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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2023; 38(3): 188-193

Published online September 30, 2023 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2023.38.3.188

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

재조합 대장균을 이용한 재조합 Glucagon-like Peptide-1 생산 조건 최적화

Optimization of Recombinant Glucagon-like Peptide-1 Production Using Recombinant E. coli

You-Chan Jeon1,2, Deok-Ho Kwon1,2, Yoojin Lee3, Sanghoon Lee3, Sung-Hun Kwon3, Hyung-Moo Jung3, Suk-Jin Ha1,2,*

1Department of Bioengineering and Technology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
2Department of Biohealth-machinery convergence engineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
3Central R&D Center, HANKOOK KORUS CO., LTD, Seoul 07282, Korea.

Correspondence to:Tel: 82-33-250-6278, Fax: 82-33-243-6350
E-mail: sjha@kangwon.ac.kr

Received: April 14, 2023; Revised: June 13, 2023; Accepted: June 14, 2023

Obesity is well known as a metabolic abnormality and potentially life-threatening condition associated with several chronic diseases. Various peptide drugs have been developed to treat obesity. In this study, optimization of expression conditions were performed to produce glucagon-like peptide-1 (GLP-1), which is used as an obesity treatment in recombinant E. coli. After the construction of expression vector system and optimization of expression conditions, the productivity of GLP-1 was increased to 11.18 mg/L·h in flask cultivation. Through fermentation conditions were optimized for bioreactor, the GLP-1 productivity was increased to 16.80 mg/L·h in bioreactor, which was 50.27% improvement as compared to the flask cultivation. When 1.00 mM lactose was used as an inducer instead of IPTG, 17.39% higher expression was shown than that with 0.01 mM IPTG.

Keywords: Glucagon-like peptide-1, Escherichia coli, bioreactor, lactose

비만은 다른 여러 만성질환의 발병뿐만 아니라 잠재적으로 생명을 위협하는 질병으로 알려져 있다 [1,2]. 세계보건기구 (WHO)의 통계에 따르면 전세계 인구의 약 13%가 비만인 상태이며, 향후 비만 인구는 기하급수적으로 증가할 것으로 예측하고 있다 [3,4]. 이러한 상황을 대처하기 위해 비만을 치료하기 위한 다양한 펩타이드 약물이 개발되고 있다 [5,6]. 현재 비만치료제 시장에는 Orlistat (Xenical), naltrexonebuspropion (Contrave), liraglutide (Saxenda), phentermine-topiramat (Qsyima) 등 다양한 기전의 치료제가 개발되어 왔으며, 그중 가장 높은 점유율을 차지하고 있는 liraglutide (Saxenda)의 원료인 Glucagon-like peptide-1 (GLP-1)은 초기에 제2형 당뇨병 치료제로 개발되었으나, 식욕억제, 소화억제 등과 같은 효과로 비만치료제로서 주목받게 되었다 [7-9].

장관 내 영양분 또는 혈당 농도에 자극을 받아 L세포에서 분비되는 인크레틴 호르몬인 GLP-1은 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 전구호르몬인 프로글루카곤으로부터 만들어지게 된다 [10-12]. 회장과 대장의 L세포에서 최종적으로 GLP-1이 만들어지고, 이후 생성된 GLP-1은 N말단의 일부가 잘리면서 활성화된다 [12,13]. 활성화된 GLP-1은 체순환을 통해 시상하부와 뇌간의 수용체에 작용하여 식욕과 소화기관의 운동 억제 등의 효과를 통한 포만감으로 비만치료제로써 사용되고 있다 [14,15].

하지만, 비만치료제로써 GLP-1의 뛰어난 효과에도 불구하고 체내에서 dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4)에 의해 분해되어 반감기가 짧다는 단점을 가지고 있다 [16]. 이러한 문제를 극복하기 위해서 DPP-4가 인식하는 GLP-1 상의 아미노산 서열이 변경된 Exenatide (Byetta)와 GLP-1에 지방산을 결합하여 DPP-4에 대한 감수성이 낮게 개발된 Liraglutide (Saxenda) 등과 같이 DPP-4 저항성을 가지는 GLP-1 기반 비만치료제가 개발되고 있다 [17,18].

