미세조류는 광합성 작용을 통해 대기 중의 무기 탄소원인 이산화탄소를 흡수하고 산소를 생산함과 동시에 다양한 형태의 유기물 생산이 가능한 미생물이다. 다양한 온도, 수질, 지형에서 생육이 가능하고 생물의 다양성이 높은 것으로 알려져 있으며 생장속도가 높아 육상식물과 비교하였을 때 단위 면적당 월등한 바이오매스 생산성을 보이고 있는 것이 특징이다. 최근에는 미세조류의 지질이나 탄수화물 등을 이용한 바이오에너지 생산을 위한 원료로 주목받고 있으며, 특정 스트레스 조건에서 베타카로틴 (β-carotene), 아스타잔틴(astaxanthin) 등과 같은 카로티노이드 (carotenoid)계 항산화 색소의 고생산이 가능하여, 이를 이용한 고부가가치의 의약품 및 건강보조식품의 원료 생산 등 활용분야가 점차 확대되고 있다 [1-4].

카로티노이드는 이소프레노이드 (isoprenoid)로 구성된 탄화수소 계열의 생리활성물질로, 이들은 식품, 사료, 화장품 원료 등으로 널리 사용되고 있다. 현재까지 700 여종 이상의 카로티노이드가 보고된 바 있으며, 카로티노이드의 화학적 구조 내 탄소 이중 결합의 수와 패턴, 그리고 작용기에 따라 다양한 생리활성 및 특성을 나타낸다 [1, 5]. 카로티노이드는 크게 라이코펜 (lycopene), 알파카로틴 (α-carotene), 베타카로틴 (β-carotene)과 같은 탄화수소 기반의 카로티노이드와 잔토필 (xanthophylls), 루테인 (lutein), 칸타크산틴 (canthaxanthin), 아스타잔틴 (astaxanthin)과 같은 알코올 기반의 카로티노이드 그룹으로 나뉠 수 있다 [4]. 카로티노이드 생합성 경로는 종에 따라 다르지만 광합성을 하는 미세조류 및 식물의 경우 pyruvate와 glyceraldehyde-3-phosphate (GAP)로부터 만들어진 isopentenyl pyrophosphate (IPP)와 dimethylallyl pyrophosphate(DMAPP)를 전구체로 하여 생합성이 시작되며, 촉매반응에 의해 생성된 geranyl geranyl diphosphate (GGPP)은 phytoene synthase (PSY)의 반응을 통해 phytoene으로 생합성 된다. 이후 phytoene desaturase (PDS)와 zeta-carotene desaturase(ZDS)의 순차적인 반응을 통해 zeta-carotene과 lycopene으로 전환된다. 이렇게 생성된 lycopene은 두 종류의 카로틴 (α-carotene, β-carotene)으로 전환되며, 이들은 루테인 뿐만 아니라 잔토필계 색소인 칸타크산틴, 아스타잔틴 등의 생합성을 위한 전구체로 활용된다 [5-7] (Fig. 1). 카로티노이드는 식물(plant), 조류 (algae), 세균 (bacteria), 진균 (fungi), 효모 (yeast)등과 같은 다양한 유기체로부터 생산이 가능한 것으로 보고되었으며, 그 중 미세조류를 이용한 카로티노이드의 생산은 생리활성이 우수한 카로티노이드 생산뿐만 아니라 이산화탄소 고정화를 동시에 실현이 가능한 방법이라 할 수 있다.

Figure 1. Carotenoid biosynthetic pathway in microalgae.

미세조류로부터 카로티노이드를 효율적으로 생산하기 위한 대표적인 배양 전략은 스트레스 인자의 적용을 들 수 있으며, 미세조류 종에 따라 다양한 스트레스 조건을 고려해볼 필요가 있다 [8,9]. 질소원 (nitrogen)과 인 (phosphorus)의 결핍은 대부분의 녹조류 및 시아노박테리아 (cyanobacteria)의 배양에서 탄화수소 물질의 축적을 유도하는 가장 대표적인 스트레스 조건으로 알려져 있다 [10-12]. 그러나 같은 특정영양염 결핍 조건에서도 미세조류 종에 따라 세포 성장 및 유용산물의 생산에 미치는 영향이 다양하게 나타날 수 있다[13,14]. 또한 해양 미세조류 배양에서와는 달리 담수 유래 미세조류 배양에서 염도 (salinity)는 주된 스트레스 인자로 적용될 수 있는 가능성이 확인되었으며 [15], 광합성을 하는 미세조류의 경우 광도 및 광파장에 따라 미세조류 성장 및 유용산물 생산에 영향을 미칠 수 있다 [16-18]. 언급한 스트레스인자들이 모든 미세조류에 같은 효과를 나타내는 것은 아니며, 같은 종이라 하더라도 서식환경에 따라 다른 생리적 특성을 나타내기도 한다. 따라서 가장 효과적인 카로티노이드의 함량과 생산성을 증대시키는 스트레스 인자를 탐색하고 배양에 적절히 이용하는 것이 카로티노이드 함량과 생산성 증대에 중요하다.

