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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2023; 38(4): 225-235

Published online December 31, 2023 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2023.38.4.225

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

해조류의 종보존에서의 생존율 향상을 위한 해동공정의 열역학적 특성

Thermodynamic Properties in the Process of Thawing for Cryopreservation of Algae

Min Yong Kim1, Young Woo Shin1*, Young Bok Lee1, Jong Ahm Shin2, and Jong Deog Kim3

1Department of Refrigerating & Air Conditioning Engineering, Chonnam National University,Yeosu 59626, Korea
2Underwater Ecology Institute, Yeosu 59769, Korea
3Department of Biotechnology, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea

Correspondence to:Tel:+82-61-659-7275, Fax: +82-61-659-7279
E-mail: shin5381@jnu.ac.kr

Received: November 17, 2023; Revised: December 22, 2023; Accepted: December 30, 2023

To achieve a high viability by minimizing thawing damage, ice crystallization must be reduced in the process of thawing. Thermophysical properties of suspensions of Porphyra seriata, Undaria pinnatifida, and Sargassum fulvellum were measured to determine the optimal thawing conditions in the thawing process for species conservation of sea algae. The range of final thawing temperature was –2.49 ~ –0.50°C at thawing speed 1.25°C/min and 2~3°C at 1.5~2.0°C/min, and thawing was completed at temperatures above 3.0°C, enabling the removal process of cryoprotectant. The optimum thawing speed with the minimum thawing time was 0.75~1.0°C/min, and the latent heat of thawing was Undaria pinnatifida 128.37 J/g, Porphyra seriata 118.53 J/g, and Sargassum fulvellum 94.42 J/g, which can be useful for the design and manufacture of algae cryopreservation system. From the change of enthalpy, entropy and free energy according to each thawing rate, the optimum thawing rate for recrystallization temperature pan and viability improvement is suitable over Porphyra seriata, Sargassum fulvellum, Undaria pinnatifida 0.75°C/min, 1.0°C/min, 1.5°C/min respectively. From the results of the thawing process, the optimal method of freezing-thawing process of seedlings for aquaculture will be set up to increase the viability and contribute to the aquaculture industry by being used for growth in the farm. In addition, the results of this study will contribute to the establishment of gene bank, seed bank, and seed vault for various kinds of sea algae.

Keywords: cryopreservation, viability, thermophysical properties, thawing rate, algae

해조류는 항암, 항종양성, 성인병에 대한 기능성 물질로 활용되며 [1-6], 식품 분야에서는 음료 및 제과용 식품소재, 겔화 및 유화용 식품첨가물, 육류 및 생선, 유제품의 방부제로 사용된다. 유용미생물의 활성화를 이용하여 비료, 가축 및 어·패류의 사료 제조에 이용되고 있으며, 종이 코팅, 접착제, 염료, 젤 등의 산업용 제품과 치약, 화장품, 구취제 등의 생활용품의 원료로 그 활용 범위가 다양하고, 생물환경의 보존 및 회복을 위한 CO2 제거 및 바이오메탄 생산 등의 소재물질로서도 그 가치와 유용성이 증대되고 있다 [7-14].

해조류를 이용한 바이오 에너지에 대한 연구로는 지구 온난화와 기후 변화에 대응하는 해양 대형 조류인 Sargassum horneri 로부터 바이오 에너지의 생산 [15], 해조류 바이오매스로부터 바이오 당 생산 [16], 해조류 우뭇가사리(Gelidium amansii)의 분리당화발효를 이용한 바이오 에탄올 생산에 관한 연구 [17] 등이 있다.

해조류에 대한 품질성, 보존성, 유전적 안정성을 높이기 위하여 장기간 안정적인 생산 및 종묘의 보존성이 높은 것으로 보고된 액체질소 동결보존법이 널리 이용되어 왔다 [18-20].

해조류의 동결 보존은 액체 질소의 증발잠열을 이용하여 생성된 저온 (−80 ~ −196°C ) 환경에서 조직, 세포 및 생물학적 물질의 장기 보존하는 방법인 액체질소동결법을 사용하며, 급속동결에 의한 빙결정의 영향을 최소화 함으로써 생존율을 높이기 사용되며, 동결 보존된 세포 또는 조직은 해동 후에도 정상적인 구조와 기능을 유지함으로서 임상 적용 및 연구를 비롯한 산업적 이용이 가능하다.