본 연구에서는 GLP-1에 지방산을 특이적으로 결합시키기 위해 천연 GLP-1 아미노산 서열에서 34번 lysine을 arginine으로 치환하였으며, E. coli BL21 (DE3) 균주에 형질전환을 통해 GLP-1 단백질을 생산하는 재조합 균주로 개발하였다 [19,20]. 또한, GLP-1의 대량 생산을 위해 IPTG 농도, induction 시간, induction 온도 조건을 조절하여 발현조건 최적화를 수행하였으며 발효기를 이용한 scale-up 그리고 lactose를 inducer로 사용하기 위한 연구를 수행하였다.

2.1. GLP-1 발현 벡터 개발

발현 벡터 제작을 위해 E. coli TOP10 (Invitrogen, CA, USA) 균주를 호스트로 사용하였다. Luria-Bertani (LB) broth (Difco Laboratories, MI, USA)를 사용하여 E. coli를 배양하였으며, 필요에 따라 chloramphenicol (Sigma Aldrich, Korea)를 사용하였다. GLP-1 서열을 확보하기 위해 GLP-1_F_NcoI (5’-CCATGGGCAGCCATCATCATCAT-3’)과 GLP-1_R_XhoI (5’-CTCGAGTTATTATTAACCACACGACC-3’) primer를 이용하여 PCR을 통한 유전자 증폭을 진행하였으며 pACYCDeut-1 벡터에 삽입하였다. 벡터 제작을 위한 제한효소 및 ligase 효소 등은 모두 Enzynomics (Daejeon, Korea)의 제품을 이용하였다.

2.2. GLP-1 발현 조건 및 발현 균주 최적화

GLP-1의 발현을 위해 개발한 벡터를 다양한 발현 균주에 형질전환하여 GLP-1 생산에 최적화된 균주를 선별하였다. 사용된 균주로는 E. coli BL21 (DE3), E. coli Rosetta (DE3), E. coli HMS174 (DE3)을 사용하였으며, 단백질 발현을 위한 배양 조건으로는 250 ml 플라스크에 50 ml 부피의 LB 배지에 최종 농도가 25 μg/mL이 되도록 chloramphenicol (Sigma Aldrich, Korea)이 첨가하여 37°C에서 200 rpm으로 배양하였다. O.D 값이 0.5에 도달하였을 때 단백질 발현을 유도하였으며, 단백질 발현 조건 최적화를 위해 IPTG 농도, 시간, 그리고 온도조건을 달리하여 GLP-1 발현을 유도하였다.

2.3. 발효기를 이용한 발현 조건 최적화

E. coli를 이용한 GLP-1의 발현 최적화를 위해 총 부피 3.0 L 의 발효기 (Bi°CNS, korea)를 사용하여 실험을 수행하였다. 최종 농도가 25 μg/mL이 되도록 chloramphenicol이 첨가된 LB배지 2.0 L를 이용하여 발현 최적화 실험을 진행하였다. 흡광도 값이 0.5가 되었을 때, IPTG 0.01 mM 그리고 37°C 조건으로 발현을 유도하였으며, 교반속도에 따른 단백질 발현을 비교하기위해 400, 500, 600 그리고 700 rpm 조건에서 최적화 실험을 수행하였다.

