Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal

pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2023; 38(4): 212-216

Published online December 31, 2023 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2023.38.4.212

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

Deinococcus radiodurans R1을 이용한 Deinoxanthin의 생산

Production of Deinoxanthin Using Deinococcus radiodurans R1

Young Woo Shin1, Sun-Wook Jeong2, Younghun Cho1, Yong Jun Choi2, and Seung Hwan Lee1, *

1Department of Biotechnology & Bioengineering, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea
2School of Environmental Engineering, University of Seoul, Seoul 02504, Korea

Correspondence to:Tel: +82-62-530-1844, Fax:+82-62-530-1949
E-mail: leesh@chonnam.ac.kr

Received: November 1, 2023; Revised: November 17, 2023; Accepted: November 28, 2023

Xanthophyll carotenoids are pigments composed of terpene structures found in various organisms. They have attracted significant attention in the food, nutrition, pharmaceutical, and cosmetic industries due to their remarkable anti-bacterial, anti-inflammatory, and antioxidant activities. Among these, Deinoxanthin, produced by microorganisms of the Deinococcus genus, is known for its superior radical scavenging activity compared to well-known carotenoids like lutein, beta-carotene, and zeaxanthin, owing to its unique structural specificity. The aim of this study was to optimize carbon sources to establish efficient production platform for deinoxanthin using Deinococcus radiodurans. Glycerol proved to be the most effective carbon source for the synthesis of deinoxanthin among those that were examined. From optical density at 600 nm of 37.5 of D. radiodurans, more than 19.8 mg/L of deinoxanthin was produced. Furthermore, the viability of employing inexpensive carbon sources was tested using crude glycerol. A productivity of 20.2 mg/L of deinoxanthin was produced from the optical density at 600 nm of 37.5 of the cell after 72 hours of fermentation. These findings indicated that the D. radiodurans strain might be used to produce carotenoids in a cost-effective manner using cheap carbon source such as crude glycerol and be further employed in a wide range of biotechnological applications, such as food, nutrition, cosmetics, and pharmaceuticals.

Keywords: deinoxanthin, carotenoids, Deinococcus, extremophile, crude glycerol, production

자연에서 유래된 색소인 carotenoid는 8개의 isoprene units으로 만들어진 tetraterpenoid로서 동물, 식물, 곰팡이, 조류에서 박테리아까지 다양한 생물에서 발견되는 물질이다. 현재까지 lycopene, beta-carotene, lutein 등과 같이 750개 이상의 천연 carotenoid가 알려졌으며 노란색부터 빨간색까지 다양한 색을 띄는 색소뿐만 아니라, 생물 시스템에서 광손상이나 광산화와 같은 문제로부터 보호하고 엽록소에 약하게 흡수되는 빛에너지의 흡수를 증가시켜 광합성의 효율을 높이고 사람에게는 항산화 작용이나 다양한 질병의 예방에 유익한 효과를 주는 역할 등을 한다 [1-3].

Carotenoid는 크게 순수한 탄화수소인 carotene과 산소를 가지고 있는 xanthophyll로 분류되는데, xanthophyll은 산화 또는 수산화 된 carotene으로 산화된 부분은 대부분 β-ionyl 고리 위에 있으며 일반적으로 hydroxy, carboxy, carbonyl, epoxy group이다. 이러한 말단기들을 통해 xanthophyll은 carotene보다 더 좋은 라디칼 제거 능력을 보인다 [4,5,7]. 따라서, 항산화와 같은 자유 라디칼 제거와 질병의 예방과 억제 등의 효과를 보이기 때문에 건강과 관련하여 박테리아나 식물, 해양 박테리아, 해조류에서도 많은 연구들이 진행되고 있다 [6,7].