액체질소 동결보존법을 이용한 연구에는 미세조류와 고등식물에 대한 연구 [18,19], 육상 식물의 배양 세포의 동결보존법을 모델로 해조류의 동결보존에 관한 연구 [23-28] 특히 해조류에 관한 연구 중 대황 배우체를 이용한 다시마 속 (Laminariales) 연구는 실용적 성과를 보였으며 [29], 김 속 (Porphyra) algae에 대한 동해방지제를 이용한 2단계 동결보존법의 연구를 통하여 최적 동결조건을 제시하고, 해조류 종에 따른 동해방지제의 종류 및 효과, 선택의 중요성이 발표되었다 [30-33]. 또한 지금까지 각종 생물의 동결보존에서 이용되고 있는 11종류의 동해방지제에 대하여 해조류 종묘 Porphyra seriata, Undaria pinatifda, Sargasum fulvelum 에 대한 동결보존 효과를 실험하여 효과가 높은 동해방지제 및 최적 비율로서 50% 해수에 10% DMSO와 0.5 Msorbitol을 첨가하여 조제하였다고 보고하였다 [34]. 세포 동결 보존에 의한 손상은 동결 및 해동의 2단계 공정이 진행되는 동안에 중간 온도인 –15°C ~ −40°C에서 가장 크게 나타나며, 세포의 동결 및 해동속도에 변화에 따라 저온장해, 유리화, 치명적인 세포내의 빙결정 형성, cryoprotective agents (CPA)의 첨가 및 제거에 의한 삼투압 변화로 세포 손상에 의한 생존율에 영향을 미치게 된다 [36]. 그러므로 해조류 종묘의 동결보존에서 생존율 향상을 위해서는 최적의 해동속도 범위가 규명되어야 한다 [37]. 그러나 동식물의 동결종보존 연구는 많으나, 해조류 종묘의 종보존을 위한 동결 및 해동공정의 연구는 많지 않으며, 특히 열물성과 생존율의 상관성, 생존율 향상을 위한 최적 해동 조건에 대한 연구는 중요하나, 동결보존에 의한 생존율을 높이기 위해서는 생물 종의 종류에 따른 동결 및 해동속도의 적절한 조합이 이루어져야 한다.

그러므로, 본 연구에서는 해조류의 종 보존을 위한 해동공정에서의 최적조건의 확립을 위하여 모무늬돌김 (Porphyra seriata), 미역 (Undaria pinatifda), 모자반 (Sargasum fulvelum) 의 1차 동결에 의하여 형성된 빙결정의 해동 과정을 저온현미경으로 관찰하고, 시차주사열량계 (DSC: Differential Scanning Carolimetry) 로 해동속도 0.1 ~ 2.0°C/min에서 측정한 흡열곡선으로부터 해동 개시온도 및 종료온도, 해동잠열을 측정하고, Kinetics 프로그램을 이용하여 해동속도 상수, 활성화에너지, 엔탈피, 엔트로피를 구함으로써 상관성으로부터 재결정화로 인한 생존율이 감소하는 해동속도 범위 및 해동 온도를 규명함으로써 생존율을 높이고, 측정된 열물성치는 해조류 종보존 장치의 설계 및 제작에 필요한 기초 자료로 제공하는 것을 목적으로 하였다.

해조류의 최적 동결보존을 위한 해동 공정에서의 엔트로피 변화로부터 재결정화온도의 해동속도 의존성으로부터 생존율 저하의 요인인 재결정화가 진행되는 해동속도를 규명하였다. 향후 해조류의 동결보존에서 최적의 해동속도를 이용함으로써 생존율의 향상에 활용 가능하리라 생각된다.

2.1. 실험 재료

모무늬 돌김 유리사상체 Porphyra seriata는 전라남도 해양바이오산업연구원 종보존연구실에서 계대 배양하여 이용하였으며, 계대 배양은 20°C, 14시간 명기 (60 μEm-2s-1 ; 백색형광등)·10시간 암기의 광주기하에서 PES배지를 사용하여 배양하고 [35] 세단하여 사용하였다.

모자반 유배 Sargassum fulvellum은 전라남도 진도군 임회면 상만리 해안에서 채취한 모조에서 방출시킨 유배를 이용하였으며, 미역 유배 Undaria pinnatifida (Harvey)는 일본 나가사키대학의 종보존 연구실에서 보관중인 것을 사용하였다. 이들 균주는 PESI 배지[38]에서 각각 Sargassum fulvellum 17°C, Undaria pinnatifida 22°C에서 배양한 후 백색 형광램프로 14L : 10D (14시간 명기 : 10시간 암기) 15 μEm-2s-1 처리하였다.

동해방지제는 해수 (32‰)에 최종농도의 목표치 (5 ~ 15%)의 2배가 되게 혼합하여 만든 용액과 동량의 배우체 현탁액을 혼합하여 제조하였다.

2.2. 동해방지제

발표된 [33,35] 선행 연구 결과 현재 각종 생물의 동결보존에 사용하고 있는 동해방지제인 DMSO, glycerol (C3H8O3), ethylene glycol (HOCH2CH2OH), glycerol, proline, betaine·HCl, skimmed milk, sucrose, glucose (C6H12O6), sorbitol (C6H14O6), 및 mannitol (C6H14O6)에 대한 Porphyra seriata, Undaria pinatifda, Sargasum fulvelum에 대한 동결보존 효과는 DMSO와 sorbitol을 사용한 경우에 높게 나타났으며, 기본액으로서 최적의 비율은 50% 해수에 10% DMSO와 0.5 M sorbitol을 첨가하여 조제하였다고 보고하였다. 본 연구에서도 발표한 비율로 혼합현탁액을 제조하여 실험을 하였다.

발표된 최적의 동해방지제의 조성성분은 동결생존율은 동결방지제의 유형 및 농도와 높은 상관관계를 가지며, 미세조류 16속을 냉각속도 1°C/min, 1차 동결온도 –40°C로 냉동보존한 균주의 생존은 글리세롤이나 메탄올보다 DMSO를 사용한 경우 높은 생존율을 보였다 [40]. DMSO는 세포 침투력이 빠르나, 농도의 증가에 따른 세포 독성으로 인하여 [40], 최적의 농도는 10%(v/v) 미만이며, 10% 이상에서는 세포 성장 저해 현상이 일어난다 [41].

