현대 사람들은 삶의 질이 높아짐에 따라 외모에 대한 관심과 함께 아름다운 삶에 대한 욕구가 증가하고 있다. 그러나 사람은 노화가 진행됨으로 인하여 피부와 생리적 특성이 변화되어 피부의 탄력 감소, 주름살, 검버섯 등이 발생하게 된다. 피부의 노화는 자외선 노출, 외부 환경, 나이의 증가 등이 있다. 이러한 요인으로 인하여 피부의 진피층에 존재하는 섬유 아세포의 작용이 감소하고 콜라겐, 엘라스틴 등의 구조 단백질의 합성량이 감소하며 피부의 수분이 손실된다 [1]. 많은 연구를 통하여 피부노화를 예방하고 치료하려는 노력을 하고 있으며, 노화 방지와 피부 개선에 효과적인 물질이 많이 연구되어 있고 코스메슈티컬 소재로 병풀추출물에 관한 다양한 연구도 이루어지고 있다 [2].

미나리과 병풀속에 속하는 다년생 포복성 초본인 병풀(Centella asiatica)은 아프리카의 마다가스카르 섬이 원산지로 알려져 있으나 인도, 스리랑카 등의 남아시아와 인도네시아, 말레이시아와 함께 우리나라 제주도 및 남부 도서지방의 고온 다습한 환경에서도 자생하는 것으로 알려져 있다 [3]. 병풀의 다양한 효능은 많은 연구를 통해 알려져 있으며, 신경세포 보호 [4], 항산화 [5,6], 항균 [7], 항염증 [8], 주름개선[9], 보습 [10], 미백 및 자외선 차단 [11], 피부각질 개선 [12] 및 피부재생 [13] 등의 다양한 생리활성 증진 효능이 밝혀져 있다. 병풀의 주요 효능성분인 madecassic acid, asiaticoside, asiatic acid, madecassoside는 피부결합 조직인 섬유아세포와 glycosaminoglycans의 조절에 중요한 역할을 하며, 각화 세포를 유도하여 빠르고 건강한 피부로의 성장을 촉진시켜 준다 [3].

우리의 피부는 외부환경으로부터 신체를 보호하기 위한 장벽기능 역할을 하고 있으며, 특히 각질층은 피부 최외각층에 존재하여 각질세포와 세포간 지질이 견고한 장벽을 형성하고 있다. 이러한 구조로 인하여 피부의 수분을 유지하고 피부를 보호해 주는 역할을 하지만 피부 고민에 필요한 유효한 물질은 분자량이 크거나 용해도가 낮은 물질이 대부분이므로 피부 외부에서 내부로 들어가기가 쉽지 않다. 이러한 문제점을 해결하고자 경피전달시스템 (Transdermal delivery system)에 대한 연구가 이루어졌으며, 이 중 liposome은 생체막의 주요성분인 인지질로 구성되어 있어 생체친화적이다. 또한 지질 이중층을 형성하기 때문에 친수성과 소수성 물질을 모두 담지할 수 있는 장점으로 인하여 의약품이나 화장품등에 가장 적합하게 유용될 수 있다 [14]. 그러나 막의 물리화학적 불안정성, 낮은 유화 안정성, 낮은 캡슐효율 등의 문제점이 보고되고 있으며, 피부 깊숙이 침투가 어려워 효과를 기대하기 어려운 경우가 많았다 [15,16]. Liposome의 문제점을 보완하기 위하여 다양한 연구가 보고되고 있다. 그 중 Edge activator로 계면활성제를 첨가하여 지질 이중층 막을 불안정하게 하여 소포체의 막에 가변성을 증가시킨 transfersome[17], 에탄올에 의해 소포체 막에 유연성을 높인 ethosome[18], 가변성과 유연성을 동시에 가지는 transethosome [19]이 연구되었으며, 이는 유효성분이 경표피 삼투압 기울기의 영향으로 각질층의 세포간 지질 경로로 빠르게 침투할 수 있다고 보고되고 있다 [20-22].

본 연구에서는 병풀의 주요 효능 성분을 함유한 liposome과 edge activator에 의해 소포막에 가변성 가지는 transfersome, ethanol에 의해 소포막에 유연성을 증가시켜 변형을 유도한 ethosome, 가변성과 유연성을 동시에 가지는 transethosome, 을 제조하고, 이에 대한 물리화학적 특성을 파악하며 피부투과 분석에 대한 비교연구를 실시 하였다.