Deinococcus radiodurans는 방사선과 산화제와 같은 다양한 스트레스에 대한 높은 저항성을 보여주는 극한미생물이다. 특히, Deinococcus 속의 미생물은 빨간색, 주황색, 분홍색 등의 색깔을 띄는 carotenoid를 생산하는 경우가 많은데, 자외선이나 감마선, 산화와 같은 극한의 스트레스에서 높은 저항성을 가지는 특징으로 인하여, carotenoid와 방사선 저항의 연관성에 관한 연구들이 진행되었다 [8,9]. 그 중에서 D. radiodurans는 carotenoid의 생합성 경로가 잘 알려져 있고, carotenoid 합성에 필수적인 세포내 포도당-6-인산과 NADPH 의 농도가 높아 다양한 carotenoid를 생산하는 연구에 적용되고 있다 [10-13]. D. radiodurans가 생산하는 deinoxanthin (2,1′-Dihydroxy-3′,4′-didehydro-1′,2′-4dihydro-β,ψ-caroten-4-one)은 Deinococcus 속 미생물에서 생산되는 carotenoid로서 다른 xanthophyll에 비해 차별화된 특별한 구조로 이루어져 있다 (Fig. 1). 연장된 공액 이중 결합과 공액 keto-group, C-1’ hydroxyl group과 β-ring 말단의 추가적인 C-2 hydroxyl group의 존재로 우수한 항산화 활성이 기대되며, 활성산소종 제거 능력이 잘 알려진 carotene류의 lycopene이나 β-carotene, xanthophyll류의 zeaxanthin이나 lutein과 같은 물질보다 더 높은 활성산소종 제거능력을 보여준다 [5,9]. 현재까지 D. radiodurans 균주의 발효를 통하여 carotenoid를 대량 생산하고자 하는 연구가 지속적으로 진행되고 있으나, lycopene, phytoene 등과 같은 소수의 carotenoid의 결과만이 보고되어 있다 [12,17]. 본 연구에서는 우수한 특성을 지니고 있는 deinoxanthin의 대량생산을 위하여 D. radiodurans R1 균주의 다양한 배양조건을 탐색, 최적화하고자 한다. 또한, 얻어진 배양조건에서 저가형 탄소원인 crude glycerol을 기질로 이용하여 배양을 수행하고, 경제적인 deinoxanthin의 생산 가능성을 타진해 보고자 한다.

Figure 1. Structure of deinoxanthin.

2.1. 균주 및 배양 배지

이 연구에서는 Deinococcus radiodurans R1 (ATCC13939) 균주와 TGY 배지(tryptone 5 g/L, yeast extract 3 g/L, glucose 1 g/L)를 이용하여 배양을 수행하였다. 플라스크 배양과 발효기 배양은 탄소원이 추가된 변형된 TGY 배지 (tryptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L, MnCl2 1 mg/L)를 활용하였다.

2.2. Deinoxanthin 생산을 위한 플라스크 배양

D. radiodurans는 5 mL의 TGY 배지에 접종하여 OD600가 3.1~3.3 사이가 되도록 30oC, 200 rpm 조건으로 24시간 배양한다. 이 배양 용액 1 mL를 변형된 TGY 배지 50 mL가 들어 있는 250 mL 플라스크에 접종한 후, 30oC, 200 rpm에서 24시간, 37oC, 200 rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 탄소원이 세포 성장과 deinoxanthin 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 10, 20 ,50 g/L의 glucose, sucrose, glycerol를 탄소원으로 추가하여 배양하였다.

2.3. Deinoxanthin 생산을 위한 회분식 발효

회분식 발효기 배양을 위한 전배양은 변형된 TGY 배지 50 mL가 들어있는 250 mL 플라스크에 배양 용액 1 mL를 접종하고 30oC, 200 rpm에서 24시간동안 배양하였다. 회분식 발효기 배양은 2.5 L 발효기에 (BioCNS, Daejeon, Korea) 탄소원이 포함된 변형된 TGY배지 1 L를 working volume으로 배양하였다. 전배양 용액의 접종 부피는 5% (v/v)로 접종하였고 pH는 7.0~7.2사이로 2M HCl과 14% (v/v) NH4OH를 사용하여 유지하였다. 배지의 용존 산소 수준은 공기를 2 L/min로 공급하고 교반 속도를 용존 산소량에 따라 증가하도록 설정하여 포화상태의 40% (v/v)로 조절하였다. Deinoxanthin 추출을 위해 일정 시간마다 5 mL의 배양액을 원심분리기를 사용하여 원심 분리한 후 탈 이온수로 2회 세척해 보관하였다.