2.3. 동결보존액 처리 동결 및 해동용 시료

Porphyra seriata, Undaria pinatifda, Sargasum fulvelum의 기본액은 50% 해수에 10% DMSO 와 0.5 M sorbitol을 첨가하여 조제하였다. 동결보존액 처리는 2mL 바이알에 해수 0.75 mL를 넣은 후 사상체 1 mg을 넣고, 기본액 (2배) 0.75mL를 15분에 걸쳐 시료가 세포내의 수분과 치환하여 현탁액을 제조하였다. DSC의 sample pan에 현탁액 10 mg을 DSC의 시료 팬 키트에 채우고 압착 밀봉한 뒤 보고된 최적 동결속도 1.0°C/min[33]로 1단계 동결온도 –40°C까지 동결 후 2단계로 –70°C에서 동결보존하였다.

2.4. 시차주사열량계에 의한 열물성 측정

동해방지제을 첨가한 사상체의 초저온동결보존 후에 해동공정에서의 열역학적 최적 조건을 결정하기 위하여 시차주사열량계 (Seiko Instruments Inc. DSC 220C, Chiba, Japan) 로 흡열반응곡선을 측정하였다. 동결은 2단계 동결보존법에 의하여 동결보존 된 시료용 팬 키트를 드라이 아이스 용기를 이용하여 DSC 시료실로 옮겨 넣은 후 해동속도 0.1 ~ 2.0°C/min로 흡열반응곡선을 측정하였다. 흡열반응곡선으로부터 partial kinetics program을 이용하여 열물성치를 측정하고 사상체 간의 열특성을 비교, 해동 공정의 최적 조건을 결정하였다. 시차주사열량계의 온도 보정용 표준시료로서 Indium (156.6°C)과 Tin (232.0°C) 및 mercury (−38.87°C)의 각각의 용융점을 측정하여 편차로써 보정하였다. 시차주사열량계 의 밀폐형 Al팬의 내부에 시료를 주입하고 압착 밀봉하여 우측 chamber에 넣고 좌측 chamber에 reference로서 시료를 넣지 않은 Al팬을 압착하여 밀봉하였다. 시료팬과 비어 있는 팬의 해동에 의한 2개의 흡열반응곡선을 측정하여 비어 있는 Al팬의 흡열반응곡선을 상쇄하여 시료의 흡열반응곡선을 구하였다. DSC의 냉각제로는 액체질소를 사용하고, 측정값은 동일 시료에 대하여 각각 3번씩 반복 실험하여 평균치를 구하였다.

2.5. 현탁액의 해동

동결보존된 현탁액을 해동속도 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0°C/min로 해동시켜 측정한 흡열반응곡선으로부터 해동시작온도(흡열반응개시온도), 해동종료온도, 흡열반응최대온도, 해동 잠열을 구하였다.

2.6. 해조류 현탁액의 해동 Kinetics

DSC로 측정한 해동 공정에서의 흡열반응곡선에서 흡열반응개시온도(T0)와 종료온도(Tc)구간을 partial area kinetics 프로그램으로 등온법으로 면적을 10등분하여 흡열반응곡선의 전체면적(A)에 대한 흡열반응이 진행된 부분면적(a)의 비율(%)과 열유속(dH/dt) 및 해동속도(Vc)로부터 (1)식을 이용하여 해동속도상수 (kc)를 구하였다.

또한 (1)식으로 구한 해동속도상수(kc)로부터 활성화 에너지, 엔탈피, 엔트로피, 자유에너지를 계산하여 비교하므로써 최적의 해동조건을 결정하였다.

kc=Vc(dH/dt)Aa
lnkc=lnCEaRT
ΔH=EaRT=TΔS+ΔF
ΔF=RTlnbTKh

시차주사열량계의 흡열곡선에서 기준선과 peak사이의 면적은 해동잠열(mJ/mg)을 나타내며, 활성화에너지(Ea)는 해동시작온도에서 해동 종료온도사이의 각 온도에서의 해동이 진행되기 위해서 필요로 하는 최소의 열량을 파악할 수 있는 지표로써 해동반응속도의 대수로그 값 (ln kc)을 y축, 절대온도의 역수 (1/T)를 x축으로 하여 구한 기울기로부터 (2)식에 의하여 계산하였다.

2.7. 해동과정의 저온현미경 관찰

해동과정에서의 해동특성을 저온현미경 (Olympus U-Pot, camera : Coolpix MDC Lens and Olympus 2E 26867, cooling system : Lin Kam Co . LK 600PMS)으로 최대 40배의 배율로 해동속도 0.1~2.0°C/min에서 동결보존 현탁액의 해동과정을 관찰하였다.

3.1. 동해방지제 처리 사상체의 동결보존 후 해동

해양 미세 조류Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae)의 동결보존에 관하여 Morris [42]의 250종의 Chlorococcales균주와 12종의 해양 녹조류 균주 배양물의 동결보존 연구에 의하면 –1°C/min로 완만 냉각한 후 –70°C까지 액체 질소 저장하였다. Morris [42]와 Day et al. [43]는 2단계 동결 전에 클로렐라 및 기타 녹조류를 –30°C로 천천히 냉각하였으나 본 연구에서는 저온 현미경 관찰에 의하면 –35°C이하에서는 빙결정의 형성이 완료되어 현미경 관찰이 불가능하고 사상체와 보존액의 구별이 되지 않는 동결 상태가 유지되는 것으로 보고하였다 [31]. –35°C이하의 온도로 액체질소에 침지시켜 보존된 해조류는 특성 변화가 거의 없으므로 –35°C이상의 온도에서 상변화가 진행되었다.

