CRISPR-Cas는 원핵 생물이 가진 바이러스에 대한 방어 체계로 1987년 우연히 발견된 이후 [1], Emmanuelle Charpentier 박사와 Jennifer Doudna 교수에 의해 CRISPR-Cas9의 작동 원리를 시험관 실험으로 규명하고 인간 세포를 비롯한 유기체에서 유전체 염기 서열을 맞춤 교정할 수 있는 새로운 유전체 교정 기술로 제안되었다 [2]. Emmanuelle Charpentier 박사와 Jennifer Doudna 교수는 그 공로를 인정받아 2020년에 노벨화학상을 수상하였으며 [3,4] CRSIPR-Cas 기술은 유전병과 같은 난치병 치료제로서 각광받으며 유전체 치료제로써 많은 연구가 수행되고 있으나, 아직은 임상적으로 적용하기에는 한계를 보이고 있다.

한편, CRISPR-Cas 시스템은 유전체 치료제뿐만 아니라 CRISPR-Cas 시스템의 기본적인 특이적 유전자 서열을 인식하고 자르는 특성과 주변에 존재하는 핵산을 비특이적으로 자르는 부가적인 특성 등을 이용하여 차세대 진단 방법으로도 제안되고 있다. CRISPR-Cas 시스템 기반 진단법은 2017년 당시 MIT의 Feng Zhang 교수 그룹이 SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)이란 이름으로 CRISPR-Cas 시스템을 이용한 신개념 진단법을 Science 저널에 처음 소개하며 시작되었다 [5].

2019년 12월에 중국 우한에서부터 코로나19 (COVID-19) 발병이 시작되어 전 세계적인 팬데믹 (pandemic)으로 확산되면서 많은 수의 환자와 사망자가 발생하고 현재까지도 그 피해가 이어지고 있다. 코로나19와 같은 감염병의 확산을 막고 그 피해를 줄이기 위해서 정확하고 빠른 진단이 필요하다. 이에 감염병에 대한 진단법에 대한 전세계적이 관심과 수요가 확대되었으며, 면역진단법과 분자진단법을 넘어서는 차세대 진단법에 대한 관심 또한 높아지고 있다. CRISPR-Cas 기반 진단법 또한 코로나19 감염병 발병에 따라 다양한 형태의 진단법이 제안 및 개발되었으며, 미국 FDA 긴급승인을 받아 코로나19용 진단제품이 시장에 진출하기도 하였다 [6].

본 논문에서는 CRISPR-Cas 유전자 가위를 이용한 진단 방법을 소개하고자, 먼저 CRISPR-Cas 시스템의 원리와 Cas 종류별 특성을 규명하고, Cas 종류별 개발된 진단 방법 사례를 살펴보고자 한다. 이를 통해 차세대 진단법으로서 CRIPR-Cas 시스템의 동향을 파악하고 한계 및 발전 방향에 대해 고찰해보고자 한다 [7].

2.1. Discovery and mechanism of CRISPR-Cas system

대부분의 박테리아와 고세균은 외부침입 유전물질에 대한 면역체계로서 CRISPR와 Cas 단백질을 이용한 CRISPR-Cas 시스템을 갖고 있다 [8-10]. CRISPR locus (1987년)와 Cas(CRISPR-associated sequence) 단백질 (2002년)이 발견되고 곧이어 CRISPR의 면역적 특성 [9,10]이 증명되면서 CRISPRCas 유전자가위 기술을 활용한 유전자 편집 (genome editing), 유전자 공학 (genetic engineering), 핵산 진단 (nucleic acid detection) 분야가 활발히 연구되어 왔다 [1,11-15].

박테리아가 외래 DNA를 파괴시키기 위해서 1) 외래 DNA 습득 (Acquisition), 2) crRNA 합성 및 조립 (processing and assembly), 3) 간섭 (Interference)의 3단계로 면역체계가 작동한다 (Fig. 1(a)) [16,17]. CRISPR-Cas 매커니즘의 선행 단계인 adaptation 과정에서 Cas 1-Cas 2에 의해 절단된 침입 바이러스 유전체의 일부가 새로운 spacer로서 숙주세포의 CRISPR 반복서열들 사이로 삽입된다. CRISPR 반복서열과 spacer 서열의 RNA 전사체인 precursor CRISPR RNA (pre-crRNA)가 다른 Cas 단백질에 의해 가공되어 CRISPR 반복서열과 바이러스 유래 유전체와 상보적인 서열을 포함한 짧은 crRNA 조각(~20 nucelotides)으로 가공된다. 이는 핵산내부가수분해(Endonuclease) 활성을 지닌 Cas effector nuclease와 Ribonucleoprotein(RNP) 복합체 (Cas-crRNA complex)를 형성하여 방어 체계로 존재하다가 crRNA와 상보적인 서열을 지닌 서열을 공략하여 숙주세포 내에서 유전체가 증폭할 수 없게 한다 [16].

Figure 1. Schematic diagram of (a) CRISPR immune system in bacteria and (b) CRISPR-Cas system

2.2. Detection of nucleic acids using CRISPR-Cas system

Jennifer Doudna 교수와 Emmanuelle Charpentier 박사 (2020년 노벨화학상 수상 [18])의 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 유전자 편집 기술 발표 (2012년)를 시작으로 CRISPR-Cas9 시스템의 유연함 덕분에 질병 메커니즘, 질병 타겟, 전사 조절을 이해 및 응용할 수 있었다. CRISPR-Cas9 기반의 지카 바이러스 진단 그리고 현재까지 유행 중인 COVID-19를 진단하기 위한 CRISPR-Cas12/Cas13 기반의 무수한 감염병 진단개발이 진행되고 있다 [6,19-35]. CRISPR 유전자 서열을 저렴한 비용, 간편성, 단순성, 효율적으로 원하는 대로 바꿀 수 있는 점 때문에 획기적인 유전자 편집 기술로 주목받아 왔으며 일부 Cas 단백질에서 추가적으로 발견된 부수적 절단(Collateral cleavage) 특성을 이용한 핵산 검출 기술에 활발히 응용되고 있다. 이와 관련된 요소들은 CRISPR array 근처에 위치한 Cas 오페론 (operon)에 잘 보존되어 있으며 표적 핵산의 종류, 부수적 절단 활성 등의 특성에 따라 크게는 Class I, II로 분류되고 하위에는 6가지 type과 30가지 이상의 subtype으로 분류될 수 있다 [19,36].