본 연구에서는 담수 미세조류인 Mychonastes pushpae의 루테인 생산에 영향을 미치는 스트레스 조건을 파악하고자 효과적이라고 보고된 질소와 인의 결핍, 고광도, 고염도의 배양조건을 단일 또는 복합적으로 적용하였다. 스트레스 인자에 따른 미세조류의 생장 및 루테인의 생산량을 확인하였다. 또한, 각각의 스트레스 조건 하에서 배양된 M. pushpae에서의 카로티노이드 생합성 유전자들의 전사체량을 비교함으로써 루테인 생산량 변화를 분자유전학적 측면에서 분석하고자 하였다.

2.1. 미세조류 균주 및 종균의 유지

본 연구에 사용된 균주는 삼풍지 (경상북도 예천군 풍양면 풍신리)에서 담수시료를 채취하여 분리된 Mychonastes pushpae 248를 사용하였다 [19]. 미세조류의 종균 유지를 위하여 BG11 배지를 이용하였으며, 배지의 조성은 NaNO₃ 1.5 g/L, K₂HPO₄ 0.04 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.075 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.036 g/L, Citric acid 0.006 g/L, Ferric ammonium citrate 0.006 g/L, Disodium magnesium salt 0.001 g/L, Na2CO₃ 0.02 g/L, Trace-metal mix A5 (H3BO₃ 2.86 g, MnCl2·4H₂O 1.81 g, ZnSO₄·7H₂O 0.222 g, Na2MoO₄·2H₂O 0.39 g, CuSO₂·5H₂O 0.079 g, Co(NO₃)2·6H₂O 0.0494 g/L) 1 mL, 121°C, 1.5기압에서 15분간 멸균한 뒤 사용하였다. 고농도 미세조류 배양을 위해 2 L 원통형 광생물반응기 (bubble column photobioreactor)를 이용하였다. 배양은 온도 22 ± 1°C로 설정하였으며 광도 300 μmol/m²/s를 55 w 형광등을 이용하여 연속적으로 공급하였다. 가스 공급의 경우 이산화탄소 5%가 포함된 가스를 0.1 vvm 속도로 반응기 하단부를 통해 지속적으로 공급하였다.

2.2. 스트레스 조건에 따른 미세조류 카로티노이드 변화

스트레스 조건에 따른 미세조류의 카로티노이드의 함량 변화를 분석하기 위해 Table 1과 같이 3가지 스트레스 조건에서 배양하였다. BG11 배지에서 온도 22±1°C, 300 μmol/m²/s, 5% CO₂ 0.1 vvm 조건에서 7일간 배양된 미세조류 배양액을 2,000 x g에서 20분간 원심분리(Combi 515, Hanil, Incheon, Korea)를 한 뒤 상등액을 제거하였다. 회수된 균체의 잔류 염분 및 세포 잔존물(cell debris)을 제거하기 위해 증류수로 2회 세척하였다. 회수된 미세조류는 각각의 스트레스 조건에 0.03 gDCW/L농도로 0.5 L 원통형 광생물반응기에 접종한 후 배양하였다. 질소와 인 결핍조건 (nitrogen and phosphate starvation; NPS)은 NaNO₃와 K₂HPO₄를 제거한 BG11에서 배양하였고, 고광도 (high light; HL)와 고염도 (high salt; HS) 조건은 NPS 조건에 광도 500 μmol/m²/s와 1% NaCl (10 g/L) 조건으로 각각 배양하였다 (Table 1). 배양 조건은 온도 22 ± 2°C, 5% CO₂ 0.1 vvm 조건으로 배양하였으며, HL조건을 제외한 모든 조건의 광도는 300 μmol/m²/s의 조건에서 배양하였다. 스트레스 조건에서 24시간 배양 후 배양액에서 세포만을 회수하여 유전자 분석을 진행하였다. 루테인 함량의 경우 각 조건에서 3일과 5일 동안 배양한 뒤 회수하여 동결건조한 뒤 루테인 분석에 사용하였다.