동해방지제를 이용한 경우의 Porphyra seriata 동결 후 해동속도 1°C/min로 해동하면서 관찰한 각 온도에서의 빙결정의 형상 및 소멸, 사상체의 조직의 해동상태는 Fig. 4와 같다.

Figure 4. Thawing process of Porghyra seriata in sea water at thawing rate 1°C/min. (a) −30°C, frozen state, (b) −20°C, thawing onset, (c) −10°C, thawing process, (d) −5°C, previous state of thawing completed, (e) 0°C, thawing ceased (1), (f) 10°C, thawing ceased (2).

1차 동결과정에서 측정한 동결종료온도의 범위는 Porphyra seriata –20.5 ~ –30.5°C, Undaria pinnatifida –18.1 ~ –27.8°C, Sargassum fulvellum –17.0 ~ –27.1°C 였으며, 동결진행시간이 최소가 되는 최적냉각속도를 1.0 ~ 1.5°C/min로 나타났다. 최적냉각속도 1.0 ~ 1.5°C/min는 Gao 등 [36]에 의하면 발표에 의하면 해양 조류와 다소 품종의 차이는 있으나, 미세조류류 N. oculata의 생존율은 1°C/min의 냉각 속도에서 가장 관찰이 양호하였다는 결과와 일치한다 [44].

DSC를 이용하여 측정한 Porphyra seriata의 해동개시온도는 해동속도가 클수록 낮은 온도에서 시작되며, Porphyra seriata는 해동속도 0.1 ~ 1.5°C/min 범위에서는 –19.8 ~ –22.4°C, 1.75 ~ 2.0°C/min의 범위에서는 –27.2°C에서 해동이 시작되었다. 해동종료온도는 해동속도 1.25°C/min까지는 –2.49 ~ –0.50°C, 1.5 ~ 2.0°C/min에서는 2 ~ 3°C로 나타났다.

저온현미경으로 해동속도 1°C/min에서 Porphyra seriata를 관찰한 결과 –30°C에서는 동해방지제 부분과 사상체 부분이 뚜렷하게 구분되었으나 –20°C에서는 사상체 주위의 경계면이 불투명하고 빙결정이 융해되어 부풀어 오른 형상을 보이며, –10°C에서는 동해방지제가 존재하는 부분과 사상체의 경계면이 구분되며, –5°C에서는 사상체의 형상은 보이나 완전한 해동상태는 아니며, 0°C에서 해동이 완료되어 10°C의 형상과 차이를 보이지 않았다. DSC로 측정한 Porphyra seriata의 해동속도 1°C/min에서의 흡열반응곡선으로부터 해동개시온도는 –19.8 ~ –22.4°C, 해동종료온도는 –2.49 ~ –0.50°C로서 저온현미경 관찰 결과와 일치하였다.

3.2. 동결보존액을 사용한 해조류 사상체의 해동 특성

Porphyra seriata, Undaria pinnatifida, Sargassum fulvellum의 해동공정에서 해동속도 0.1 ~ 2.0°C/min로 흡열 반응곡선을 측정하여 해동개시온도, 최대발열반응온도, 해동종료온도를 구하였으며, 결과는 Fig. 5 ~ Fig. 7와 같다.

Figure 5. Endothermic temperature of Porphyra seriata.

Figure 6. Endothermic temperature of Undaria pinnatifida.

Figure 7. Endothermic temperature of Sargassum fulvellum.

3.2.1. 해동개시온도 및 최대발열반응온도

해동속도가 클수록 낮은 온도에서 해동이 시작되며, 해동개시온도는 Porphyra seriata에서 해동속도 0.1 ~ 1.25°C/min에서 –19.8 ~ –22.4°C, 1.5 ~ 2.0°C/min에서 –27.2°C로 나타났다. Undaria pinnatifida는 해동속도 0.1 ~ 0.75°C/min에서 –18.6 ~ –20.4°C, 1.0 ~ 2.0°C/min에서 –25.1 ~ –27.1°C였다. Sargassum fulvellum은 해동속도 0.1 ~ 1.0°C/min에서 –20.4 ~ –21.2°C, 1.0 ~ 2.0°C/min에서 –25.8 ~ –26.5°C에서 해동이 시작되었다.

해동공정에서의 흡열 열유속(dH/dt)가 최대가 되는 흡열반응 최대온도는 Porphyra seriata –4.0 ~ 5.9°C, Undaria pinnatifida는 –5.5 ~ 7.0°C, Sargassum fulvellum –5.9 ~ 8.1°C로서 Porphyra seriata > Undaria pinnatifida > Sargassum fulvellum의 순으로 흡열반응 최대온도가 높게 나타났다.