유전자 편집과 핵산 검출에는 주로 Class II의 Cas9 (type II), Cas12 (type V), Cas13 (type IV), Cas14 (type V)가 사용된다 [36-38]. Table 1에는 핵산 진단 분야에서 가장 널리 사용된 Cas 단백질 subtype들의 주요 특성들이 정리되어 있다. Cas 단백질들은 서로 다른 특성들 (PAM 서열, 핵산 절단 방식, 추가적인 요소 등)을 가지고 있기 때문에 각각의 특성을 잘 파악하여 핵산 진단 분야에 적용하여야 한다 [21]. 또한, guide RNA (gRNA) 서열은 on-target DNA 절단과 unintended off-target 절단에 직접적으로 영향을 주기 때문에 정확한 gRNA를 구성하는 것은 CRISPR-Cas 시스템의 중요한 구성요소 중 하나이다 [21].

Table 1 Key features of widely used CRISPR-Cas systems in pathogen detection methods

Class II	Type II		Type V			Type VI
Cas	Cas9	dCas9	Cas12a	Cas12b	Cas14	Cas13a
Length (a.a.)	1000-1700		1200-1300	~1300	400-700	~1160
Nuclease domain	HNH, RuvC	Deactivated HNH and RuvC	RuvC	RuvC	RuvC	2xHEPN
Target type (cleavage type)	dsDNA (Blunt end)	N/A	dsDNA(Staggered) or ssDNA(single cut)		ssDNA(single cut)	ssRNA(Degraded)
Collateral cleavage	N/A	N/A	ssDNA	ssDNA	ssDNA	ssRNA
PAM/PFS1 Sequence	PAM5’-NGG-3’		PAM5’-TTTN-3’	PAM5’-TTN-3’	Not required	PFS5’-ATC-3’
TracrRNA requirement	Yes		No	Yes	Yes for Cas14a, no for Cas14b	No

¹PAM, protospacer adjacent motif; PFS, protospacer flanking sequence

2.3. CRISPR-Cas systems based on cleavage and binding of target DNA

2.3.1. Cas9

Cas9 단백질은 single guide RNA (sgRNA)의 서열 특이성으로 DNA 표적을 인식 및 절단한다 (Fig. 3(a)). pre-crRNA와 trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)는 개별적으로 전사되어 합성되고 둘의 반복서열 부위가 상호 결합하면, posttranscriptional processing과 RNase III의 핵산 절단 활성으로 crRNA와 tracrRNA가 결합한 gRNA가 합성된다 (crRNA processing). Cas9-sgRNA가 PAM (Protospacer adjacent motif)의존적으로 protospacer에 결합하여 2차 구조를 형성하면(R-loop), Cas9의 nuclease 도메인들 (HNH와 RuvC)이 활성화되어 표적 dsDNA를 절단한다 [39]. Cas9은 dsDNA에 무작위적으로 8 bp 또는 4 bp마다 반복되어 있는 “NGG”의 PAM 서열을 인식할 수 있기 때문에 gRNA를 쉽게 구성할 수 있는 장점이 있다 [40].

Figure 3. Principles of diagnostics based on (a) CRISPR-Cas9 and (b) CRISPR-dCas9.

2.3.2. dCas9 (nuclease-deficient Cas9)

Nuclease-deficient Cas9 (dCas9)은 핵산 절단 활성이 없이 DNA에 결합할 수 있도록 재조합 된 Cas9이다. 핵산 분해(Nuclease)를 담당하는 RuvC와 HNH 도메인에 침묵 돌연변이를 일으키고 PAM 서열이 인식되면 절단없이 핵산에 결합되도록 서열 조작되었다. Zhang 그룹은 두개로 조각낸 Luciferase (split-luciferase)를 dCas9에 각각 도입하여 NFluc와 CFluc를 합성하고 한 쌍의 sgRNA를 고안하였다 [41]. dCas9/sgRNA complex (dRNP)가 표적 핵산에 결합하게 되면 두 Luciferase 조각이 가까이 위치하게 되어 Luciferase 기능을 회복하게 된다 (Fig. 3(b)). 또한, Qiu 그룹은 CRISPRdCas9과 split horseradish peroxidase를 융합시켜 미량 물질인 microRNA를 높은 민감도와 정확도로 확인하였다 [42].

Table 2 CRISPR/Cas-based diagnostics before COVID-19 outbreak

Cas type System name1		Target	Amplification2	Time	LOD	Sensitivity / Specificity	Readout3	Instrument	Ref.
Cas9	NASBACC	ZIKA virus	Isothermal RNA amplification (NASBA)	~3 h	1.8 cps/μL	fM/1 nt4	C(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside)	Portable electronic optical reader	[53]
	dCas9+PCR	Mycobacterium tuberculosis	PCR	10 min after PCR	-	One copy/-	B(Luciferase)	-	[58]
	CRISPREXPAR	Listeria monocytogenes	EXPAR	< 1 h	0.82 amol	aM/1 nt	F(SYBR Green 1)	-	[60]
	RCH (dCas9-split HRB, RCA)	miRNAs (NSCLC)	RCA	< 4 h	-	fM/1 nt	C(TMB)	-	[42]
Cas13a	SHELOCK	ZIKA virus	RPA	2 - 5 h	-	aM/1 nt	F(FAM)	-	[5]
	SHELOCKv2	Genomic DNA	RPA	0.5 - 3 h	-	zM/1 nt	F(FAM, TEX, Cy5, HEX); C (Gold-NP, anti-FAM Abs) )	-	[54]
	HUDSON+SHELOCK	ZIKA virus	RPA	< 2 h	-	aM/1 nt	F(FAM); C(Gold-NP, anti-FAM Abs)	-	[57]
Cas12a	HOLMES	Genomic DNA	PCR; RT-PCR	< 1 h	-	aM/1 nt	F(HEX)	-	[61]
	DETECTR	HPV	RPA	~2 h	-	aM/6 nt	F(FAM)	-	[7]
Cas12b	HOLMESv2	Genomic DNA	LAMP; RTLAMP; Asymmetric PCR	~1 h	-	aM/1 nt	F(HEX, FAM)	-	[55]