Table 1 Conditions of abiotic stress in this study

Experimental group	Nitrogen concentration (mg/L)	Phosphorus concentration (mg/L)	Light intensity (μmol/m2/s)	NaCl concentration (g/L)
Control	247	5.4	300	-
Nitrogen and phosphate starvation (NPS)	-	-	300	-
High light (HL)	-	-	500	-
High salt (HS)	-	-	300	10

2.3. 루테인 함량 분석

스트레스 인자에 따른 미세조류 내 루테인 함량 분석을 위해 각 조건에서 배양된 M. pushpae의 배양액을 2,000 x g에서 20분간 원심분리를 한 뒤 상등액을 제거하고 균체만을 회수하였다. 수확된 균체는 잔류 배지성분과 세포 조각 (cell debris)을 제거하기 위해 증류수로 세척한 후 원심분리하였다. 이 과정을 2회 반복한 뒤, 동결건조기 (FD8512, lshinbiobase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 수거된 균체 건조하여 분석시료로 사용하였다. 건조된 시료는 사용 전까지 자동습도 조절장치 (KA33-73, Sanplatec, Osaka, Japan)에 보관하였다. 건조체 0.2 g 시료에 10 mL의 90% acetone (Sigma–Aldrich, St. Louis, USA)을 50 mL 원통형의 유리관에 각각 혼합 후, 초음파추출기 (Powersonic 410, Hwashin Tech, Daegu, Korea)로 30분간 추출하였다. 미세조류의 루테인 함량은 high performance liquid chromatograph (HPLC; Agilent, Santa Clara, USA)를 이용하여 정밀하게 분석하였다. 분석을 위하여 10 mL의 시료를 HPLC에 주입하였으며, 55분간 분리가 진행되었다. 이 때 사용된 컬럼은 Luna 3 mm C8(2) 100 Å 150 × 4.6 mm Analytical Column (Phenomenex, Torrance, USA)이 사용되었고 컬럼의 온도는 45°C로 설정하였다. 색소의 분석 용매는 methanol(Merck, Darmstadt, Germany)과 물을 70 : 30 (v/v)을 혼합하고 22 mM ammonium acetate (Merck)와 acetate buffer(Merck)를 함유한 pH 4.5의 용매 (A)와 100% methanol (B)를 사용하였으며, 용매 기울기는 5% B-35% B(15분), 35% B(5분), 35% B-60% B(15분), 60% B-100% B(10분), 100% B(10분)를 흘려주었다. 용매 유속은 분당 1 mL로 진행하였으며, 분리된 색소는 450 nm 단파장으로 분석하였다. 표준물질인 루테인(Sigma-aldrich)의 정량곡선에 의해 M. pushpae의 색소 함량을 분석하였다.

2.4. Total RNA 추출 및 cDNA 합성

스트레스 조건이 적용된 환경에서 24시간 배양한 M. pushpae의 total RNA를 추출하기 위해 배양액을 원심분리한 후 균체만을 취해 액체질소로 동결시킨 후 막자사발을 이용하여 파쇄하였다. Total RNA는 Trizol reagent (Thermo Fisher Scientific, USA)와 PureLink™ RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 추출하였다. 이후 DNaseI 처리하여 추출된 RNA 샘플에 포함된 DNA를 제거하였고 house-keeping gene인 actin을 증폭할 수 있는 primer를 이용하여 DNA의 제거 여부를 확인하였다. 정제된 RNA 샘플은 SMART^® MMLV Reverse Transcriptase (TaKaRa, Shiga, Japan)을 이용해 cDNA로 합성하였다. 이를 degenerate PCR 및 qRT-PCR을 위한 주형으로 사용하였다.