2.4. 분석 방법

세포 성장은 분광광도계(Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 600 nm에서 흡광도(OD600)를 측정하여 모니터링하였으며, Deinoxanthin의 추출은 10 mg내외의 동결건조된 세포에 1 mL의 메탄올을 넣어 세포를 재현탁한 뒤 초음파 파쇄기 (Branson Ultrasonics, CN, USA)를 사용하여 30초간 2번씩 처리하였다. 원심분리를 통하여 얻어진 상등액에 1 mL의 메탄올을 추가하고, 동일한 초음파 처리를 한 번 더 수행한 후 얻어진 2 mL의 메탄올을 4000 rpm으로 20분간 원심 분리한 후 얻어진 상등액을 0.45 μm PTFE (Polytetrafluoroethylene) 필터를 이용하여 필터링 한 후 HPLC 분석에 사용하였다.

Deinoxanthin분석은 ZORBAX SB-C18 column (250 × 4.6 mm) (Agilent Technologies Inc., CA, USA)와 UV detector가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 (Agilent 1200 series HPLC)를 사용하여 480 nm에서 분석하였다. 40oC에서 0.8 mL/min의 유속으로 이동상으로 아세톤, 아세토나이트릴, 아이소프로판올 (50 : 40 : 10, v/v/v) 혼합용매를 사용하였다. 배양배지의 탄소원 농도는 Aminex HPX-87H column (300 × 7.8 mm) (Bio-Rad, CA, USA)과 refractive index detector가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 (Agilent 1200 series HPLC)를 이용하여 분석하였다. 50oC에서 0.5 mL/min의 유속으로 0.005 M H2SO4를 이동상으로 사용하였다.

2.5. Crude glycerol 전처리

폐식용유 유래의 biodiesel의 부산물인 crude glycerol을 전처리 하기 위하여 같은 부피의 탈 이온수를 넣어 희석을 한 뒤 활성탄 3% (w/v)를 첨가하였다. 활성탄의 흡착을 위한 온도는 80oC로 하였으며 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 HCl을 첨가하여 pH를 7.0으로 맞춘 이후 10000 rpm으로 30 분간 원심분리 한 후, 상등액을 0.45 μm PTFE 필터를 사용하여 여과하여 얻어진 전처리된 crude glycerol을 탄소원으로 사용하였다.

3.1. Deinoxanthin 생산을 위한 플라스크 배양조건별 영향 확인

Deinoxanthin 생산과 세포성장에 탄소원이 미치는 영향을 알아보기 위해서 glucose, sucrose, glycerol 3가지의 탄소원을 추가하여 배양을 진행하였다. Glucose와 sucrose는 이전 연구에서 deinoxanthin 생산에 좋은 결과를 보여주었으며, glycerol은 환원력이 다량 요구되는 대사산물 생산에서 좋은 기질로 알려져 있어 탄소원으로 선택되었다 [15,16]. 각각의 기질을 사용하였을 때, 얻어진 세포성장과 deinoxanthin의 농도를 Fig. 2에 나타내었다.

Figure 2. Optical density at 600 nm (black) and deinoxanthin concentration (grey) after flask cultivation of D. radiodurans in modified TGY medium supplemented with glucose (A), sucrose (B) and glycerol (C).