¹NASBACC, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification-CRISPR Cleavage; CRISRP-EXPAR, CRISPR-cas9 triggered isothermal EXponential Amplification Reaction; RCH, Rolling Circle Amplification-CRISPR-split-HRP; SHELOCK, Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing; HUDSON, Heating Unextracted Diagnostic Sampled to Obliterate Nuclease; HOLMES, one-HOur low-cost Multipurpose highly Efficient System; DETECTR, DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter, ²EXPAR, EXponential Amplification Reaction; RCA, Rolling Circle Amplification; RPA, Recombinant Polymerase Amplification; RT-RPA; Reverse transcriptional-RPA; LAMP, Loop-Mediated Isothermal Amplification; RT-LAMP, Reverse transcriptional-LAMP, ³C, colorimetric; B, bioluminescent; F, fluorescent, ⁴nt, nucleotide

2.4. CRISPR-Cas systems based on collateral cleavage

현재까지 개발된 CRISPR-Cas 진단 시스템의 ~90%는 부수적 절단 활성을 이용한다 (CRISPR-Cas12 ~74%, CRISPR–Cas13 ~16% 차지) [43]. CRISPR-Cas13 시스템인 SHEOLOCK, CRISPR-Cas12 시스템인 DETECTR 등과 같은 부수적 절단 활성 기반의 진단 시스템들은 reporter 핵산을 포함하고 있다[44]. Reporter 핵산에는 quenching (fluorescence) 현상과 친화적 결합 (affinity) 특성을 이용한 reporter들이 주를 이룬다. 전통적인 Cas12 기반 핵산 진단은 주로 형광법을 이용해 왔으나, 핵산 증폭을 위한 추가적인 장비들을 요구하기 때문에 AuNP와 같은 nanoparticle을 활용하여 직접적 육안 탐지가 가능한 lateral flow assay(LFA)로 단순화시킬 수 있다 [43,45].

2.4.1. Cas12

CRISPR-Cas12 시스템은 single-stranded DNA (ssDNA) 또는 double-stranded DNA (dsDNA) 표적을 인식 및 절단하고, 주변 ssDNA를 비특이적으로 절단하는 부수적 절단 활성(collateral cleavage)을 갖고 있다 [7,37]. crRNA가 표적 핵산을 인식함에 따라 Cas 단백질의 Nuclease domain이 활성화되는데, 표적 핵산 인식 시, Cas12a는 crRNA, Cas12b는 crRNA의 반복서열과 상보적인 tracrRNA을 추가로 요구한다고 알려져 있다 [14]. crRNA는 표적 핵산 서열 (protospacer)과 상보적인 spacer (16-25 nt)를 포함하고 있어 PAM (T-rich)upstream을 인식할 수 있고, 이어서 protospacer에 안정적으로 결합하게 된다 [45]. Cas12의 nuclease domain인 RuvC와 NuvC 사이에 표적 핵산이 위치하게 되면 endonuclease 활성이 일어나 표적 DNA를 sticky end 말단 형태로 자르고, 이어서 부수적 절단 활성이 나타난다 [45].

2.4.2. Cas13

Cas13 단백질은 Type VI 대표 단백질로 표적 ssRNA를 인식 및 절단하고 부수적으로 ssRNA를 절단한다. Cas13은 tracrRNA 없이 crRNA와 RNP를 형성하고 PAM 서열에 비의존적으로 핵산을 인식 및 분해할 수 있기 때문에 핵산 진단 분야에서 상당히 주목을 받고 있다 [20]. CRISPR-Cas13 시스템의 crRNA는 일반적으로 22-28 nt의 spacer와 36 nt의 single stemloop로 구성되어 있는데, 표적 ssRNA 서열 내 PFS (Protospacer flanking sequence) 근처에 상호 결합하게 되면, 비특이적 절단 활성이 시작된다 (RNA-activated ssRNA 분해). Cas13a의 HEPN (Higher Eukaryotic and Prokaryotic Nucleotide)-binding domain이 핵심 핵산 분해 활성과 crRNA maturation에 관여한다 [46]. Cas13의 subtype들 (13a, 13b1, 13b2, 13c, 13d 등)은 조금씩 다른 매커니즘과 다양한 기능을 지니고 있다. 예를 들어, LshCas13a (Leptotrichia shahii)과 LwaCas13a(Leptotrichia wadei)은 programmable RNA-targeting에 높은 활성도를 보여주었고, 후에 발굴된 PspCas13b (Prevotella sp. P5–125)는 LwaCas13a와 달리 stabilizer 단백질을 요하지 않고, 동물세포 RNA targeting에 적합한 것으로 밝혀졌다 [46]. 최근에는 이들보다 20-30% 작은 Cas13d가 발굴되어 RNA knockdown, detection, editing, splicing, viral delivery 분야에서 활발히 연구개발 중에 있다 [46].