발표된 [34] 1차 동결과정에서의 동결종료온도의 범위는 Porphyra seriata –20.5 ~ –30.5°C, Undaria pinnatifida –18.1 ~ –27.8°C, Sargassum fulvellum –17.0 ~ –27.1°C 로서, 동결진행시간이 최소가 되는 최적 냉각속도를 1.0 ~ 1.5°C/min로 보고하였다. 동결공정에서의 동결종료온도와 해동공정에서의 해동개시온도가 같아지는 것이 바람직하며, 본 연구에서는 해동속도 1.5°C/min에서 0.6 ~ 0.7°C의 적은 편차로 거의 일치하였다.

동결종료온도와 최대흡열반응온도의 차이는 해동속도 1.0 ~ 1.5°C/min에서 Porphyra seriata –30.5°C, –27.3°C, Undaria pinnatifida –27.8°C, –27.1°C, Sargassum fulvellum –27.1°C, –26.5°C로서 Undaria pinnatifidaSargassum fulvellum는 거의 동일하였으며, Porphyra seriata는 3.2°C정도의 편차를 보였다.

동결공정에서는 동결속도 커지면 과냉각이 커지나, 해동에서는 1차 동결완료온도와 유사한 온도 범위에서 해동이 시작되므로 동결과정에서의 과냉각과 유사한 해동과정에서의 과열 현상은 없으나, Porphyra seriata는 낮은 해동속도에서 3.2°C정도의 편차를 보이고 있으므로 해동속도를 1.75°C/min 이상으로 높여서 해동하는 것이 과열에 의한 사멸율을 줄일 수 있다.

3.2.2. 해동 종료 온도

해동종료온도는 해동속도가 클수록 높아지며, 해조류의 해동종료온도는 각각 Porphyra seriata는 해동속도 0.1 ~ 1.25°C/min에서 –2.0 ~ 0.1°C, 1.5 ~ 2.0°C/min에서 2.5 ~ 4.5°C, Undaria pinnatifida는 해동속도 0.1 ~ 1.0°C/min에서 –3.0 ~ –2.6°C, 1.25 ~ 2.0°C/min에서 1.0 ~ 3.5°C, Sargassum fulvellum 는 해동속도 0.1 ~ 1.0°C/min에서 –4.1 ~ –2.1°C, 1.25 ~ 2.0°C/min에서 –1.1 ~ 1.6°C였다.

본 연구의 해동공정에서 사상체 현탁액의 해동종료온도 (ceased point)가 순간적으로 높아지는 지점의 해동속도 및 해동종료온도는 Porphyra seriata, 1.5°C/min에서 3°C, Undaria pinnatifida, 1.25°C/min에서 2°C, Sargassum fulvellum, 1.25°C/min에서 2°C로 나타났다. Gwo 등 [44]은 동결보존한 미세조류튜브 속의 빙결정이 녹을 때까지(~25분 동안) 3°C 수조에서 완만 해동하였다. DSC로 측정한 해동종료온도 2~3°C와 Gwo 등의 해동용 수조 온도 3°C는 거의 일치하였다. 본 연구에서 최적의 해동속도는 1.25~1.5°C/min, 최종온도는 2 ~ 3°C였다.

3.3. 해동 시간

Fig. 8.~Fig. 10에서 해동 공정의 해동개시온도와 종료온도와 의 편차 (temperature difference)인 해동진행온도 범위는 동결진행온도와 동일하게 해동 속도가 클수록 넓은 온도범위에 걸쳐 해동이 진행되며, 상대적으로 해동진행온도 범위가 작은 해동속도는 Porphyra seriata 0.2 ~ 0.75°C/min, Undaria pinnatifida 0.2 ~ 0.75°C/min, Sargassum fulvellum 0.1 ~ 1.0°C/min로 나타났다.

Figure 8. Thawing time and endothermic temperature of Porphyra seriata.

Figure 10. Thawing time and endothermic temperature of Sargassum fulvellum.

해동시간은 Porphyra seriata, Undaria pinnatifida, Sargassum fulvellum 모두 해동속도 0.5°C/min에서 가장 길고, 해동속도가 증가할수록 단축되었다. 위의 결과로부터 종보존을 위한 해동공정에서 생존율을 높이기 위해서는 동결진행시간이 짧고, 해동진행온도의 범위가 작은 0.75 ~ 1.0°C/min로 하는 것이 적합하다고 판단된다.

3.4. 해동 잠열

해동 잠열은 생물체의 동결보존시스템의 열부하 계산을 통한 시스템의 총냉동능력 결정의 중요한 자료로 활용되는 열물성으로서 생물체의 조성성분과 비율, 해동 과정에서의 재결정화/실투 등의 물리화학적 변화로 인하여 헤조류간에도 차이를 보인다. 해동속도 0.1 ~ 2.0°C/min에서의 해동 잠열은 Fig. 11과 같다. 각 해조류의 해동 잠열은 Undaria pinnatifida 128.37 J/g, Porphyra seriata 118.53 J/g, Sargassum fulvellum 94.42 J/g의 값으로 나타났으며, 크기는 Undaria pinnatifida > Porphyra seriata > Sargassum fulvellum의 순으로 미역유배가 가장 큰 값을 나타내었다.

Figure 11. latent heat of thawing.