세 가지 탄소원을 비교하였을 때, 세 탄소원 모두 20 g/L을 첨가했을때, 가장 높은 세포성장을 보였으며 glycerol의 경우 가장 높은 29.37의 OD값을 나타내었다. Deinoxanthin 생산은 glucose와 sucrose는 10 g/L, glycerol은 20 g/L의 탄소원이 추가되었을 때, 가장 많은 deinoxanthin생산을 보였으며, 10g/L의 sucrose를 탄소원으로 활용한 경우 가장 높은 농도인 10.51 mg/L를 관찰할 수 있었다. 세포 당 deinoxanthin 생산의 경우 10 g/L의 glucose를 탄소원으로 활용한 경우 가장 높은 1.91 mg deinoxanthin/ g dry cell 의 값을 나타내었다.

Carotenoid의 생합성은 세포성장과 밀접한 관련이 있으며, 특히 deinoxanthin의 전구체인 lycopene과 pinene의 생합성에서 glycerol을 탄소원으로 사용할 경우 carotenoid의 생산을 높여준다는 바가 알려져 있다 [14,17]. 따라서, 가장 높은 OD값과 carotenoid 과량 생산 가능성이 높은 glycerol 20 g/L를 생산을 위한 탄소원의 조건으로 선정하고 추후 실험을 진행하였다.

3.2. Deinoxanthin 생산을 위한 회분식 발효 배양

위의 실험결과를 토대로 glycerol 20 g/L를 탄소원으로 추가하고 회분식 발효를 진행하였다. 발효는 변형된 TGY 배지 1L에 glycerol을 20 g/L가 되도록 추가하여 실험을 진행하였다. 발효가 진행됨에 따라 42시간까지 OD600가 꾸준히 증가하였고, 배양 후 45시간이 지났을 때, glycerol이 모두 소모되었으며, 그 이후 세포의 농도가 급격히 감소하였다. 발효 진행 중 OD600는 탄소원이 고갈되기 직전인 42시간에서 최대인 37.5를 나타내었다. Deinoxanthin의 생산은 배양 32시간까지 증가하다가 glycerol을 급격하게 소모하기 시작하면서 더 이상 증가하지 않는 결과를 보였다. 최대 deinoxanthin 농도는 19.8 mg/L였다. 이는 플라스크 배양과 비교하였을 때 세포성장은 27.6%가 증가하는데 그쳤지만, deinoxanthin의 생산은 2배 이상 증가하였다.

3.3. Crude glycerol을 이용한 deinoxanthin 생산

전처리를 수행하지 않은 crude glycerol을 탄소원으로 추가하여 배양을 진행하였을 때, D. radiodurans 균주의 성장이 거의 일어나지 않았으므로, 활성탄을 이용하여 crude glycerol의 전처리를 수행하였다. 전처리를 수행한 후 얻어진 crude glycerol의 순도는 34.9% (wt/wt)였다. 전처리 후 얻어진 crude glycerol을 5, 10, 20 g/L를 추가하고 플라스크 배양을 수행하였다 (Fig. 4). 72시간 배양 후 OD600는 각각 14.0, 18.2, 14.0으로 나타났다. 특히 20 g/L의 crude glycerol이 첨가된 경우 24시간 동안 세포의 성장이 이루어지지 않아, 전처리를 하였음에도 불구하고, crude glycerol에 의하여 생장저해가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 72시간후의 Deinoxanthin의 농도는 각각 12.0, 15.7, 8.6 mg/L로 나타났다. 낮은 농도 (5, 10 g/L)의 crude glycerol이 첨가된 경우 시약급의 glycerol이나 glucose, sucrose 등과 같은 다른 탄소원을 사용하였을 때와 비교하여 세포의 생장은 다소 낮으나 carotenoid의 생산은 높은 값을 보여주어, g dry cell 당 deinoxanthin의 생산의 경우 다른 탄소원의 경우 보다 훨씬 높은 값을 보였다. 20 g/L의 crude glycerol이 첨가된 경우, 세포의 생장이 다른 탄소원을 활용한 경우의 30%에 지나지 않았으며, deinoxanthin 생산도 다소 낮은 값을 보였다. 그러나, 이는 초기 생장저해로 인한 것으로 보이며, 72시간에 15.5 g/L의 glycerol이 소모되지 않고 남아 있어 발효 수행 시 더 좋은 결과를 가져올 것이라고 예상되어, 변형된 TGY 배지와 20 g/L의 crude glycerol을 탄소원을 추가하여 회분식 발효기로 배양을 수행하였다 (Fig. 5). 12시간까지 세포의 성장이 미미한 것으로 미루어 플라스크 배양에서 보이는 결과와 유사하게 배양초기 lag phase가 길어지는 것을 확인할 수 있으며, 그 이후 세포성장과 탄소원의 소모가 천천히 진행되는 것을 확인하였다. Crude glycerol이 소모되며 천천히 세포가 성장하다 48시간이후에도 계속 성장하여 crude glycerol이 다 소모될 때까지 성장하였다. 69시간에 crude glycerol이 완전히 소모된 후 세포 성장이 멈추는 것을 확인하였다. 배양 중 가장 높은 OD600값은 28.2였으며 가장 높은 deinoxanthin 생산량은 20.2 mg/L였다. 시약급의 glycerol을 탄소원으로 추가한 경우와 비교하였을 때 최대 OD600값은 약 75%로 낮지만 deinoxanthin 생산량은 102%로 다소 높은 것을 확인할 수 있었다.