2.4.3. Cas14

최근 Class II, type V에 속하는 새로운 CRISPR-Cas14 시스템이 발견되었다. Cas14 단백질은 다른 RNA-guided Cas 단백질 크기의 절반인 400-700 aa로, 작은 크기에도 불구하고 특정 서열의 필요 없이 (PAM 비의존적) type Ⅴ 단백질의 특성인 RuvC 도메인에 의해 ssDNA를 절단할 수 있다 [47]. 또한, 부수적 절단 (collateral cleavage)으로 표적 핵산 절단 활성화에 의해 비특이적 dsDNA 절단을 유도한다 [48].

2.4.4. 기타 Cas

위에 기술된 Cas 단백질 외에도 새로운 Cas 단백질들이 발견되고 있다. CasΦ (CasF)는 거대 박테리오파지에서 발견된 Cas14보다는 크고 Cas9보다는 작은 단백질이다. T-rich PAM을 인식하여 DNA를 절단하고, 부수적 dsDNA 또는 ssDNA를 절단하는 것으로 밝혀졌다 [49]. 또한, Cas3 단백질 기반의 시스템에 주목하였는데, 앞서 언급된 Cas9, Cas12, Cas13과 달리 Class I에 속하여, 다른 Cas 단백질 복합체 (Cas complex)와 함께 Cascade 핵산 절단을 일으킨다 [50]. Cas 복합체 (complex)가 dsDNA 내 PAM을 인식하고 결합 구조에 변형을 일으키면 Cas3 단백질의 표적 dsDNA의 단일 가닥 절단 및 비특이적 ssDNA 절단 활성이 일어난다 [35, 50]. 복합체 형성은 안정적으로 보관이 가능하고 PAM 부위 염기쌍 식별에 높은 특이성을 보인다 [35] .

2.5. General procedure to detect pathogen DNA/RNA

CRISPR-Cas 시스템 기반의 진단법 전체 흐름은 다음과 같다: 1) 검체 채취, 2) 핵산 추출, 3) 증폭, 4) 특이적 표적서열 인식 및 절단, 5) 신호 검출 (Fig. 4). SARS-CoV-2의 경우 비인두 (Nasopharyngeal, NP)와 구인두 (Oropharyngeal, OP), 객담에서 채취하며 (US-CDC guideline), 이 외에도 타액, 오줌, 분변, 눈물 등에서도 검체 채취할 수 있다 [51]. 핵산 추출단계 (nucleic acid extraction)는 성공적인 핵산 증폭 및 신호 생성을 결정짓는 첫 단계로 핵산만 추출하거나 물리화학적으로 세포 부분을 제거하는 두 가지 방식이 있다. 일반적으로 column 또는 magnetic bead를 사용한 상품 (키트)을 사용하거나 lysis buffer로 처리한다. 대부분 CRISPR-Cas 기반의 진단법들은 다양한 핵산 증폭 (nucleic acid amplification) 전략과 결합되어 미량의 핵산 분자량을 증가시키거나, 신호를 증폭시켜 진단 특이성과 민감성을 높인다 [43,52]. 핵산 증폭법에는 Standard PCR, Recombinase Polymerase Amplification(RPA), Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)가 널리 사용된다. SARS-CoV-2와 같은 RNA 바이러스 핵산은 reverse transcriptase (RT)-PCR, RT-RPA, RT-LAMP로 증폭된다 [52]. 증폭된 표적 핵산은 Cas 단백질-crRNA 복합체(RNP complex)에 의해 결합 반응 및 절단 활성이 일어난다(targeting and cleavage). 등온증폭 단계와 동시에 진행되거나 25°C 또는 37°C 반응 (incubation)으로 진행된다. 부수적 절단 활성을 가진 Cas 단백질 기반의 진단 기술에는 reporter의 절단으로 신호를 측정하기 위해 Fluorophore/Quencher 또는 Antigen/Biotin 단일 가닥 (Cas12: ssDNA, Cas13: ssRNA)이 도입된다. 마지막 단계인 신호 측정 (read-out) 단계에는 CRISPRCas 시스템의 표적 핵산 결합력 또는 절단 활성 능력을 이용하여 (증폭된) 형광 또는 전기적 신호 측정, LFA, 비색 분석(visual colorimetric assay) 등이 있다. CRISPR-Cas 시스템 이용 진단법은 분석 장비가 필요 없거나 간소화된 현장 진단 장비 (point-of-care testing, POCT)를 이용할 수도 있다 [21, 37].

Table 3 CRISPR/Cas-based diagnostics during COVID-19 outbreak

Cas type	System name1	Target	Amplification2	Time	LOD (copies/μL)	Sensitivity/Specificity (%)	Readout3	Ref
Cas12	DETECTR	COVID-19(N, E)	RT-LAMP	35-40 min	10, 2	95/93-100	F, LFA	[22, 23]
	AIOD-CRISPR	COVID-19(N), HIV-1	RT-RPA	40 min	0.2	100/100	F	[25, 68]
	CRISPR/Cas12a-NER	COVID-19(Orf1a, Orf1b, N, E)	RT-RPA	60 min	0.5	100/100	F/LFA	[23]
	STOPCovid	COVID-19(N)	RT-LAMP	70 min/40 min	2	100/100	F, LFA	[24]
	SHERLOCK One pot	COVID-19(ORF1ab, N, S)	RT-LAMP	45 min	3.3	93.1/98.5	F, LFA	[34]
Cas13	SHERLOCK	COVID-19(S, N, Orf1ab)	RT-RPA/RT-LAMP and T7 transcription	55 min	2.2, 6.75	100/1004, 96.3/1005, 87.65/97.146	F/LFA	[6, 27]
	SHINE	COVID-19 (ORF1a/ORF1ab, N1)	RT-RPA	30-40 min	10	90/100	F, LFA	[28, 29]
	CARMEN	COVID-19	RT-PCR	-	-	-/-	F	[30]
	CREST	COVID-19(N)	RT-PCR	2 h	10	88.8/100	LFA/F	[31, 32]
		COVID-19	None	~30 min	~100	100/100	F	[33]
Cas3	CONAN	COVID-19, influenza virus	RT-LAMP	40 min	5	90/95	LFA	[35]