2.1. 시약 및 기기

본 연구에서 사용한 인지질은 수소 첨가를 통해 불포화 성분을 없앤 hydrogenated lecithin (Lipoid S75-3 75%, Lipoid, Germany)를 사용하였으며, edge activator로 계면활성제인 polysorbate 20 (Tween 20, Merck, Germany)을 사용하였다. 병풀의 주요 효능 성분을 포함한 centella quatro (Biospectrum, Korea)을 butylene glycol (1.3-Butylene glycol, 대정화금, Korea)에 5%가 되도록 가온하여 녹인 후 사용하였고, 지표물질로는 병풀의 주요성분 중 madecassoside (Aladdin, China)을 사용하였다. Nano vesicle은 high-pressure nanodisperser(NLM100, Ilshin Autoclave, Korea)를 사용하여 제조하였으며, vesicle size, PDI, zeta potential은 zetasizer (Nano ZS, Malvern Instrument, UK)를 통하여 분석하였다. Madecassoside 함량은 high performance liquid chromatography(HPLC, e2695, Waters, USA)를 사용하였다. 형태학적 관찰을 위하여 glacios microcscope (Cryo-TEM, Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 관찰하였으며, 피부투과 시험은 Franz diffusion cell (DHC-6TD, Logan instrument, USA)을 사용하였고, 사용된 피부는 인공피부(Strat-M membrane 25 mm discs, Merck Millipore, USA)를 사용하였으며, 지표물질 분석은 HPLC system을 이용하여 분석하였다.

2.2. Nano vesicle 제조

Nano vesicle인 liposome, transfersome, ethosome, transethosome을 제조하기 위하여 hydrogenated lecithin, polysorbate 20과 에탄올로 구성된 유상 (oil phase)과 5% centella quatro로 구성된 수상 (water phase)을 각각 70°C까지 가온하여 용해시킨 후 유상에 수상을 천천히 넣고 호모믹서 (T.K Auto Homonixer MarkⅡ, Tokushu kika kogyo, Japan)을 사용하여 3,000 rpm의 속도로 5분간 유화시켜 제조하였다. 유화된 것을 Yang S. J. 등(2021)의 방법을 참고하여 high-pressure nanodisperser에 700 bar의 압력으로 2회 통과시켜 nano size의 vesicle을 제조하였다 [23] (Table 1).

Table 1 Formulations for manufacturing nano vesicles with different oil phase compositions

Component	Ingredient	Liposome	Transfersome	Ethosome	Transethosome
Oil phase	Hydrogenated lecithin	2.0	1.6	2.0	1.6
	Glycerin	5.0	5.0	5.0	5.0
	Polysorbate 20	-	0.4	-	0.4
	Ethanol	-	-	5.0	5.0
Water phase	Centella quatro (5%)	10.0	10.0	10.0	10.0
	Water	Total 100

2.3. 온도 별 제형 안정성 평가

각각 제조된 nano vesicle을 상온 (25°C), 항온 (45°C)에 보관하여 1개월 및 2개월 동안의 상의 분리, 색상 및 석출 여부에 대한 경시 변화를 관찰하였다. 제조된 nano vesicle의 평균 vesicle size (nm), 다분산지수 (polydispersity index, PDI) 및 제타전위 (zeta potential, mV)를 측정하기 위해 dynamic light scattering 방식을 활용한 zetasizer를 사용하여 측정하였다. 측정을 위해 nano vesicle은 증류수에 10배 희석 후 측정하였으며, 온도는 25°C로 일정하게 유지되도록 하였고 1일, 1개월, 및 2개월 동안 측정하였다.

2.4. Madecassoside HPCL 분석

병풀정량추출물의 함량을 분석 하기 위하여 병풀의 주요 성분인 madecassoside의 함량을 Monton C. 등(2018)의 방법을 변형하여 HPLC system으로 분석하였다 [24]. 검출기는 PDA detector를 이용하여 202 nm로 측정하였으며, 유속 1.0 mL/min의 조건으로 분석하였다. 이동상으로는 0.01% Phosphate buffer와 Acetonitrile을 이용하였고 gradient로 이동상의 비율을 달리하여 분석을 진행하였다 (Table 2).