동결 및 해동 잠열은 WT(수분이동), IIF(세포외 빙결정 형성) 및 EIF(세포외 빙결정 형성)의 Exothermic 및 endothermic의 경로에 영향을 받으며, 온도에 따른 열량 의존성의 편차는 적으며 (±2 - 5/g) 측정 오차를 고려할 때 온도의존성은 없는 것으로 본다. 발표된 [35] 선행 연구로부터 동결 잠열은 Undaria pinnatifida 153.58 J/g, Porphyra seriata 146.67 J/g, Sargassum fulvellum 123.08 J/g의 값으로 다소 차이를 보이고 있으나, Undaria pinnatifida > Porphyra seriata > Sargassum fulvellum 의 순으로 해동 잠열과 동일하다. 해동 잠열의 감소는 해동과정에서의 재결정화로 인한 exothwemic heat의 영향으로 판돤된다.

해조류에 동결보존에 관한 열적 특성의 비교 자료는 없으나, Mori [45]의 인간진피섬유아세포 (HDF)의 동결 잠열 측정 결과와 비교해 보면 냉각속도 2°C/min 및 8°C/min에서 측정한 DSC thermogram의 곡선 면적인 총방출열량(동결잠열)이 170 kcal/mol로서 냉각속도에 관계없이 동일한 시료에 대하여 유사한 값으로 나타나는 결과로부터, DSC의 보정에 사용되는 n-deckane (28.58 J/g)보다 크고 물 (335 J/g)보다 작은 값을 나타내었다. 차이는 해조류와 인간진피섬유아세포, n-deckane, 물의 세포 구조, CPA농도, 최종 보존 온도, 재결정화의 유무 등의 변수에 의한 것으로 판단된다.

3.5. 해동 속도 상수

해동속도와 해동속도상수와의 관계를 Table 1~Table 2에 나타내었다. 해동속도상수는 해조류 현탁액의 흡열반응곡선으로부터 partial area kinetics program으로 구하였으며, 총흡열량에 대한 해동이 진행된 온도까지의 총 열유속의 비로써 나타내며, 헤동 공정에서의 특정 온도에서의 흡열반응의 진행 비율과 반응의 크기, 해조류의 해동과정에서 최대 해동속도를 나타내는 반응 온도를 결정할 수 있다. Porphyra seriata, Undaria pinnatifida, Sargassum fulvellum의 해동속도상수는 해동 초기에 큰 값을 나타내며, 해동속도와는 비례하여 커지게 된다.

Table 1 Kinetic constant of porphyra seriata

Materialthawing rate (°C/sec)
0.10.20.50.751.01.251.51.752.0
Porphyra seriata57.7659.65193.22307.98661.94523.361319.593328.87071.6
38.5047.7160.38184.79353.03340.30659.721109.61296.3
26.5638.1745.09144.3733243256.14555.56693.5975.3
18.9927.6734.10115.49207.13237.30456.46624.1718.3
15.0024.7228.4896.95187.67195.86398.95536.3650.7
12.5517.8527.2287.49170.92186.08366.72474.1578.5
10.9319.2227.0779.65156.77173.79342.43447.4334.5
7.43612.0422.5371.84122.0084.80155.55287.290.92
0.6191.29723.2310.8414.3428.69827.98844.6210.74


Table 2 Kinetic constant of Undaria pinnatifida in process of thawing

Materialthawing rate (°C/sec)
0.10.20.50.751.01.251.51.752.0
Undaria pinnatifida28.2645.6175.9274054316642210.23574.31377.3
16.9536.4681.17224.2203.6693.45731042.5918.1
10.7638.554.46157.8157.1453.8420.9774.4584.3
8.69532.8347.11120.9146.7361.7342.6595.7479.9
7.02227.3641.2995.49120.1283.7314.3527.8413.1
5.86125.6737.3386.01103.4260.6296.9494.2391.6
5.57823.935.0278.7397.68345.1283.6463.3365.7
4.22615.8429.5360.2890.15225.8169.6144.499.49
0.8132.827.12311.622.8357.582923.2313.15


해동속도상수(kc)는 발열반응열유속 (dH/dt)과 해동속도 (Vc)에 비례하여 증가하며, 일정 해동속도에서는 발열반응초기에 발열반응열유속 (dH/dt)이 큰 값을 나타내므로 해동속도상수의 값이 커지나, 반응이 진행됨에 따라 발열반응열유속(dH/dt)이 작아지므로 해동속도상수(kc)도 작아진다. 해동속도가 커지면 발열반응열유속이 증가하므로 해동속도상수도 커지게 된다.

3.6. 활성화 에너지

활성화애너지는 해동개시온도와 해동종료온도 사이의 각 온도에서의 해동 진행에 필요한 최소 열량으로서 Table 3에 나타내었다. 활성화에너지는 생성된 빙결정의 형상 및 크기와 상관성을 가지며, 해동속도가 클수록 값이 작아지며, Porphyra seriata –175 ~ –29 kJ/mol, Undaria pinnatifida –120 ~ –62 kJ/mol, Sargassum fulvellum –167 ~ –49 kJ/mol로 나타났다.