¹DETECTR, DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter; AIOD-CRISPR, All-in-one dual CRISPR-Cas12a; CRISPR/Cas12a-NER, CRISPR/Cas12a-Naked Eye Readout; SHERLOCK, Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing; STOPCovid, SHERLOCK Testing in One Pot, SHINE, SHERLOCK+Hudson integration to Navigate Epidemics; CARMEN, Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids; CREST, Cas13a-based, Rugged, Equitable, Scalable Testing; CONAN, Cas3-Operated Nucleic Acid detection N

²RT-LAMP, Reverse transcriptional- Loop-Mediated Isothermal Amplification; RT-RPA, Reverse transcriptional- Recombinant Polymerase Amplification

³F: fluorescence; LFA: lateral flow assay

Specificity and sensitivity when using 4RT-LAMP; 5RT-RPA and fluorescence readout; 6RT-RPA and LFA readout

Figure 4. Overview of CRISPR-Cas systems for the diagnosis of pathogens.

CRISPR-Cas9 시스템이 유전체 서열 편집의 획기적인 기술로 떠오르면서 2016년에는 CRISPR-Cas 시스템을 이용한 진단분야에 대한 연구도 시작되었다 [53] 특히, 새로운 Cas 종류 및 특성이 밝혀지며 이를 이용한 진단법 개발도 확장되었다 [5, 7, 42, 54-60]. 이 장에서는 코로나19 팬데믹 이전에 개발된 Cas 종류에 따른 CRISPR-Cas 시스템 기반 진단법에 대해 소개하고자 한다.

3.1. Cas9

Cas9의 경우 Cas12나 Cas13처럼 부수적으로 일어나는 비특이적 핵산 절단 활성(collateral cleavage activity)은 없지만, Cas9의 특이적 서열 인식 및 절단활성을 직접적으로 이용하는 접근법 (Fig. 3(a))과 핵산절단활성을 제거한 재조합 Cas9 (nuclease-deficient Cas9, dCas9)를 이용하는 접근법 (Fig. 3(b))으로 크게 나눌 수 있다.

Cas9의 특이적 서열 절단활성과 핵산증폭법을 결합하여 CRISPR-EXARP (CRISPR-Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction)과 NASBACC (Nucleic acid sequencebased amplification (NASBA)-CRISPR cleavage) 등과 같은 진단법이 제안되었으며, 이들 진단법은 병원체 유전자형을 구분하거나 SNPs (Single nucleotide polymorphisms) 분석을 가능하게 하였다 (Fig. 3(a)) [53,58,60]. 특히, CRISPR-EXARP는 CRISPR-Cas9이 특이적으로 표적 유전자 서열을 인식하고서 ssDNA의 PAM 인근부위를 절단하게 된다. 절단 부산물인 ssDNA 파편들을 핵산증폭의 프라이머로 사용되어 EXPAR 즉, 핵산 등온증폭 반응이 일어나도록 하여 실시간으로 증폭된 dsDNA를 형광신호로 읽을 수 있게 된다. CRISPREXARP를 개발한 D. Xing 그룹은 Listeria monocytogenes의 전체 RNA를 이용하여 SNP 분석과 DNA methylation 분석을 할 수 있음을 보였 주었다 [60].

재조합 dCas9을 이용하는 진단법은 nuclease 활성을 제거하고 Cas9에 Luciferase나 HRP (Horseradish peroxidase)와 같은 신호를 생성할 수 있는 효소를 N-말단과 C-말단 등으로 나누어 융합한다. PCR이나 RCA (rolling circle amplification)에 의해 증폭된 DNA에 효소 일부가 융합된 dCas9 한 쌍이 특이적으로 서열을 인식하여 결합하게 되면 쪼개어진 Luciferase나 HRP 효소가 온전한 형태로 결합하여 구조가 회복되면서 효소들의 반응에 의해서 색도 신호가 생성된다(Fig. 3(b)) [41,42].

3.2. Cas13

SHERLOCK은 표적 DNA 혹은 RNA를 1) RPA 혹은 RT-RPA로 각각 증폭, 2) T7 RNA polymerase을 이용하여 전사 후, 3) CRISPR-Cas13a로 검출하는 3개 단계로 이루어져 있다. 타겟 서열이 전사된 RNA에 존재하면 주변 reporter ssRNA의 절단으로 생성되는 형광 신호로 검출이 가능하게 된다 (Fig. 2). 지카 및 뎅기 바이러스를 이용하여 SNP 분석으로 바이러스 균주 구분까지 가능함을 증명하였다 [5].

Figure 2. Schematic diagram of the activity and catalytic mechanism of each CRISPR-Cas (Cas9, Cas12, Cas13, and Cas14).

SHERLOCK 방법을 개량하여 Cas13a, Cas13b, Cas12a를 사용하여 4개의 형광채널을 이용하여 다중진단법을 발표하였다 (SHERLOCKv2). 지카 및 뎅기 바이러스를 LFA와 결합하여 손쉽게 진단할 수 있으며 2 aM까지 정량적으로 표적 병원체를 진단할 수 있음을 보여주었다 [54]. 2018년에는 HUDSON (Heating Unextracted Diagnostic Sampled to Obliterate Nuclease)과 SHERLOCK을 결합하여 인체 분비물로부터 추가적인 핵산 분리 및 추출없이 지카 및 뎅기 바이러스를 바로 검출할 수 있는 방법을 선보였다 [57].

3.3. Cas12

2017년에 중국 연구진에 의해서 CRISPR-Cas12a도 Cas13처럼 부수적인 핵산 절단활성이 있음이 밝혀졌다 [56,61,62]. 이때 Cas12a는 Cas13a와는 달리 DNA 서열을 표적으로 인식하고 ssDNA를 부수적으로 절단한다 (Fig. 2). 중국 연구진에 의해서 개발된 HOLMES (one-HOur low-cost Multipurpose highly Efficient System)는 10 aM 민감도로 DNA/RNA 바이러스를 검출하고 1시간 이내에 세포주나 임상 샘플에서 바이러스 유전자형과 사람 SNP를 구별할 수 있었다 [56].