Table 2 HPLC operation conditions for determination of madecassoside

	HPLC Condition
Instrument	e2695 Waters, USA
Column	Kromasil C18 column, 5 μm, 4.6 × 250 mm (AkzoNobel, Netherlands)
Mobile phase	Time (min)	Composition
		0.01% Phosphate buffer (%)	Acetonitrile (%)
	5	80	20
	10	60	40
	12	40	60
	14	20	80
	20	80	20
Detector wavelength	UV 202 nm
Injection volume	10 μL
Flow rate	1 mL/min
Column temperature	40°C
Run time	20 min

2.5. 캡슐효율

제조된 nano vesicle에 대한 캡슐효율 (capsulation efficiency)을 측정하기 위하여 dialysis membrane을 이용하였다. 각각의 nano vesicle 1.0 mL을 300 kDa의 분자량 한계인 dialysis membrane (Spectra/por Dialysis membrane Bio Tech CE, Spectrum laboratories, New Zealand)에 넣은 후 0.85% NaCl 을 함유한 1 × PBS 용매 200 mL에 넣은 후 36°C, 200 rpm의 속도로 진탕시켜 주었다. 4 h 후 membrane을 통과한 물질이 포함된 용매와 membrane 안의 남아 있는 제형을 각각 취하여 HPLC system으로 분석 하였다. Membrane을 통과한 물질은 캡슐화 되지 못한 물질로 판단하여 캡슐효율을 계산하였다.

2.6. In vitro 피부투과 실험

병풀정량추출물을 함유한 4가지 nano vesicle의 피부투과율을 확인하기 위하여 Hyeon T. I. 등(2023)의 방법을 변형하여 Franz diffusion cell system으로 실험하였다 [25]. 인공피부인 Strat-M membrane을 사용하였으며, 각질층이 위로 향하도록하여 적용칸과 회수칸 사이에 고정시키고 용매로는 2% polysorbate 20이 함유된 20% 에탄올 용액을 사용하였다. 실험이 진행되는 동안 온도를 37 ± 1°C로 유지하였으며 1, 2, 4, 8, 12 및 24 h 후 회수칸에서 용액을 채취하여 HPLC system을 이용하여 madecassoside의 함량을 분석하였다. 또한, 24 h 후 적용칸과 membrane에 남아있는 madecassoside를 측정하기 위하여 메탄올로 희석 후 분석하였다 (Table 3).

Table 3 Franz diffusion cell operation and conditions

Franz diffusion cells	Condition
Instrument	DHC-6TD, Logan
Skin	Strat-M membrane
Area of skin	2.5 cm3
Volume of sample solution	0.5 mL
Receptor medium	2% polysorbate 20 in 20% EtOH
Temperature	37°C
Stir bar speed	600 rpm
Sampling aliquot	12 mL
Sampling time	1, 2, 4, 8, 12, 24 h

2.7. Nano vesicle의 형태학적 관찰(TEM 관찰)

Nano vesicle의 형태학적인 관찰을 하기 위하여 Cryo-TEM을 사용하여 확인하였다. 시료 1.5-3 μL를 Copper grid (R1.2/1.3 300, Quantifoil, USA)에 도포하고 전 처리는 동결처리를 위하여 vitrobot markⅣ (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하였고 liquid ethane을 이용하여 급속 동결하였다. glacios microcscope (Cryo-TEM)으로 촬영한 후 관찰하였다.

2.8. 통계적 검증

실험은 3회 반복 측정 한 후 실험결과를 평균값과 표준편차로 나타내었다. 유의성은 student’s t-test로 진행하였으며, 유의성에 따라 *p < 0.05, **p < 0.01로 나타내었다.