2.4. 단백질 발현 유도 물질로써 IPTG와 lactose의 단백질 발현 비교

단백질 발현 유도 물질로 IPTG 대신 lactose를 사용하였을 때, GLP-1의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 수행하였다. 최종 농도가 25 μg/mL이 되도록 chloramphenicol이 첨가된 LB 배지 50 ml에 GLP-1 발현벡터가 삽입된 재조합 E. coli를 접종하여 37°C에서 200 rpm으로 배양하였으며, O.D 값이 0.5에 도달하였을 때, IPTG 또는 lactose을 사용해 단백질 발현을 유도하였다. 유도 물질에 의한 GLP-1 발현을 비교하기위해 lactose 농도 조건을 달리하여 단백질 발현을 수행하였다.

2.5. SDS-PAGE를 이용한 발현 확인

GLP-1 유전자가 삽입된 재조합 E. coli의 발현을 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 상등액이 제거된 세포에 BPER (Thermo fisher, USA)를 10분간 처리하여 시료를 준비하였으며, 5분간 15,000 g로 원심분리 후 불용성 단백질과 수용성 단백질을 분리하였다. SDS-PAGE의 stacking gel은 5% polyacrylamide를 그리고 separating gel은 12% polyacrylamide를 각각 이용하였으며 전기영동은 stacking gel과 separating gel 각각 15분동안 80 V와 500 mA, 45분 동안 200 V와 500 mA로 진행하였다. 그 후 Coomassie staining solution (Coomassie brilliant blue R-250 3 mM, Sigma aldrich, Korea)를 이용하여 30분 동안 염색을 진행하였으며, 증류수로 세척한 후 destaining solution을 첨가하여 탈색을 진행하였다. 탈색된 SDS-PAGE gel의 각각의 band의 크기는 프로그램 ImageJ (Softonic International Ed. Media TIC)를 이용하여 수치화 하였다.

2.6. Ni-NTA를 이용한 GLP-1 정제

GLP-1 정제는 HisPurTM Ni-NTA Resin (Thermo fisher, USA)를 사용하여 정제를 진행하였다. 사용된 buffer는 1차 washing buffer (imidazole 5 mM), 2차 washing buffer (imidazole 25 mM) 그리고 elution buffer (imidazole 250 mM)로 Ni-NTA column에 통과시켜 목표하는 단백질을 정제하였다. 이후, 각각의 차수별로 정제된 sample을 SDS-PAGE를 이용하여 결과를 확인하였다.

2.7. Bradford assay를 이용한 단백질 정량

Ni-NTA 컬럼으로 정제한 단백질을 증류수에 10배 희석하여 시료를 준비하였다. 표준시료와 정제된 단백질을 96 well plate에 넣고 Bradford regent (Sigma Aldrich, Korea)를 첨가하여 30°C에서 10초 동안 반응시켰으며, Microplate reader (Biotek, Winooski, USA)를 이용하여 흡광도 (A600nm)를 측정하였다. 정량은 표준시료를 기준으로 곡선을 그리고 흡광도 값을 이용하여 플라스크와 발효기에서 생산가능한 단백질을 정량하였다.