비슷한 시기에 미국 UC Berkeley의 Jennifer Doudna 그룹 또한 Cas12a에 대한 특성을 독립적으로 밝혀내고[7] DETECTR(DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) 이라 명명한 진단법에 대하여 2018년 Science지에 발표하였다. DETECTR는 인간 유두종 바이러스 (HPV) 유전자형을 분석하고 임상 환자 샘플에서 바이러스를 검출할 수 있음을 증명하였으며 이는 간단하면서 빠르고 특이적인 새로운 진단법의 가능성을 보여주었다 [7].

Table 4 CRISPR/Cas-based POCT

Cas type	System name	Target	Amplification1	Time	LOD (copies/μL)	Sensitivity/Specificity (%)	Readout	Instrument	Ref.
Cas13	BiosensorX	COVID-19, Antimicrobial resistance detection (ß-lactam antibiotic)	None (transcription x)	~30 min	2,000 for E gene 7,520 for RdRP 50 for combined	-/-	Electrochemi cal assay (Potentiostat)	Multiplex microfluidic biosensor (BiosensorX) +NFC potentiostat	[65]
Cas12	Instrument-free	COVID-19	RT-RPA	-	100	94.1/100	Lateral flow assay in microfluidic system	-	[66]
Cas13, Cas12	ECS-CRISPR (Easy to operate, Contamination - free, and Stable CRISPR)	COVID-19, African swine fever virus (ASFV)	RT-RPA	~25 min	3	-/-	Fluorescence readout	Biosensor	[67]

¹RT-RPA, Reverse transcriptional- Recombinant Polymerase Amplification

코로나19 팬데믹 이전부터 활발하게 개발되었던 CRISPRCas 시스템 진단법은 팬데믹 동안 새로운 진단법 개발에 대한 요구와 수요에 발맞춰 임상 검증 연구만 아니라 새롭게 개량한 연구가 폭발적으로 증가하였다.

4.1. Cas12

2018년에 개발되었던 DETECTR는 Mammoth Bioscience에서 기술 개발 및 상용화를 이어가고 있으며, 2020년에 DETECTR를 이용한 SARS-CoV-2 진단과 이에 대한 임상연구를 보고하였다 [22, 23]. SARS-CoV-2를 진단하기 위해서는 DETECTR는 RT-LAMP (reverse-transcriptase loop-mediated isothermal amplification)로 N 및 E 유전자의 보존적 서열(conserved regions)을 증폭하고 CRISPR-Cas12a를 이용하여 부가적 ssDNA 절단활성을 이용하여 형광 신호를 읽거나 LFA을 사용하였다. 이 때 민감도는 10 copies/μL로 CDS SARS-CoV-2 RT-qPCR의 1 copy/μL에 비하면 민감도는 다소 떨어지는 편이나 임상 민감도 및 특이도는 각각 93%, 95.5%로 보고하였다 [22,23].

SHERLOCK이나 DETECTR 진단법은 증폭, 검출 2단계에 걸쳐 이루어지기 때문에 RNA 추출 과정 및 증폭 후 검출로 진행하는 과정 등에서 교차 오염이 일어날 가능성이 있고 현장 진단에서는 더 간편한 프로토콜을 필요로 한다. 이를 극복하기 위해 STOPCovid (one-pot SHERLOCK)라고 명명한 새로운 CRISPR-Cas 진단법이 제안되었는데, 이는 하나의 튜브에서 하나의 온도 조건 하에 증폭 및 CRISPR-진단이 이루어질 수 있는 방법이다 [24]. 이는 진단까지 40 분이 소요되며 임상환자 샘플로 검증하였을 때 98.5%의 임상 특이도, 93.1%의 임상 민감도로 보고되었다. STOPCovid와 비슷하게 AIOD-CRISPR (All-in-one dual CRISPR-Cas12a)도 하나의 튜브에서 추가적인 처리없이 증폭과 CRISPR-검출이 동시에 이루어지는 방법으로 역시 40 분이 소요된다. 연구진은 SARS-CoV-2와 HIV-1 바이러스 진단을 표적으로 하였으며 DNA 혹은 RNA인 표적유전자를 0.2 copies/μL수준으로 진단할 수 있다고 보고하였다 [63].

CRISPR-Cas12a-NER 방법은 특별한 장비 없이 육안으로 판독 가능한 형광신호를 이용하여 진단할 수 있는 방법이다. 형광 신호를 읽을 때 보통 비싼 형광 판독 장비를 필요로 하는데 이 방법은 458 nm파장의 육안으로 판독 가능한 초록색 형광 가시광선을 사용하여 판독 장비의 필요성을 제거하였다. 또한, 31개의 임상 샘플로 검증연구를 하였으며 100% 임상 특이도 및 100% 임상 민감도를 보고하였다. 이에 연구진들은 육안 판독이 가능한 진단법으로 현장에서 빠르고 간편하게 사용 가능함을 제시하였다 [26].