Table 3 Activation energy of Porphyra seriata in process of thawing (kJ/mol)

MaterialThawing rate (°C/min)
0.10.20.50.751.01.251.51.752.0
Porphyra seriata−175.06−147.11−29.80−96.56−117.09−96.89−81.05−80.69−71.72
Undaria pinnatifida−120.72−71.29−108.77−117.68−67.43−62.62−75.977−85.87−85.55
Sargassum fulvellum−167.93139.3749.48−78.24174.26−118.50−78.3980.18−−80.78


Porphyra seriata는 해동속도 0.5°C/min에서 활성화에너지가 최소로 되며 해동공정에서 세포외 빙결정에 대한 물의 빙결화가 진행되는 재결정화 과정이 포함되어 흡열반응열이 감소하는 것으로 판단되며, 해동속도 0.75°C/min에서 발열반응열이 증가하고 해동속도가 증가함에 따라 다시 감소하는 경향을 보였다. Undaria pinnatifida의 활성화에너지는 해동속도 1.0 ~ 1.25°C/min에서 최소값을 가지며, 해동속도가 1.5°C/min 이상에서는 거의 일정하였다.

Sargassum fulvellum의 활성화에너지는 해동속도 0.5°C/min에서 최소로 되고 재결정화가 진행되며, 1.0°C/min 이상에서 차이를 보이는 것은 활성화에너지가 해동속도의 영향을 받는 것으로 판단된다.

Gao 등 [36]의 동결보존 공정에서 냉각속도 4°C/min로 동결되는 세포막의 활성화에너지를 Arrhenius 관계식으로부터 14 ~ 17 kcal/mol로 계산하였다. 본 연구의 결과와 비교해 보면 작은 값을 나타내었다.

3.7. 해동 열물성 측정

해동과정에서의 해동속도와 엔트로피(S), 엔탈피(H), 자유에너지(F)의 관계를 Fig. 12 ~ Fig. 14에 나타내었다. Porphyra seriata, Sargassum fulvellum의 엔탈피 및 엔트로피는 해동속도에 따라 차이를 보이며, 0.5°C/min에서 최소로 되고, 해동속도가 커지면 증가한다.

Figure 12. Relations of enthalpy and thawing rate.

Figure 13. Relations of entrophy and thawing rate.

Figure 14. Relations of free energy and thawing rate.

엔탈피 및 엔트로피의 감소는 해동과정에서의 물의 재결정화 과정에서 빙결화에 의한 발열반응의 결과로 엔탈피 및 엔트로피의 감소로 나타나게 된다 [46].

Undaria pinnatifida은 1.0°C/min에서 엔탈피 및 엔트로피가 최소로 되고, 해동 속도의 증가에도 거의 일정하게 유지되므로 재결정화가 종결된 것으로 판단된다. Porphyra seriata, Sargassum fulvellum는 해동속도가 커지면 엔탈피 및 엔트로피가 증가하다가 다소 감소하는 것은 재결정화가 진행되고 있으나, 속도가 완만한 것으로 판단되며, Undaria pinnatifida가 안정화가 가장 빠르게 진행되었다. 생존율도 해동속도가 낮은 경우와 높은 경우의 사이에서 일어나므로 해동속도의 크고 작음에 치우칠 수 없으며, 생존율을 높이기 위한 피해야 하는 해동속도는 생물체에 따라서 달라진다.

Gao [36]에 의하면 세포의 생존 조건은 빙결정의 형성으로 인한 세포외 용액의 상태와 관계가 있으며, 해동과정에서 는 온도 영역 −15 ~ −160°C에서 생존의 위협을 받으며, 일부 작은 빙결정과 액체 상태의 물이 큰 빙결정으로 성장하므로, 빙결정의 형성 및 성장을 억제하는 것이 냉동보존의 효율을 향상시키게 된다. 또한 세포내 빙결정은 동일한 온도 조건에 서 완만해동하면 재결정의 생성이 증가되고 급속해동이 재결정화를 억제하고 빙결정에 의한 세포 손상을 방지한다. Chang [47]에 의하면 빙결정의 재결정화는 저온에서 빙결정이 성장하는 과정으로 전체 시스템의 자유에너지가 감소되는 열역학적 과정으로 유기체의 조직에 대한 구조적 및 기능적 손상을 초래하게 된다.

해동과정 중의 재결정화에 의한 종묘의 사멸을 방지하고 생존율을 높일 수 있는 최적의 해동속도를 결정하기 위하여 자유에너지의 변화를 비교하였다. Fig. 14에서 자유에너지와 해동속도의 상관성은 Porphyra seriata는 해동속도 0.5°C/min에서 자유에너지가 최소로 되며 세포외 빙결정에 대한 물의 빙결화로 빙결정이 성장하는 재결정화가 최대로 일어나며, 해동속도가 0.75°C/min 이상에서는 일정한 자유에너지 값을 가진다. 그러므로 Porphyra seriata의 동결보존 후 해동에 의한 복원과정에서는 해동속도를 0.75°C/min 이상으로 해동하는 것이 생존율을 높이게 된다.

Undaria pinnatifida는 해동속도 1.0°C/min에서 자유에너지가 최소값로 되어 재결정화가 일어나며, 해동속도 1.5°C/min 이상에서는 일정한 자유에너지 값을 가지므로 Undaria pinnatifida의 동결보존 후 해동속도를 1.5°C/min 이상으로 하는 것이 생존율을 높이게 된다.

Sargassum fulvellum은 해동속도 0.5°C/min에서 자유에너지가 최소로 되고 재결정화가 진행되며, 해동속도가 1.0°C/min 이상에서는 자유에너지 값이 일정하므로 Porphyra seriata의 동결보존 후 생존율을 높이기 위해서는 해동 속도를 1.0°C/min 이상으로 하여야 한다.