3.1. 플라스크를 이용한 GLP-1 발현 조건 최적화

E. coli에서 이종 단백질을 발현하는 경우, 동일한 발현 균주를 이용한 단백질의 발현 패턴도 발현조건에 따라 크게 다른 경우가 많이 존재하며, 많은 이종 단백질의 경우 insoluble 형태로 발현된다 [21]. 따라서 플라스크에서 soluble 형태의 GLP-1 발현을 위한 발현 조건 최적화 실험을 진행하였다. IPTG 농도에 따른 GLP-1 발현량 차이를 확인한 결과 IPTG의 농도가 증가함에 따라 발현 정도는 증가하였으며 0.01 mM 이상의 농도에서는 유사한 단백질 발현 양상을 확인하였다 (Fig. 1(A)). 따라서 고가의 IPTG를 고려하여, IPTG 농도 대비 GLP-1 발현량이 우수한 0.01 mM IPTG 조건이 단백질 발현에 더 적합한 것으로 판단하였다. 발현 온도 조건에 따른 발현 차이를 확인한 결과 20°C 온도조건에 비해 37°C 온도에서 soluble 형태의 GLP-1 단백질 발현량이 2.1배 그리고 insoluble 형태의 GLP-1 단백질 발현량이 1.8배 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1(B)). 특히 일반적인 단백질의 경우 발현 온도 조건이 높아질수록 insoluble 단백질 발현이 증가하여 낮은 온도에서 천천히 발현을 유도하지만, GLP-1의 경우엔 37°C의 높은 온도 조건에서 상대적으로 soluble한 GLP-1의 발현 비율이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 발현 시간 조건에 따른 GLP-1 단백질의 발현을 비교한 결과 4시간 조건에서 단백질 발현이 가장 낮은 것을 확인할 수 있었으며, 8시간과 12시간 순으로 단백질 발현량이 증가하여 4시간 조건에 비해 12시간에서 약 1.7배 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1(C)). 하지만 12 시간 이후 조건에서는 비슷한 발현 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 발현시간으로는 12시간이 높은 비율로 soluble한 형태의 GLP-1 단백질을 발현할 수 있음을 확인할 수 있었다. 플라스크에서 GLP-1 단백질 발현 유도 조건 최적화 진행 결과 최종적으로 37°C, 12 시간 그리고 IPTG 0.01 mM에서 GLP-1의 soluble한 발현 비율이 가장 높았다.

Figure 1. Optimization of GLP-1 expression according to induction conditions by recombinant E. coli BL21 (DE3). (A) IPTG concentrations, lane 1: 0 mM, lane 2: 0.001 mM, lane 3: 0.005 mM, lane 4: 0.01 mM, lane 5: 0.05 mM, lane 6: 0.1 mM, lane 7: 0.5 mM and lane 8: 1.0 mM. (B) Culture temperatures, lane 1: 20oC, lane 2: 25°C, lane 3: 30oC and lane 4: 37oC. (C) Time after induction, lane 1: 4 h, lane 2: 8 h, lane 3: 12 h, lane 4: 16 h and lane 5: 20 h.

3.2. 발현 균주에 따른 GLP-1 발현 비교

E. coli를 사용하여 재조합 단백질의 생산할 때 대부분의 유전자의 발현 수준이 낮고 생성물이 분해되거나 활성이 부족하다는 문제가 발생하지만 발현 균주나 발현 조건을 변경한 다면 재조합 단백질을 효과적으로 생산할 수 있다 [22]. 따라서 발현 균주에 따른 GLP-1 단백질 발현의 차이를 비교하기 위해 E. coli BL21 (DE3), E. coli Rosetta (DE3), E. coli HMS174 (DE3) 균주를 각각 발현 균주로 이용하여 비교하였다. 3종의 균주 모두 T7 promoter를 사용하여 단백질을 생산하기 위한 발현 균주로, E. coli BL21 (DE3)과 E. coli Rosetta (DE3)는 Lon, OmpT protesase가 결핍되어 있어 표적 단백질 발현에 적합하다. E. coli Rosetta (DE3)는 E. coli에서 거의 사용되지 않는 코돈을 포함하는 pRARE가 추가되어 이종 단백질 발현을 향상시키도록 개발된 균주이며, E. coli HMS174 (DE3)는 recA1 mutation된 균주로 DNA의 재조합을 막아 삽입된 플라스미드를 안정적으로 보유할 수 있다는 특징을 가진다. 3종의 발현 균주를 이용하여 GLP-1 단백질을 발현한 결과 E. coli BL21 (DE3)과 E. coli Rosetta (DE3), E. coli HMS174 (DE3)를 비교하였을 때 모두 soluble한 형태의 GLP-1 단백질로 발현되었으며, 발현 균주에 따른 GLP-1 단백질 발현 비율에 큰 차이를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 다만 E. coli BL21 (DE3)과 E. coli Rosetta (DE3)에서 발현 비율이 E. coli HMS174 (DE3)에 비해 다소 높은 것을 확인할 수 있었으며 E. coli Rosetta (DE3)의 경우 pRARE에 의해 추가적인 항생제를 필요로 하므로 최종적으로 GLP-1 단백질 발현에 가장 적합한 발현 균주로 재조합 E. coli BL21 (DE3)-GLP1 균주를 선정하였다.