4.2. Cas13

RT-LAMP 핵산증폭과 T7 전사 및 CRISPR-Cas13 검출법이 통합된 SHERLOCK 제품이 SARS-CoV-2 진단에 적용하여 FDA 긴급 승인을 받았다. CRISPR-Cas 진단 시스템 중에서는 가장 처음으로 FDA 승인을 받았으며, 이 SHERLOCK 진단법은 6.75 copies/μL 최소검출한계 (LoD)를 가지며 30개의 양성 및 30 개의 음성 임상 샘플로 검증 연구를 하였을 때 100%의 임상 민감도 및 특이도를 가진다고 보고되었다 [27]. FDA 승인SHERLOCK 진단법과는 다르게 RT-RPA로 핵산 증폭하는 코로나19 진단을 위한 SHERLOCK도 발표되었다[6]. 이의 민감도는 S 유전자에 대해서 약 3 배 정도 증가된 2.2 copies/μL, 10-100 viral RNA copies/μL 검출한계를 가진다고 하며, 194 개 환자샘플로 임상 연구한 결과, 형광 신호의 경우 임상 민감도 96.3%, 특이도 100%, LFA의 경우에는 87.6% 임상 민감도, 97.14% 특이도를 가진다고 발표하였다[6]. 코로나19 발병 전에 제안되었던 SHRLOKC과 HUDSON 방법이 결합되어 SHINE (SHERLOCK+Hudson integration to Navigate Epidemics)이란 이름으로 코로나19 진단법으로서 다시 적용되었다. 마찬가지로 추가적인 핵산 추출 단계 없이 등온증폭을 하고 CRISPR-Cas13으로 진단하기 때문에 총 30-40 분 이내에 진단을 가능하게 하였으며, 50 개의 임상샘플로 성능을 검증하였을 때, RT-qPCR 결과 대비 임상 특이도 100%, 임상 민감도 90%를 선보였다 [28,29].

보통의 CRISPR-Cas 진단법은 다량의 샘플을 한 번에 처리할 수 있는 형태의 진단법은 아니다. 미국의 C. M. Ackerman 연구진은 CARMEN (Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids)이라고 명명한 CRISPRCas13 기반 다량샘플 처리 가능한 방법을 2020년 Nature지에 발표하였다 [30]. 이 진단법은 169개의 사람 관련 바이러스를 적어도 10 개의 유전체 서열을 이용하여 구분하며, 이때 사용되는 PCR 프라이머와 CRISPR-Cas를 위한 crRNA 서열 설계는 ADAPT라고 하는 기존에 발표된 computational method를 사용하였다. CARMEN은 Influenza A 바이러스의 subtyping과 HIV 약물 내성 변이 (drug resistance mutation)연구에도 적용 가능하며 SARS-CoV-2 crRNA가 포함된 Corona virus 진단 패널도 고안되었다. 400개의 임상 샘플을 병렬 검사 (parallel diagnostic)할 수 있었으며, SHERLOCK 등과 비교하면 상대적으로 복잡하고 정교한 장비를 필요로 하지만 한 번에 검사할 수 있는 샘플 수를 확장하여 비용과 시간을 300 배 정도 절감할 수 있다고 한다 [30].

SHERLOCK이나 DETECTR와 같은 많은 수의 CRISPRCas 시스템 진단법은 주로 등온 핵산 증폭을 통해 민감도 높이거나 Cas 종류에 맞는 핵산 종류로 변형하기 위한 반응을 함께 사용한다. 2020년에 UC Berkeley Jennifer Doudna 연구진은 CRISPR-Cas13a를 이용하여 SARS-CoV-2를 샘플로부터 추가적인 증폭 단계가 없이 직접 진단할 수 있는 연구에 대해 발표하였다 [33]. 이것은 기존 CISPR-Cas 시스템 진단법과 다르게 하나의 표적유전자 상에 crRNA가 인식하는 서열 사이트 수를 다중으로 하여 증폭이 필요 없도록 하였다. SARS-CoV-2를 특이적으로 검출하며 LoD는 ~100 copies/μL 수준으로 증폭과 결합된 CRISPR-Cas 진단 시스템에 비하면 다소 민감도가 떨어지는 편이다. 그러나 증폭 단계를 제거하였기 때문에 COVID-19 검출이 5 분 이내에 가능하도록 전체 진단 시간을 대폭 감소시켰으며, 휴대폰을 이용한 정량도 가능하도록 개발하여 현장 진단에 더 적합하도록 개량하였다 [33].

4.3. Cas3

2019년에 사람 줄기 세포 혹은 사람 세포에서 유전체 편집이 가능한 새로운 CRISPR-Cas3에 대한 논문들이 발표되었다[50, 64]. 일본 K. Yoshimi 연구진은 CRISPR-Cas3를 이용한 SARS-CoV-2 진단법인 CONAN (Cas3-Operated Nucleic Acid detection N)을 제안하였다 [35]. 이는 RT-qPCR이나 CRISPRCas12 진단과 속도나 민감도 면에서 비슷하지만 SNP 식별 및 구분에 있어서 더 높은 특이성을 제공할 수 있다고 연구진은 말하고 있다. 31 개의 환자에 대해 임상연구 결과, 90%의 임상 민감도와 95%의 임상 특이도를 보이고 있다 [35]. CONANA은 Cas3로 시도된 첫번째 진단이라는 의미가 있으며 COVID-19 진단을 위한 민감도를 확보하기 위해서는 추후 최적화 등이 더 필요하다.

앞서 소개한 CRISPR-Cas 진단법들은 기존 분자진단에 비하여 비용이 비싼 thermocycler의 필요성을 제거하고 비교적 단순하고 저렴한 장비를 사용하여 값싸고 현장진단에 적용 가능할 수 있는 형태로 개발되어 왔다. 이러한 노력뿐만 아니라, 미세유체칩 (microfluidics)과 결합하여 자동화를 가능하게 하거나 장비의 필요성을 제거하는 등 현장 진단에 더 적합한 형태로 진화한 연구들도 발표되었다 [65-67].