자유에너지가 최소가 되고 생존율이 낮아지는 해동속도는 Porphyra seriata 0.5°C/min, Undaria pinnatifida 1.0°C/min, Sargassum fulvellum 0.5°C/min이며, 해동속도의 증가에 따라 일정한 자유에너지를 유지하였다.

Porphyra seriata, Undaria pinnatifida, Sargassum fulvellum의 생존율을 높이기 위해서는 각각 0.75°C/min, 1.5°C/min, 1.0°C/min 이상의 높은 해동속도로 진행이 요구된다.

Porphyra seriata의 해동공정에서 재결정화에 의한 자유에너지가 감소 비율이 가장 크게 나타났으며, Sargassum fulvellum, Undaria pinnatifida의 순이었다. 자유에너지의 감소는 재결정화의 크기 및 생존율의 감소와 상관성을 가지므로 생존율은 자유에너지의 값이 큰 Undaria pinnatifida > Sargassum fulvellum >Porphyra seriata>의 순서로 높은 것으로 판단된다.

3.8. 해동공정에서의 생존율 향상을 위한 재결정화 저해 압력 - 상변화온도 관계

해동시의 재결정화로 인한 세포 사멸이 생존율 감소의 주원인이므로 비동결 물의 이동에 의한 빙결정화 메카니즘을 변환시키는 공정으로 압력이용 해동법을 이용함으로써 가압에 의한 재결정화를 방지하고 해동 속도가 커지게 되므로 생존율을 높일 수 있는 새로운 공정이 될 것으로 생각된다.

Clapeyron방정식으로부터

dPdTfusion=ΔSfusionΔVfusion=ΔHfusionΔVfusionT

융해 과정 중의 온도 변화에 대한 체적 및 엔탈피의 변화는 2차식으로 나타나므로

ΔV=a1T2+a2T+a3
ΔH=b1T2+b2T+b3

초기 조건으로 대기압하에서의 융해온도 P = 0, T = T(0) (1)식을 적분하여 적분상수 k

k=lnT(0)A1T(0)d1A2T(0)d2A3

A1, A2, A3

A1=b3a1d1d2 A2=b3a1d1d1d2 A3=b1d22+b2d2+b3a1d1d2d1d1=a2+a224a1a32a1 d2=a2a224a1a32a1

k 값을 대입하여 압력을 구하면 온도 T(P)에서의 압력 p는 식 (5)와 같다.

P=lnT(0)T(P)A1T(0)d1T(P)d1A2T(0)d2T(P)d2A3

해동공정에서 대기압상태 P(0)에서의 상변화온도 T(0)는 DSC로 측정 가능하며, 압력 P에서의 해동개시온도는 균주냉동보존을 위한 압력장치내의 균주 온도를 열전대로 측정하고 압력변화에 따른 생존율을 측정하므로써 생존율이 최대로 되는 재결정화를 해소시킬 수 있는 최적의 압력(bar)의 결정이 가능하리라 생각된다.

해조류의 종보존을 위한 해동공정에서 Porphyra seriata, Undaria pinnatifida, Sargassum fulvellum 의 현탁액의 열물성을 측정하여 최적해동조건을 결정하였다. 해동종료온도의 범위는 해동속도 1.25°C/min에서 –2.49 ~ –0.50°C, 1.5 ~ 2.0°C/min에서 2~3°C로 나타났으며, 3.0°C 이상의 온도에서는 해동이 완료되어 동해방지제 제거 공정이 가능하다.

해동진행시간이 최소가 되는 최적해동속도는 0.75~1.0°C/min이며, 해동 잠열은 Undaria pinnatifida 128.37 J/g, Porphyra seriata 118.53 J/g, Sargassum fulvellum 94.42 J/g 으로 미역유배가 가장 큰 값을 나타내었으며 해조류 동결보존 시스템의 설계 및 제작에 유용하게 활용 가능하다. 각각의 해동속도에 따른 엔탈피, 엔트로피 및 자유에너지의 변화로부터 재결정화 온도 범및 생존율 향상을 위한 최적의 해동속도는 Porphyra seriata, Sargassum fulvellum, Undaria pinnatifida 각각 0.75°C/min, 1.0°C/min, 1.5°C/min 이상이 적절하다.

해조류의 동결보존에서 해동공정의 연구 결과가 생존율을 높이고 현장의 양식장에서 정상적인 생장에 활용됨으로서 양식용 종묘의 동결-해동 일련의 과정이 최적의 방법으로 설정되어 양식생산산업에 기여하는 것이 중요하다.

해조류의 유전 자원과 생물 다양성을 보존 또는 보전하는 방법 중의 현지의 보존 방법의 하나인 동결보존은 용기내 보존으로 동결과 필요 시 해동시켜 사용함으로서 계대 배양 (pedigree culture)보다 시공간적으로 훨씬 유리하며, 앞으로 여러 종류의 해조류를 대상으로 하여 유전자 은행 (gene bank), 종자은행 (seed bank), 종자금고 (seed vault)를 구축하는데 연구 결과가 일조할 수 있으리라 생각된다.

Figure 1. Schemetic diagram of cell fate by cooling and thawing methods.

Figure 2. Preparsion of cryoprotective solution and DSC operating conditions.

Figure 3. DSC exothermic curve of thawing.

Figure 9. Thawing time and endothermic temperature of Undaria Pinnatifida.
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