2.5. Degenerate PCR 및 염기서열 분석

M. pushpae의 카로티노이드 생합성 효소인 phytoene synthase (PSY), phytoene desaturase (PDS), zeta-carotene desaturase(ZDS)와 house-keeping gene인 actin의 염기서열 확보를 위해 degenerate PCR primer를 Table 2와 같이 제작하였고, M. pushpae의 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR은 TransStart^® FastPfu Fly DNA polymerase (TransGen Biotech, Beijing, China)로 35 cycle (95°C for 20 s, 56°C for 20 s, 72°C for 1 min) 수행하였으며, 확보된 PCR 산물은 ㈜마크로젠(Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다.

Table 2 Sequences of primers used in this study

Target	Purpose	Sequence (5’- 3’)
PSY	Degenerate PCR	F- TGGGCBATCTACGTBTGGTG
		R- TCHARRATYTGGCGGTACAG
	qRT-PCR	F- CCCTGACAGACACCATCTCG
		R- GCGGTAGCAGTAGTCGTACA
PDS	Degenerate PCR	F- TGGAARGAYGAGGAYGGHGA
		R- TCRAACCABATGTGRATGTTG
	qRT-PCR	F- GAAGAGCGGCATCAAGAACA
		R- ATGGCCGACACATACAGGTC
ZDS	Degenerate PCR	F- CACGTSTTCTTYGGCTGCTA
		R- ACNGTGATCACDGGCACGCC
	qRT-PCR	F- CCATTGCCAGCTACATCCAG
		R- CGCCTTGGTCAGCTTCAG
Actin	Degenerate PCR	F- GACATGGARAAGATCTGGCA
		R- GATCCACATYTGYTGGAARGT
	qRT-PCR	F- GACATCCGCAAGGACCTCTA
		R- AGCCACCACCTTGATCTTCA

2.6. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

확보된 M. pushpae의 카로티노이드 생합성 효소인 PSY, PDS, ZDS의 염기서열을 기반으로 qRT-PCR을 위한 primer를 Table 2와 같이 제작하였다. Real-time PCR은 TB Green^® Premix Ex Taq^TM(TaKaRa, Shiga, Japan)과 Thermal Cycler Dice Real Time System (TaKaRa)을 이용해 40 cycle (95°C for 30 s, 56 °C for 30 s, 72 °C for 20 s) 수행하였으며, 각 샘플당 3 반복하여 수행하였다.

2.7. 통계분석

모든 분석은 3번의 반복 수행하였으며, 분석 수치는 Mean ± SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 Prizm 프로그램 (GraphPad Software, La Jolla, USA)을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 P < 0.05 수준에서 analysis of variance와 Tukey’s test에 의해 분석하였다 [20].

3.1. 스트레스 인자에 따른 루테인 함량 변화 비교

다양한 스트레스 조건은 미세조류의 지질과 색소 생산에 영향을 미친다고 보고된 바 있다. 질소 결핍과 고염도 스트레스 조건은 미세조류의 루테인 생산에 영향을 미치며, 특히 고광도 스트레스 조건은 미세조류의 광산화 손상에 대한 세포 방어기작을 일으켜 루테인 축적을 유도하는 것으로 알려져 있다 [21]. 본 연구에서는 미세조류의 지질 및 카로티노이드 함량증가에 효과적인 것으로 알려진 질소와 인의 결핍(NPS), 고광도 (HL) 그리고 고염도 (HS) 스트레스 인자들을 단일 또는 복합 조건을 적용하여 루테인 함량 및 관련 유전자 발현을 비교하고자 하였다 [22]. Fig. 2(A)의 세포의 생장 결과에서 보는 것처럼 배양 7일 모든 스트레스가 조사된 조건에서는 뚜렷한 세포의 생장은 일어나지 않았다. 이는 미세조류 생장에 가장 중요한 영양염인 질소와 인의 결핍과 스트레스 조사로 인한 것이다. Fig. 2(B)에서 나타난 바와 같이 대조군 조건에서 배양된 M. pushpae에서의 단위 세포 당 루테인 함량은 배양 3일과 5일에 각각 780 ± 31 μg/g, 그리고 898 ± 4 μg/g으로 확인된 반면, NPS 조건이 적용된 배양 조건에서 배양된 M. pushpae에서의 루테인 함량은 배양 3 일과 5 일에 3,403 ± 116 μg/g, 그리고 3,530 ± 71 μg/g으로 확인되었다. 이는 대조군에 비해 각각 4.4 배, 3.9 배 증가된 수치로 담수 미세조류인 M. pushpae의 배양에서 NPS 스트레스 인자가 루테인 함량 증대에 효과적인 것으로 판단된다. 또한 NPS와 고광도 스트레스 인자가 복합적으로 적용된 HL에서 배양된 M. pushpae에서 배양 3 일과 5 일에 각각 3,300 ± 30 μg/g, 그리고 3,110 ± 60 μg/g의 루테인 함량을 보였으며, HS에서 배양된 M. pushpae의 루테인 함량은 배양 3 일, 5 일차에 각각 3,469 ± 75, 3,403 ± 6 μg/g이였다. 이는 배양 3 일 차를 기준으로 모든 실험군 조건에서 배양된 M. pushpae의 루테인 함량이 대조군 조건에서 배양된 M. pushpae의 루테인 함량에 비해 최소 4 배 이상씩 증가한 수치를 보였다. 반면, HL과 HS와 같이 복합 스트레스가 적용된 배양 조건에서 배양된 M. pusphae 내의 루테인 함량이 NPS 스트레스가 단일 적용된 배양 조건에서 배양된 M. pushpae의 루테인 함량과 비교하였을 때 유사하거나 미세하게 감소한 것으로 판단할 때, M. pushpae로부터 루테인 생산은 복합 스트레스 조건 (HL, HS)보다 특정 영양염이 제거된 NPS조건이 더 효과적인 것으로 판단된다. 녹조류 및 cyanobacteria를 대상으로 한 선행연구결과와 유사하게 NPS 스트레스 인자가 담수 미세조류인 M. pushpae에서 루테인 함량 증가에 중요한 스트레스 인자로 판단된다 [11,12,23-25].

