원력을 가지기 때문에 체내에서 산화 반응으로 인해 발생할 수 있는 질환을 저해하고 항암, 항염, 항산화 특성을 가지는 것으로 알려져있다 [23]. 본 연구에서는 동백 덖음 잎의 추출 용매를 달리하여 각 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며 Table 2에 나타내었다. 동백나무 덖음 잎의 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물의 총 폴리페놀의 함량은 각각 89.75 GAE mg/g, 167.88 GAE mg/g, 132.43 GAE mg/g으로 70% EtOH 추출물에서 가장 우수한 함량으로 확인되었다. 기존의 연구에서 동백나무 잎 70% EtOH 추출물의 총 폴리페놀 함량은 23.4 mg/g tannic acid로 확인되었다 [6]. 또 다른 연구에서는 동백나무 잎 100% MeOH 추출물의 총 폴리페놀 함량은 103.07-161.77 mg/g catechin로 확인되었다[5]. 동백나무 잎을 녹차와 함께 110°C에서 열처리한 열수 추출물의 총 폴리페놀 함량은 1.81 mg/g GAE로 확인되었다[24]. 본 실험결과는 기존의 연구보다 높은 폴리페놀 함량으로 확인되었으며, 이는 덖음 처리 전보다 덖은 처리 후 폴리페놀 함량이 증가한다는 연구결과와 동일하다 [8].

3.4. 총 플라보노이드 함량 측정 결과

폴리페놀에 속하는 플라보노이드는 산화 반응을 막아 폴리페놀과 마찬가지로 항산화, 항염 등 예방, 지연하는 효과가 있다고 알려져 있다 [25]. 본 연구에서는 동백나무 덖음 잎의 추출 용매를 달리하여 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며 Table 2에 나타내었다. 동백나무 덖음 잎의 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물의 총 플라보노이드 함량은 각각 32.76 QUE mg/g, 39.50 QUE mg/g, 32.86 QUE mg/g으로 70% EtOH 추출물에서 가장 높은 플라보노이드 함량으로 확인되었다. 총 폴리페놀 함량과 비교했을 때 플로보노이드 함량이 비교적 적고 각 추출물의 플라보노이드 함량 차이가 크지 않는 것을 보아 동백 덖음 잎은 플라보노이드 구조를 가진 화합물보다 폴리페놀 구조를 가진 화합물이 더 많이 함유되어 있을 거라 예상된다. 기존의 연구에 동백나무 잎 70% EtOH 추출물의 총 플라보노이드 함량은 87.60 QUE mg/g으로 확인되었고, 이는 본 실험 결과보다 높은 결과이다[6]. 기존의 연구는 덖음 처리되지 않은 동백나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량으로 덖음 공정으로 일부 플리보노이드가 분해되어 총 플라보노이드의 함량이 감소된 것으로 판단된다.

3.5. HPLC를 이용한 폴리페놀 함량 분석

추출물에 함유된 폴리페놀류과 비타민류를 정량분석을 위해 HPLC 분석을 통해 유효성분을 확인한 결과는 Fig. 3과 Table 3에 나타내었다. 폴리페놀과 비타민류 HPLC 분석 결과 70% EtOH 추출물에서의 폴리페놀 함량과 비타민의 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다. 분석된 폴리페놀류 중에서 tannic acid의 함량이 14.47 mg/g으로 가장 높은 것으로 확인되었고, 비타민에서는 folic acid의 함량이 86.95 mg/g으로 다른 표준 물질보다 높은 함량으로 확인되었다. 이는 2번째로 함량이 높은 L-ascorbic acid 24.37 mg/g에 비해 약 3.5배 높은 함량으로 확인되었다. HPLC을 이용한 정량 분석을 통해 70% EtOH 추출물이 hot water, 100% EtOH 추출물보다 폴리페놀과 비타민의 함량이 높은 것을 확인하였으며, DPPH, ABTS 및 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량 분석의 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. 기존에 동백나무 잎의 찐차, 덖음차, 발효차, 화차 추출물의 연구에서 tannin과 vitamin C의 함량을 비교하였을 때 tannin 4.61-9.13%, vitamin C 43.60-227.70 mg/100g 으로 확인되었다 [8]. 본 실험 결과와 비교하여 큰 차이가 나타났는데, 이는 덖음 공정방식과 시간에 따라 동백나무 잎의 폴리페놀의 변화로 인한 차이로 판단된다. 또한 다량으로 검출된 unknown peak들도 항산화, 항염, 항암 등 생리활성에 영향을 미치는 것으로 추정되어 분리, 분석, 분취를 통해 세분화된 연구가 필요하다고 판단된다.