3.1. 온도 별 안정성 평가

각각 제조된 liposome, transfersome, ethosome, trasnethosome는 상온과 항온에서 진행되었으며, 1일, 1개월 및 2개월 주기로 vesicle size, PDI, zeta potential, pH를 측정하며 경시 변화를 관찰하였다. 그 결과, 상온에서 liposome과 transfersome의 vesicle size는 초기의 크기에서 2개월이 경과됨에 따라 큰 변화가 없이 안정적인 것을 관찰하였으며, ethosome과 transethosome은 초기의 vesicle size에서 2개월이 경과된 후 유의하게 vesicle size가 증가한 것을 볼 수 있으나 vesicle size는 200 nm 이하로 나타났다. 항온에서는 전체적으로 2개월이 경과됨에 따라 유의하게 vesicle size가 증가하였고, liposome과 ethosome의 vesicle size가 크게 증가된 것을 확인할 수 있다 (Fig. 1). 이러한 결과는 4가지 제형이 상온에서 2개월동안 크리밍 (creaming), 응집 (flocculation), 합일(coalescence), 오스트발트 라이프닝 (Ostwald ripening) 등에 견딜 수 있는 안정한 상태임을 알 수 있다. 다분산지수인 PDI의 값이 0.25 이하인 경우, 안정한 상태의 단분산에 가까운 입자 분포를 갖는 것으로 알려져 있다[26]. 모든 제형이 상온에서 2개월 동안 0.191 - 0.279 사이로 큰 변화가 없었으나, 항온에서는 2개월이 지났을 때, ethosome에서 0.238에서 0.518로 값이 증가하였고, transethosome은 0.268에서 0.435로 증가한 것을 확인하였다 (Fig. 2). Zeta potential은 dynamic light scattering 방식으로 측정하였으며, colloidal 시스템에서 안정성은 Brownian motion시 존재하는 Van der Waals force와 전기 이중층에 의한 척력의 힘으로 결정된다. 모든 입자가 같은 전하를 띄고 있을 때, 서로 반발하는 경향을 가지며 서로 결합하려 하지 않아 colloidal에서는 안정하게 된다. 또한 pH 및 conductivity에 영향을 받는데, 입자가 주변의 이온과 함께 움직일 때, shear plane이 나타나며 이때의 potential을 zeta potential이라고 하며, 일반적으로 ±30 mV 이상 일 때 안정하다고 판단한다 [27]. 4가지 제형의 2개월 동안의 zeta potential을 측정한 결과, 상온과 항온 모두 큰 변화는 없었으며, 모두 ± 30 mV 이상의 값으로 확인되어 안정하다고 판단하였다 (Fig. 3). 4가지 제형의 pH 결과에서는 2개월 동안 모든 제형이 상온에서는 pH 5.07-5.44 사이로 안정적이며, 항온에서는 pH 4.90-5.44 사이로 큰 변화 없이 안정함을 확인하였다 (Fig. 4).

Figure 1. Effects of four formulations on vesicle size in (a) 25°C and (b) 45°C, *p < 0.05 and **p < 0.01.

Figure 2. Effects of four formulations on PDI in (a) 25°C and (b) 45°C, *p < 0.05 and **p < 0.01.

Figure 3. Effects of four formulations on zeta potential in (a) 25°C and (b) 45°C, *p < 0.05 and **p < 0.01.

Figure 4. Effects of four formulations on pH in (a) 25°C and (b) 45°C, *p < 0.05 and **p < 0.01.

3.2. Madecassoside 함량 분석

피부투과율을 측정하기 위하여 지표물질인 madecassoside를 농도에 따른 추세 곡선을 얻었으며(Fig. 5), 이를 이용하여 centella quatro에서의 madecassoside 함량(32.5 ± 0.81%)을 분석하였다. Centella quatro에서 madecassoside는 retention time (RT)가 6.426 min으로 확인되었으며, 지표물질인 madecassoside의 RT는 6.339 min으로 유사한 값을 나타내었다(Fig. 6). 이후, Franz diffusion cell system의 회수칸에 시간 별로 투과된 madecassoside의 농도를 구하여 피부투과율을 계산하였다.

Figure 5. Madecassoside calibration curve using HPLC system.

Figure 6. HPLC chromatograms; (a) madecassoside, asiaticoside, madecassic acid and asiatic acid peaks of Centella quatro, (b) madecassoside standard peak, detected at 202 nm.