Figure 2. Time profiles of M. pushpae dry cell weight (A), and lutein contents (B) under various stresses conditions. Arrow indicates the onset of stress culture conditions. ***p < 0.001 versus the control.

3.2. M. pushpae의 카로티노이드 생합성 유전자들의 염기서열 확보

phytoene synthase (PSY), phytoene desaturase (PDS), zetacarotene(ZDS)은 카로티노이드 생합성 효소로서 순차적인 반응으로 카로티노이드 합성에 관여하며, 특히 PSY는 카로티노이드 합성에 대한 탄소흐름의 중요한 조절자 인자이다[26]. 본 연구에서는 스트레스 조건에 따른 M. pushpae 내의 루테인 함량 증가가 루테인 생합성유전자 발현과의 연관성을 확인하고자 M. pushpae의 카로티노이드 생합성 유전자들의 전사체량을 비교하였다. 담수 미세조류인 M. pushpae의 유전체 정보가 밝혀져 있지 않은 상태이므로 카로티노이드 생합성 효소 3종 (phytoene synthase (PSY), phytoene desaturase(PDS), zeta-carotene (ZDS)과 house-keeping gene인 actin의 염기서열 확보를 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 현재까지 보고된 녹조류의 카로티노이드 생합성 유전자들의 염기서열을 비교하였다. 높은 상동성을 보이는 염기서열을 기반으로 하여 degenerate PCR을 위한 primer를 제작하였다 (Table 2). 확보된 M. pushpae의 PSY 암호화 유전자의 염기서열은 총 624 bp였으며, Chlorella sorokiniana, Auxenochlorella protothecoides, Micractinium conductrix종 PSY의 염기서열과 각각 97.60%, 95.67%, 94.71%의 유사성을 보였다 (Table 3). 768 bp 길이의 M. pushpae의 PDS 암호화 유전자 염기서열 역시 C. sorokiniana의 PDS와 98.05%의 유사성을, M. conductrix와 A. protothecoides의 PDS와는 각각 93.00%, 88.85%의 높은 유사성을 보임을 확인할 수 있었다 (Table 4). 또한 확보한 750 bp 길이의 M. pushpae의 ZDS 암호화 유전자 염기서열은 C. sorokiniana, M. conductrix, A. protothecoides의 ZDS와 각각 99.20 %, 88.00 %, 85.60 %의 유사성을 보이는 것을 확인하였다 (Table 5). 본 연구를 통해 확보된 PSY, PDS, ZDS의 염기서열은 각각 OP970658, OP970659, OP970660으로 NCBI의 GenBank에 등록되었다. 본 연구를 통해 담수 미세조류 M. pushpae의 카로티노이드 생합성 유전자 3 종의 염기서열 일부를 최초로 규명하였다는 것에 의의가 있으며, 연구에 사용된 degenerate PCR primer들은 M. pushpae을 포함한 카로티노이드를 생산할 것으로 예상되는 모든 생물들의 스크리닝에도 적용할 수 있는 유용한 도구로써 활용될 수 있을 것이다.