Table 3 Polyphenol and vitamin compounds identified in heat-treated C. japonica leaves solvent extracts quantified by HPLC

No.	Sample	Hot water	70% EtOH	100% EtOH
1	Thiamine hydrochloride	-	-	-
2	Nicotinamide	1.71 ± 0.43	2.27 ± 0.24	1.71 ± 0.43
3	Niacin	0.18 ± 0.07	0.35 ± 0.03	0.17 ± 0.07
4	L-Ascorbic acid	1.48 ± 0.50	24.37 ± 1.33	1.48 ± 0.50
5	Gallic Acid	1.81 ± 1.39	1.12 ± 0.05	0.85 ± 0.07
6	Folic Acid	49.32 ± 10.31	86.95 ± 8.59	49.32 ± 10.32
7	Catechin	4.67 ± 1.30	5.32 ± 0.51	0.32 ± 0.12
8	B12	3.36 ± 1.06	4.49 ± 0.22	3.34 ± 1.06
8	(-)-Epicatechin	3.91 ± 1.25	5.25 ± 0.54	1.91 ± 0.09
10	Rutin hydrate	5.24 ± 1.37	14.47 ± 1.64	10.99 ± 1.20
11	Tannic acid	14.99 ± 3.41	42.70 ± 2.18	24.55 ± 2.36
12	Quercetin	-	-	-
13	Kaempferol	0.04 ± 0.02	0.33 ± 0.09	0.45 ± 0.02
14	4-Hydroxbenzoic acid	-	-	-

Figure 3. HPLC profile of the heat-treated C. japonica leaves extracts and standard mixture using diode array detection at 280 nm. (A) hot water; (B) 70% EtOH; (C) 100% EtOH; (D) standard mixture. Numbers indicate the following: (1) thiamine hydrochloride; (2) nicotinamide; (3) niacin; (4) L-ascorbic acid; (5) gallic acid; (6) folic acid; (7) catechin; (8) B12; (9) (-)-epicatechin; (10) rutin; (11) tannic acid; (12) quercetin; (13) kaempferol; (14) 4-hydroxbenzoic acid.

3.6. 항균활성 측정 결과

3.6.1. Disk diffusion assay 결과

동백 덖음 잎의 피부질환을 유발시키는 균에 대한 항균활성을 확인하기 위하여 M. furfur, M. pachydermaits, S. epidermidis균에 대해 항균 활성을 확인하였다. 동백나무 덖음 잎 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물의 항균활성 유무를 확인한 결과, M. pachydermaits, S. epidermidis균에 대해 항균활성을 가지는 것으로 확인되었다 (Table 4). 열수 추출물은 10 mg/mL에서 S. epidermidis균에 대해서 9.07 mm 활성을 가지는 것을 확인하였고, M. pachydermatis, M. furfur균에 대해서는 활성을 나타내지 않는 것으로 확인하였다. 70% EtOH 추출물은 10 mg/mL에서 S. epidermidis균에 대해서 11.33 mm, M. pachydermatis균에 대해서 13.17 mm 활성을 가지는 것을 확인하였다. 100% EtOH 추출물은 10mg/mL에서 S. epidermidis균에 대해서 10.03mm, M. pachydermatis균에 대해서 12.20 mm 활성을 가지는 것을 확인하였다. 모든 추출물에서 M. furfur균에 대한 활성은 없는 것을 확인하였다. 기존의 연구에서는 M. furfur균에 대해 는 0.25, 0.5, 1 mg/mL에서 억제 직경이 각각 11.20, 14.70, 18.10 mm로 확인하였다 [8]. 본 실험결과와는 다른 연구결과로 덖음 처리 과정에서 폴리페놀 성분이 변형되거나 함량이 감소하여 항균 효과가 나타나지 않는 것으로 판단하였다.