3.3. 캡슐효율 (Encapsulation efficiency)

Dialysis membrane을 이용한 캡슐효율은 HPLC system을 통해 분석하였다. 그 결과, ethosome이 51.45 ± 1.53%로 가장 효율이 좋았으며, transethosoem이 44.47 ± 0.80%, liposome이 43.73 ± 0.16%, transfersome이 36.65 ± 3.70% 순서였다(Table 4). Trnasfersome을 제외한 나머지 제형은 모두 비슷한 캡슐효율이 나타났으며, ethosome이 가장 높은 캡슐효율을 나타내었는데, 이는 에탄올에 의해 membrane이 유연해 지면서 캡슐효율도 높게 나타났다고 판단하였다. Transfersome은 계면활성제에 의해 막의 가변성은 있으나 캡슐효율이 낮게 나타난 것은 특정 농도 이상으로 혼합되었을 때, 마이셀을 형성하기 때문이라고 판단된다.

Table 4 Encapsulation efficiency results by dialysis membrane method

Sample	Liposome	Transfersome	Ethosome	Transethosome
Capsulating efficientcy (%)	43.73 ± 0.16	36.65 ± 3.70	51.45 ± 1.53	44.47 ± 0.80

3.4. 피부투과율 (skin absorption rate)

병풀정량추출물을 함유한 4가지 제형의 피부투과율을 비교 분석하기 위하여 Franz diffusion cells system을 이용하여 인공피부 (Strat-M)에 대한 피부투과율을 비교분석 하였다. 1, 2, 4, 8, 12, 24 h 경과 후 시간마다 회수칸에서 용액을 채취 하였으며, 실험 종료 후 membrane과 적용칸도 함께 지표물질인 madecassoside의 함량을 HPLC system을 통해 분석하였다. 피부투과율은 24 h 후 membrane을 통과한 madecassoside의 누적투과율로 나타내었으며, 그 결과, transethosome이 45.18%로 누적피부투과율이 가장 높았으며, transfersome은 43.36%, ethosome은 37.35%, liposome은 36.12%의 순으로 나타났다(Fig. 7). 투과 2 h까지는 4가지 제형의 투과율은 비슷하였으나 투과 4 h 이후부터 transethosome의 투과율이 증가하였고, 이후 transfersome의 투과량도 증가하였다. Transethosome은 소포체 막의 가변성과 유연성을 동시에 가지게 되므로 피부투과율 가장 높은 것으로 판단되며, 막의 가변성을 가지는 transfersome과 transethosome이 피부 전달 능력이 우수함을 확인하였다.

Figure 7. Cumulative skin absorption of madecassoside over time by Franz diffusion cell test of four formulations.

또한, 피부 플럭스 (Flux, μg/cm²/h)는 투과 2 h이 지났을 때 liposome과 ethosome의 투과 속도가 급격히 증가하고, 투과 4 h 이후에는 transfersome과 transethosome의 투과 속도가 급격하게 증가하는 것을 확인하였다. 투과 24 h 이후에는 transethosome은 10.79 μg/cm2/h, transfersome은 10.06 μg/cm²/h로 투과속도가 높게 나타났다 (Fig. 8). 이 결과를 통해 transethosome은 지질막 사이에 첨가된 계면활성제가 지질막을 불안정하게 하여 막의 가변형성을 증가시키고, 에탄올에 의해 피부의 유연성이 증가하여 vesicle이 셍체막과 융합하는 것을 촉진시켜 약물의 피부투과를 증진시킬 수 있다[28].

Figure 8. Comparison of four formulations for Flux (μg/cm2/h) of madecassoside over time by Franz diffusion cell test.

3.5. 제형의 형태학적 관찰(Cryo-TEM)

4가지 제형에 대한 형태학적 관찰을 위해 Cryo-TEM을 측정하였다. vesicle size가 90-150 nm 사이로 측정한 vesicle size와 유사하였으며, 지질 이중층을 이루는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 9). 이를 통하여 liposome과 비교하였을 때, transfersome은 지질 이중층에 변형이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 또한, ethosome의 경우는 ethanol로 인한 큰 변화는 관찰되지 않았지만 리포좀의 형태를 띄고 있는 것을 확인하였고, transethosome의 경우는 transfersome과 유사한 형태를 확인할 수 있었다.

Figure 9. Cryo-TEM images of a liposome (A), transfersome (B), ethosome (C), transethosome (D).