독일 M. Johnston 연구진은 저렴하고 현장에서 접근 가능한 핵산 진단 시험법을 위하여 CRISPR-Cas13 기반 진단과 다중 폴리머 기반 미세유체칩이 결합된 전기화학 바이오센서인 Biosensor X를 제안하였다 [65]. 이 바이오센서는 샘플 획득 후 진단까지 30분이 소요되며 SARS-CoV-2의 오미크론 변종까지 스크리닝 할 수 있다. E 및 RdRP 유전자에 대해서 각각 2,000 및 7,520 copies/μL인 비교적 낮은 민감도의 검출한계를 보이지만 표적 유전자 조합의 경우에는 50 copies/μL의 검출한계까지도 확보하였다. 동일한 바이오센서에서 COVID-19 RNA를 검출할 뿐만 아니라 다양한 종류의 생체 분자를 이용하여 추가적인 바이오마커 분석도 가능함을 보여주었는데, 이 논문에서는 단백질 기반 β-락탐 항생제 검출이 동시에 가능함을 증명하였다. 미세유체칩과 CRISPRCas13이 결합된 Biosensor X는 최대 6개의 샘플을 분석할 수 있으며 신용카드 크기의 근거리 무선 통신 (NFC), 전기화학 측정기 (potentiostat) 등을 포함한 소형화된 진단 플랫폼을 제공하여 현장 진단에 더 적합하도록 하였다 [65].

미세유체칩과 CRISPR-Cas 시스템을 병합하여 더 간단하고 전력 장비가 필요 없는 다른 형태의 통합 진단 플랫폼 또한 개발되었다 [66]. 이 플랫폼에서 미세유체칩은 등온증폭, CRISPR-Cas 진단과 LFA 분석이 가능한 단일 폐쇄형으로 교차 오염 없이 시각적 진단을 가능하게 한다. 진단을 단순화하기 위하여 미세유체칩 내 반응 챔버에 CRISPR-Cas 시약은 동결 건조하여 보관하고 blister에 미리 물과 버퍼를 분리저장하도록 설계되었다. 또한, 전기 없이 미세유체칩 내 반응이 이루어지도록 저렴한 휴대용 손난로 (hand warmer pouch)를 대신 사용하였다. 이 진단 시스템은 24 개의 임상 비인두 샘플을 사용하여 94.1%의 민감도, 100% 특이도 및 95.8%의 정확도로 임상 검증되었다 [66].

하나의 튜브에서 시각적으로 진단할 수 있는 방법이 고안되었는데 이때 일회용 튜브-인-튜브 용기를 사용하여 RPA와 CRISPR-Cas13a의 반응이 원팟 (one-pot) 반응으로 결합되었다 [67]. ECS-CRISPR (Easy to operate, Contamination-free, and Stable CRISPR)라고 연구진은 명명하였으며 원팟 반응으로 결합하여 핵산 증폭물의 오염을 피할 수 있도록 하였다. ECS-CRISPR에서 RPA 등온증폭은 바닥에 2 개의 소수성 구멍이 있는 내부 튜브에서 일어나며, 증폭 후 반응 용액은 원심분리 (centrifugation)나 진탕 (shacking)으로 CRISPR-Cas13a 시약이 미리 저장되어 있는 외부 튜브로 이동하게 된다. 이중의 내부 및 외부 튜브가 하나로 결합되어 독립적인 반응이 일어날 수 있도록 포트를 형성하여 뚜껑을 열지 않고도 핵산 증폭 후, CRISPR-Cas 검출이 이루어지도록 한다. ASFV와 SARS-CoV-2 바이러스 진단으로 이 시스템은 검증되었으며 3 copies/μL의 검출 한계를 가진다고 밝혀졌다. 이 시스템 역시 비교적 복잡한 장비 없이 현장이나 자가 진단을 가능하게 한다 [67].

CRISPR-Cas 시스템에 대한 연구가 활발해지면서 치료 영역 뿐만 아니라 코로나19 팬데믹을 전후로 진단이라는 응용의 영역까지 확장 가능함을 보여주었다. 또한, 감염병 진단의 Golden standard라고 알려진 RT-qPCR과 비교하여 상대적으로 간단한 장비로 빠른 시간 내에 민감하게 바이러스 등의 병원체를 진단할 수 있음을 여러 연구를 통해 증명하고 있다. 또한, CRISPR-Cas 시스템은 PCR을 비롯하여 다양한 핵산증폭법과 LFA 검출, 형광 신호 검출법 등과 결합하여 다양한 형태를 선보이고 있으며 미세유체칩, 전기화학 기반 바이오센서 등 기존 진단시스템과의 결합으로 현장에서 사용할 수 있는 현장친화적인 진단법으로 개량도 가능하다.

다만, CRISPR-Cas 진단법을 사용하기 위해서는 무엇보다 PAM 서열이 타겟 유전체 내에 존재하거나 핵산 증폭과정 중에서 PAM 서열을 삽입하는 등의 추가적인 처리가 필수적이라는 점에서 진단법 개발에 제한적이 될 수 있다. 그러나, 다양한 종류의 CRISPR-Cas 시스템이 밝혀져 있어 바이러스 등 병원체의 타겟 핵산이 형태가 무엇이냐에 따라 (single strand vs double strand, RNA 혹은 DNA) Cas의 종류를 선택할 수 있다는 장점이 있으며, 서열 특이도가 다소 떨어지는 등온증폭에 비하여 CRISPR-Cas 시스템은 서열 특이도가 높아 상호보완적으로 진단에 적용 가능하다는 장점 또한 있다. 비교적 가격이 싸고 육안이나 LFA 분석으로 간편하게 진단은 할 수 있지만 많은 수의 샘플을 한 번에 처리할 수 있는 진단법으로의 개량 또한 필요하다. 이는 앞서 보았듯이 어레이 시스템이나 자동화된 미세유체칩 시스템 등과의 결합을 통해서 극복 가능할 것으로 기대된다.

COVID-19 팬데믹을 통해 감염병에 대한 정확하고 민감한 진단법이 감염병 확산을 방지하고 빠른 치료, 환자 격리 등을 이룰 수 있음을 경험하였다. 이를 위해서 기존에 확립된 분자진단이나 면역진단 외에도 CRSIPR-Cas 시스템과 같은 차세대 분자진단법을 개발하여 빠르고 저렴하며 높은 민감도를 지속적으로 확보하는 것이 무엇보다 중요할 것이다.

이 논문은 2020년 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(2020M3H4A1A03082908).