3.3. 발효기를 이용한 GLP-1의 발현 조건 최적화

E. coli를 이용한 재조합 단백질 생산에서 발효기를 사용한 scale up의 가능 여부는 매우 중요하며, 발효기를 사용하였을 때, 플라스크를 이용한 단백질 발현 결과와 다르게 발현이 감소하거나 증가하는 경우가 발생하기도 한다. 따라서 플라스크를 이용한 단백질 발현 최적 조건과 재조합 E. coli BL21 (DE3)-GLP1 균주를 이용하여 발효기를 이용한 GLP-1 발현 조건 최적화 실험을 진행하였다. 발효기의 발현 조건 최적화를 위해 플라스크에서 최적화된 최적 발현 조건과 동일한 조건에서 교반속도 조건만 400, 500, 600, 또는 700 rpm으로 달리하여 GLP-1 발현량을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. 시간에 따른 발현을 비교한 결과 6시간 이후 발현량은 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 따라서 6시간 조건에서 발현을 진행할 경우, 짧은 발현시간으로도 높은 비율로 soluble한 형태의 GLP-1 단백질을 발현할 수 있음을 확인하였다 (data not shown). 교반속도 400 또는 500 rpm 조건에서 가장 우수한 GLP-1의 발현을 나타내었지만, 교반속도가 증가된 600 또는 700 rpm 조건에서는 GLP-1의 발현량은 오히려 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 이는 교반속도가 400 rpm에서 700 rpm으로 증가할수록 세포의 성장이 증가하는 것을 확인하였으며, 따라서 교반속도가 증가할수록 세포 성장으로 대사가 이루어졌기 때문에 GLP-1 발현이 감소한 것으로 사료된다. 플라스크와 발효기를 이용하여 각각의 최적 조건에서 발현된 GLP-1 단백질을 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 정제한 후 단백질 농도를 정량한 결과 GLP-1 생산량은 플라스크의 경우가 134 mg/L로 발효기(101 mg/L)의 경우와 비교해 높은 생산농도를 나타내었으나 발효기의 경우 배양 시간이 단축되어 16.80 mg/L·h의 GLP-1 생산성을 나타내었고 플라스크의 경우엔 11.18 mg/L·h의 생산성을 나타내었다. 따라서 플라스크에 비해 발효기를 이용하여 GLP-1을 발현했을 때, 생산성이 50.27% 증가하는 것을 확인할 수 있다(Table 1).

Figure 2. Comparisons of soluble or insoluble form GLP-1 by recombinant E. coli BL21 (DE3) with 0.01 mM IPTG using bioreactor for 6 h at 37oC. (A) SDS-PAGE results, lane 1: 400 rpm total protein, lane 2: 400 rpm insoluble protein, lane 3: 400 rpm soluble protein, lane 4: 500 rpm total protein, lane 5: 500 rpm insoluble protein, lane 6: 500 rpm soluble protein, lane 7: 600 rpm total protein, lane 8: 600 rpm insoluble protein, lane 9: 400 rpm soluble protein, 10: 700 rpm total protein, lane 11: 700 rpm insoluble protein, and lane 12: 700 rpm soluble protein. (B) SDS-PAGE results were analyzed and digitalized by ImageJ program (Dark gray: insoluble GLP-1 fraction and White: soluble GLP-1 fraction).