본 연구에서는 병출정량추출물을 함유한 리포좀의 다양한 형태에 대한 물리 화학적 특성과 피부투과율에 대한 비교를 진행하였다. 4가지 제형의 물리화학적 특성을 측정하였으며, 상온, 항온에서 2개월 동안 관찰하였다. 그 결과, 제조 2개월이 지난 후 상온에서 liposome과 transfersome의 vesicle size의 변화는 크게 없었다. Ethosome과 transethosome의 vesicle size가 증가한 것을 확인하였으나 모두 200 nm 이하로 측정되어 다소 안정적임을 확인하였다. 항온에서는 liposome의 vesicle size의 변화가 가장 높았으며, transfersome이 가장 변화가 적었다. PDI 결과에서는 상온에서는 모두 안정적이나 항온에서 ethosome과 transethosome의 값이 증가함을 확인하였다. 에탄올에 의해 지질의 극성 머리 부분과 작용하여 계면장력을 감소시킴으로써, vesicle 자체의 막을 유연하고 변형이 쉽게 이루어지게 만드는데, 이러한 특징은 피부 내부로 효과적인 물질 전달을 하지만 휘발성을 가지는 에탄올의 함량이 높으면 활성 물질의 누출, 소포체의 불안정하다고 보고되고 있다[29,30]. Zeta potential과 pH는 상온과 항온에서 안정함을 확인하였다. Franz diffusion cell을 이용하여 4가지 제형에 대한 피부투과 능력을 평가한 결과, transethosome의 피부투과율이 가장 높았으며, transfersome, ethosome, liposome순으로 나타났다. 투과 4 h 이후부터 transethosome의 투과량이 증가하여 41.8%의 피부투과율로 나타났다. 피부투과 속도(Flux)에서는 초기 투과 2 h 경과 후 liposome과 ethosome의 속도가 상승하였으나, 투과 4 h 이후, transethosome과 transfersome의 투과 속도가 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 transethosome이 계면활성제와 에탄올에 의해서 가변성과 유연성을 동시에 가지게 되므로 각질층 안에 존재하는 지질 막의 계면장력을 감소시켜, 피부장벽이 느슨해지면서 피부 내부로 활성물질의 전달이 효과적으로 더 깊숙한 곳까지 전달되는 것으로 판단된다 [19,31,32]. 4가지 제형에 대한 형태학적 관찰을 위해 Cryo-TEM을 이용하였으며, 모두 지질 이중층을 확인하였고, vesicle size 인 90-150 nm의 크기로 확인되었다.

활성물질을 담지한 여러 형태의 지질기반 nano vesicle의 결과를 살펴보면, 울금추출물을 함유한 transfersome은 liposome, ethosome보다 피부 수분함량 등 개선에 더 용이하다고 보고하였고 [33], 쿼세틴을 함유한 transfersome에서는 리포좀보다 유효성분 전달이 더 높은 것으로 나타났다 [34]. Fraxinus angustifolia의 잎과 껍질 추출물을 함유한 ethosome은 항산화 및 항염증에 더 효과적이라고 보고하였고 [35], 히아루론산을 함유한 ethosome은 대조구에 비해 5배의 피부투과 효능이 있음을 보고하였다 [36]. Miconazole nitrate를 함유한 transfersomal gel은 대조구에 비해 항진균 효능이 더 높은 것으로 나타났으며 [37], Brucine과 strychnine을 담지한 transethosome은 표적기관으로 침투하여 약물방출을 서서히 진행하여 효과적이라는 결과를 보고하였다 [38]. 지질기반의 nano vesicle은 화장품 산업뿐만 아니라 다양한 분야에서 활용되고 있음을 알 수 있다.

본 연구를 통해 4가지 제형에 대한 물리화학적 특징과 형태학적 특징을 알아보았고, 피부투과실험을 통해 가변성과 유연성을 모두 가지는 transethosome의 피부투과율과 플럭스가 가장 높은 것을 확인하였다. 다양한 제형에 대한 실험을 통해 병풀정량추출물을 담지한 nano vesicle은 화장품 제형으로서의 이용 가능성이 있음을 확인하였고, 화장품 원료 뿐만 아니라 국소적으로 피부의 문제에 효과를 주는 방법의 역할도 기대할 수 있다.