Table 3 BLAST result of PSY encoding gene sequence from M. pushpae

Description	E value	Identity (%)
Phytoene synthase [Chlorella sorokiniana]	7e-146	97.60
Phytoene synthase [Auxenochlorella protothecoides]	1e-143	95.67
Phytoene synthase [Micractinium conductrix]	3e-142	94.71
Hypothetical protein [Chlorella variabilis]	1e-138	93.75
Chloroplast phytoene synthase [Scenedesmus acutus]	3e-118	80.77

Table 4 BLAST result of PDS encoding gene sequence from M. pushpae

Description	E value	Identity (%)
Phytoene desaturase [Chlorella sorokiniana]	0.0	98.05
Phytoene desaturase [Micractinium conductrix]	6e-176	93.00
Hypothetical protein [Chlorella variabilis]	2e-172	88.85
Phytoene desaturase [Auxenochlorella protothecoides]	3e-169	89.45
Phytoene desaturase [Auxenochlorella protothecoides]	4e-168	89.06

Table 5 BLAST result of ZDS encoding gene sequence from M. pushpae

Description	E value	Identity (%)
Zeta-carotene desaturase [Chlorella sorokiniana]	1e-180	99.20
Zeta-carotene desaturase [Micractinium conductrix]	8e-159	88.00
Zeta-carotene desaturase [Auxenochlorellaprotothecoides]	3e-153	85.60
Hypothetical protein [Chlorella variabilis]	7e-147	84.00
Zeta-carotene desaturase [Coccomyxa subellipsoidea C-169]	7e-144	80.00

3.3. 다중 스트레스 조건 하에서 배양된 M. pushpae 의 카로티노이드 생합성 유전자들의 전사체 비교

스트레스 환경에서 배양된 M. pushpae의 바이오매스로부터 전사체를 추출하였고 이를 전사체량 분석을 위한 qRT-PCR(quantitative Real-Time PCR) 분석을 위한 시료로 활용하였다. 카로티노이드 생합성 과정에서 가장 먼저 관여할 것으로 예상되는 PSY 암호화 유전자의 전사체량을 비교한 결과, 스트레스 조건이 적용되지 않은 대조군과 NPS 스트레스가 단일으로 적용된 배양 조건, 그리고 NPS 및 HS 스트레스 조건이 복합적으로 적용된 배양 조건에서의 M. pushpae에서는 PSY 암호화 유전자의 전사체가 감지되지 않을 정도로 매우 낮은 수준이었으나 NPS 및 HL 스트레스 조건이 복합적으로 적용된 배양 조건 하에서의 M. pushpae에서 PSY 암호화 유전자의 전사체가 약 100배 이상 대폭 증가한 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3(A)). 또한 스트레스가 적용되지 않은 대조군에 비해 스트레스 조건이 적용된 세 가지의 배양 조건에서 M. pushpae PDS 암호화 유전자의 전사체량이 모두 증가하였으며 NPS 스트레스가 단독 적용된 배양조건보다 HS 혹은 HL 스트레스 조건이 복합적으로 적용된 배양 조건에서의 M. pushpae의 PDS 전사체량이 추가로 증가된 것을 확인할 수 있었다. 모든 (NPS, HS, HL) 스트레스 조건에서 배양된 M. pushpae의 PDS 암호화 유전자의 전사체량은 대조군에 비해 최소 10배 이상 증가를 보인 것으로 보아 HS, HL 스트레스 조건과 같이 복합적인 스트레스 조건이 PDS의 전사체량을 증가시키는 데 긍정적인 영향을 준 것으로 유추할 수 있었다 (Fig. 3(B)). 뿐만 아니라 ZDS 암호화 유전자의 전사체량 역시 스트레스 조건이 적용되지 않은 대조군에서는 전사체량이 분석되지 않을 정도로 매우 낮은 수준이었으나 모든 스트레스 조건에서 배양된 M. pushpae에서는 전사체량이 증가하여 감지되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 NPS 스트레스가 단일로 적용된 배양조건보다 NPS 및 HS 혹은 HL 스트레스 조건이 복합적으로 적용된 배양조건 하에서의 M. pushpae ZDS 암호화 유전자의 전사체량은 대조군에 비해 약 100 배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3(C)). 따라서, M. pushpae의 배양에서 스트레스 조건의 적용이 카로티노이드 생합성 유전자들의 전사체량을 증가시키는 데 긍정적인 영향을 준 것으로 판단된다.