Table 4 Antibacterial activities of heat-treated C. japonica leaves solvent extracts

Microorganisms	Conc. (mg/mL)	Clear zone (mm)
		Hot water	70% EtOH	100% EtOH
M. furfur	2.5	-	-	-
	5	-	-	-
	10	-	-	-
M. pachydermatis	2.5	-	-	-
	5	-	9.23 ± 0.25	8.83 ± 0.29
	10	-	13.17 ± 0.15	12.20 ± 0.26
S. epidermidis	2.5	-	-	-
	5	-	-	-
	10	9.07 ± 0.12	11.33 ± 0.29	10.03 ± 0.15

3.6.1. 최소저해농도 측정 결과

동백 덖음 잎의 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물의 최소저해농도 측정은 disk diffusion assay 결과를 바탕으로 실험을 진행하였다. MIC는 S. epidermidis균과 M. pachydermatis균에 대해 진행하였고 그 결과 70% EtOH와 100% EtOH에서 최소 저해활성을 확인하였다 (Fig. 4, Table 5). 실험 결과 S. epidermidis균에 대해서 hot water 추출물은 10 mg/mL농도에서 최소저해활성을 나타내었고, 70% EtOH 추출물이 5 mg/mL에서 최소 저해활성이 확인되었고, 100% EtOH 추출물은 10 mg/mL 농도에서 최소 저해활성이 확인되었다. M. pachydermatis균에 대해서 70% EtOH, 100% EtOH 추출물 모두 2.5 mg/mL에서 최소 저해활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

Table 5 Minimum inhibitory concentrations of heat-treated C. japonica leaves solvent extracts

Microorganisms	MIC (mg/mL)
	Hot water	70% EtOH	100% EtOH
M. furfur	-	-	-
M. pachydermatis	-	2.5	2.5
S. epidermidis	10	5	10

Figure 4. MIC assay result for two strains of bacteria on microplate. (A) S. epidermidis; (B) M. pachydermatis.

본 연구는 동백나무 덖음 잎을 추출 용매에 따라 항산화 활성 및 유효성분 함량을 확인하였다. 또한 피부 질환 유발균에 대한 저해 효과를 확인하여, 기능성 화장품 소재로서의 연구를 진행하였다. 동백나무 덖음 잎 hot water, 70% EtOH, 100% EtOH 추출물에 대한 DPPH, ABTS 라디칼 소거능 측정 결과, 70% EtOH 추출물의 IC₅₀ 값은 각각 262.99 μg/mL, 319.97 μg/mL로 추출물 중 가장 높은 항산화 활성으로 확인되었다. 또한 TPC는 167.88 GAE mg/g 함량으로 70% EtOH 추출물이 가장 높은 함량으로 확인되었지만 TFC의 결과 각 추출물들의 함량의 차이가 거의 없었다. 이는 동백나무 덖음잎 추출물에 폴리페놀의 화합물이 플라보노이드의 화합물보다 더 많이 함유되어 있다고 생각된다. HPLC를 이용한 폴리페놀 및 비타민류 정량 분석을 진행하였고, 실험 결과 70% EtOH 추출물에 폴리페놀과 비타민류의 함량이 높은 것으로 확인하였다. 이러한 생리 활성성분 뿐만 아니라 피부질환 유발균에 대한 항균활성 유무를 확인한 결과, 70% EtOH 추출물에서 S. epidermidis균과 M. pachydermatis균에 대해 높은 활성을 가지는 것으로 확인하였다. 이와 같이 동백나무 덖음 잎은 다양한 생리 활성에 효과를 보이는 폴리페놀 화합물를 함유하고 있으며, 피부 질환 유발균에 대해서 활성이 매우 뛰어나 기능성 화장품 원료로써 매우 적합할 것으로 판단된다. 추후 피부 질환 유발균에 대한 연구 이외에 피부 미용 소재로 활용 가능한 주름개선, 미백, 보습에 관한 추가 연구가 필요하다.

본 연구는 산림청 (한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업 (2022443B10-2222-0101)의 지원에 의하여 수행되었습니다.