Figure 4. Time profiles of glycerol concentration (▲) and optical density at 600 nm (●) during flask cultivation of D. radiodurans in modified TGY medium supplemented with 5 g/L (A), 10 g/L (B) and 20 g/L (C) of crude glycerol. Final concentration of deinoxanthin (D) after 72h flask cultivation.

Figure 5. Time profiles of glycerol concentration (▲), deinoxanthin concentration (■) and optical density at 600 nm (●) during batch cultivation of D. radiodurans in modified TGY medium supplemented with 20 g/L of crude glycerol.

본 연구에서는 D. radiodurans R1을 사용하여 항산화성이 뛰어난 deinoxanthin의 생산성을 높이고자 다양한 초기 조건에서 배양하였다. Glucose, sucrose, glycerol의 3종의 탄소원을 다양한 농도로 TGY 배지에 추가하여, deinoxanthin 생합성에 미치는 영향을 확인하고, 생산된 deinoxanthin 농도 비교를 통하여 발효에 적절한 탄소원과 초기 농도를 선별하였다. 20 g/L의 glycerol을 초기 탄소원으로 첨가하여 배양하였을 때, 가장 높은 deinoxanthin 생산성을 확인할 수 있었다. 또한, 경제적인 생산을 위하여 저가형 탄소원인 crude glycerol을 기질로 사용하여 deinoxanthin생산 가능성을 타진하였다. 전처리가 되지 않은 crude glycerol을 탄소원으로 첨가한 경우 세포가 성장하지 않았으나, 활성탄을 이용한 간단한 전처리 후 crude glycerol을 기질로 사용할 수 있음을 확인하였으며, 플라스크 배양을 통하여 얻었던 배양조건으로 회분식 배양을 수행하였을 때, 69시간 배양 후 20.2 mg/L의 deinoxanthin이 생산되었다. 본 연구 결과를 통하여 전처리된 crude glycerol이 D. radiodurans 균주의 다양한 대사산물의 생산에 유용한 탄소원으로 활용될 수 있을 것이며, 추후 탄소원 이외의 다른 배지성분의 최적화와 유가식 배양과 같은 배양 전략의 추가적인 연구를 통하여 D. radiodurans 균주를 활용한 deinoxanthin등의 carotenoid의 생산증대가 가능할 것으로 기대된다.

Figure 3. Time profiles of glycerol concentration (▲), deinoxanthin concentration (■) and optical density at 600 nm (●) in modified TGY medium after 72h flask cultivation.

이 연구는 환경부의 재원으로 국립낙동강생물자원관에서 지원을 받아 수행된 연구입니다 (NNIBR202303113).

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