Figure 3. Transcript profiles of carotenoid biosynthetic genes in M. pushpae under stress condition. phytoene synthase (PSY) (A), phytoene desaturase (PDS) (B), zeta-carotene desaturase (ZDS) (C). M. pushpae was cultured without stress condition (Control), with nitrogen and phosphate starvation (NPS). High light (HL) and high salt (HS) stress conditions were additionally applied to NPS stress condition, respectively.

앞서 언급된 세 가지의 카로티노이드 생합성 유전자 (PSY, PDS, ZDS)들은 순차적인 반응을 통해 카로티노이드 생합성 경로에서 주된 전구물질인 라이코펜을 생산해내는데 라이코펜은 이후 환형 단계에 따라 알파카로틴 혹은 베타카로틴으로 생전환된다. 본 연구의 목표 물질인 루테인은 알파카로틴으로부터 유래되는 물질로, 3 종의 카로티노이드 생합성 유전자들의 전사체량 증가가 주된 전구물질인 라이코펜의 고생산을 유도하였을 것으로 추측할 수는 있으나 이렇게 증가된 라이코펜은 루테인의 기질 물질인 알파카로틴 뿐만 아니라 베타카로틴의 생합성에 기여할 수도 있음으로 3 종의 카로티노이드 생합성 유전자들의 전사체량 증가와 루테인 함량 증대가 완벽하게 일치하지 않는 것으로 짐작된다. 이는 배양조건이나 미세조류 종에 따라 PSY 혹은 PDS가 과발현하였을 때 생산되는 카로티노이드의 조성과 함량이 다양할 수 있음을 시사한다 [27]. 구체적으로 Ma et al. [28]연구에 따르면, Chlamydomonas reinhardtii의 경우 625 μmol/m²/s 이상의 광에너지가 조사될 경우 알파카로틴에서 생산되는 루테인의 생산은 감소하고, 알파카로틴에서 생산되는 제아잔틴의 생산량은 증가하는 것으로 알려져 있어 배양조건과 관련 전자의 발현과의 상관성을 이해하고 최적화하는 과정이 필요할 것으로 판단된다.

본 연구에서는 토착 담수미세조류인 M.pushpae로부터 루테인의 함량을 증대시키고자 다양한 환경스트레스에서 배양하였다. 루테인의 함량뿐만 아니라 카로티노이드 생합성 유전자의 발현량을 비교분석하여 효과적인 환경인자를 선정하고자 하였다. 스트레스 조건하에서 루테인 함량 및 생합성 관련 유전자들의 유의미한 확연한 증가를 확인할 수 있었다.

본 연구에서는 국내에서 발굴한 유용 담수 미세조류인 M. pushpae로부터 생리활성과 항산화력이 우수한 루테인의 생산성을 증가시키고자 단일 또는 복합 스트레스 조건을 적용한 환경에서 배양하였다. 또한 스트레스 조건에 따른 루테인 함량 변화와 카로티노이드 생합성 유전자들의 전사체량 변화의 상관관계를 확인하고자 하였다. 기존에 밝혀진 녹조류의 카로티노이드 생합성 유전자들의 염기서열을 기반으로 degenerate PCR을 수행하여 유전체 정보가 밝혀지지 않은 담수 미세조류인 M. pushpae의 카로티노이드 생합성 유전자의 염기서열을 처음으로 규명하였다. 본 연구를 통해 개발된 degenerate PCR primer는 카로티노이드를 생합성하는 모든 생물체를 스크리닝할 수 있는 유용한 도구로 활용할 수 있을 것이다. 또한 향후 배양환경에 따른 카로티노이드 생합성 유전자의 발현변화와의 상관성에 대한 추가적인 연구를 통해 효과적으로 특정 카로티노이드의 생산 증대가 가능할 것으로 기대된다.

이 연구는 환경부의 재원으로 국립낙동강생물자원관에서 지원을 받아 수행된 연구입니다 (NNIBR202303101).