Table 1 Comparisons of GLP-1 production by recombinant E. coli BL21 (DE3) using flask or bioreactor

FlaskBioreactor
Induction time (h)126
Agitation speed (rpm)200400
Optical density ((A600 nm))3.53.1
GLP-1 production (mg/l)134101
GLP-1 productivity (mg/L·h)11.1816.80


3.4. Lactose를 이용한 GLP-1 단백질 발현 유도

단백질 발현의 유도물질로 사용되는 IPTG는 효과적으로 단백질 발현을 유도하지만 높은 비용과 인체에 대한 잠재적인 독성으로 인해 의약품 생산에 부적합하다고 알려져 있다. 반면, lactose는 비용이 저렴하고 인체에 대한 독성이 없어 IPTG 대체제로서 대량 생산에 활용되고 있으나, lactose를 사용하여 단백질 발현을 유도할 경우 lactose가 세포 성장의 기질로 소비되어 IPTG에 비해 단백질 발현 효율이 낮은 것으로 알려져 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 lactose를 유도물질로 사용한 단백질 발현을 위한 최적 농도 조건을 찾는 것이 중요하다. 본 연구에서 GLP-1 발현의 최적 IPTG 농도인 0.01 mM과 비교하여, lactose의 최적 농도 조건을 알아보기 위해 lactose의 농도를 0.001 mM, 0.01 mM, 0.1 mM, 1 mM, 10 mM로 각각 달리하여 단백질 발현을 비교하였다. 실험 결과 Lactose 농도가 증가할수록 GLP-1의 발현이 증가하였으며, 특히 lactose 1 mM 조건에서 GLP-1 발현이 IPTG 최적 농도 조건의 경우와 비교해 17.39% 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 따라서 lactose를 유도물질로 사용하여 GLP-1의 대량 생산을 진행할 경우 1 mM의 조건이 GLP-1 발현에 적합하다고 사료된다.

Figure 3. Comparison of GLP-1 protein expression by recombinant E. coli BL21 (DE3) according to lactose concentrations. (A) SDS-PAGE results, lane 1: IPTG 0.01 mM, lane 2: lactose 0.001 mM, lane 3: lactose 0.01 mM, lane 4: lactose 0.1 mM, lane 5: lactose 1 mM, lane 6: lactose 10 mM. (B) SDS-PAGE results were analyzed and digitalized by ImageJ program (Dark gray: IPTG and White: lactose).

본 연구에서는 재조합 E. coli를 이용하여 비만치료제로서 주목받고 있는 GLP-1 단백질을 대량생산하기 위한 연구를 수행하였다. 다양한 조건에 따른 단백질 발현 최적화를 수행하였으며, 또한 발현 균주에 따른 발현을 비교하였다. 최적화 결과 37°C, 12시간 그리고 IPTG 0.01 mM에서 가장 높은 GLP-1의 발현을 확인하였으며, 발현 균주로 E. coli BL21 (DE3)가 최적 균주로 선별되었다. Scale-up을 위해 발효기에서 교반속도를 달리하며 단백질 발현 최적화를 수행한 결과, 400 rpm의 조건에서 가장 높은 GLP-1 발현을 확인하였다. 발효기와 플라스크의 최적조건에서 GLP-1 발현을 비교한 결과, 발효기에서 GLP-1 단백질의 생산성이 플라스크에 비해 50.27% 증가하는 것을 확인하였다. 추가적으로 발현 유도물질을 IPTG에서 lactose로 대체한 결과, lactose 1 mM 조건에서 IPTG 0.01 mM의 결과에 비해 17.39% 증가한 GLP-1 발현을 확인할 수 있었다. 이를 통해 GLP-1 단백질 발현 최적 조건을 확인할 수 있었으며, 비만치료제로 주목받는 GLP-1 단백질의 대량생산에 적용될 수 있을 것으로 사료된다.

This research was financially supported by the Ministry of SMEs and Startups (MSS), Korea, under the “Regional Specialized Industry Development Program (R&D, S3261286)” supervised by the Korea Technology and Information Promotion Agency for SMEs (TIPA).

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