피부의 노화 과정에는 연령의 증가에 따른 신체적 노화와 환경적 요인에 의한 노화가 동시에 작용하는데, 그중 외부 요인의 자극에 의해 촉진되는 피부의 외인성 노화(extrinsic aging) 현상을 일으키는 환경적 요인 중 가장 큰 것은 자외선(Ultra violet, UV)이다 [1]. 그중 파장이 280-320 nm인 UVB는 단시간 내에 표피 뿐 아니라 진피의 모세혈관까지 침투하여 주름 형성, 탄력성 손실, 색소 침착 등의 광노화(photoaging) 현상을 초래할 수 있다 [2]. UVB는 표피층의 거대 분자에 쉽게 영향을 미쳐 DNA 손상을 일으킬 수 있는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하는 등 여러 세포 기능에 영향을 미칠 수 있다 [3]. 장기간 외부 활동에 의한 다량의 자외선 노출은 피부의 산화 스트레스를 증가시켜 피부 노화를 가속화할 수 있는데, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase와 같은 항산화효소와 각종 폴리페놀, 비타민 C, 비타민 E 등의 비효소적 항산화 생리 활성 물질은 UVB에 의해 생성된 ROS를 제거함으로써 피부 손상을 방지한다 [4]. 따라서 피부에서 ROS의 과잉 생성을 억제하거나 생성된 ROS를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 소재의 개발은 노화 억제 및 피부 미용 산업에서 중요한 화두이다 [5].

UVB 노출에 의한 ROS의 비정상적 증가는 표피의 각질세포에서 염증을 일으키고, 진피의 기질 성분인 히알루론산, 콜라겐, 엘라스틴을 분해하는 기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 발현을 유도한다 [6]. MMPs의 활성이 증가하면 주근깨 및 기미 생성, 피부의 탄력감소, 주름 생성 등 피부 노화 현상이 가속화된다 [7]. MMPs 그룹은 collagenase, gelatinase, stromelysin, membrane-type MMP로 나눌 수 있으며, 약 20여 종이 알려져 있다 [8]. Collagenase 그룹에는 MMP-1, MMP-8, MMP-13이 포함되며 주로 제 I형, II형, III형 콜라겐을 분해한다. Gelatinase 그룹에는 MMP-2, MMP-9가 포함되며 MMP-1에 의해 분해된 콜라겐 조각들을 더 잘게 분해해 피부 노화에 주요한 역할을 한다. Stromelysin 그룹에는 MMP-3, MMP-10, MMP-11이 포함되며, 주로 제 IV형 콜라겐을 분해한다 [9,10]. UVB에 노출되면 염증반응이 유도되며 MMP-1, MMP-3, MMP-9가 증가하는 것으로 알려져 있다 [11,12].

대표적인 프로바이오틱스 미생물에 해당하는 유산균(Lactic acid bacteria, LAB)은 인체에 섭취될 경우 정장 작용을 하는 것으로 알려져 있으며 [13], 박테리오신, 니신과 같은 항균물질을 생산하여 항균 작용, 피부 보습 증진, 노화 억제, 염증개선 등 여러 유익한 기능성이 보고된 바 있다 [14-17]. 그뿐아니라 표피층에서 피부 수분을 증가시키고 표피 두께를 감소시키거나 진피층에서 피부 선천 면역 및 아토피 피부염 개선에 관여하는 피부 기능에도 기여할 수 있는 것으로 알려졌다 [18,19]. 균체(cell bodies)를 직접 사용하는 생균(live cells) 또는 사균(dead cells)이 항산화와 항염 활성을 통해 피부 개선 기능을 가질 수 있다는 것이 보고되었다 [13,20-22].

프로바이오틱스 미생물은 피부 기능성을 규명하여 화장품과 이너 뷰티 물질을 개발하기 위한 좋은 원료이나, 균체의 경우에 용해되지 않거나 크기가 큰 고형의 성상이기 때문에 기능성을 발휘하는 기전을 설명하고 인체 적용을 위한 제형을 설계하는 데에는 어려움이 있다. 따라서 연구자들은 미생물 유래의 나노 수준의 미세 물질을 활용하는 방안을 고려하고 있다 [23-25]. 미생물로부터 용해성 물질을 얻기 위해서는 균주를 배양하여 세포 외 대사물을 얻거나 세포 내 용해 물질을 추출해야 하며, 이러한 물질의 상업적 활용성을 높이기 위해서는 각종 미생물 종의 배양 유래 물질을 활용한 다양한 효능 연구가 지속적으로 보고될 필요가 있다. 특히 광노화와 관련한 미생물 유래 물질의 기능은 드물게 보고되어 있으므로, 본 연구에서는 프로바이오틱스로 상용화되어 있는 균주를 배양하여 획득한 균체 파쇄액(cell lysate)과 배양 상등액(culture supernatant)을 인간 각질형성세포에 처리하여 UVB 조사로 유발한 광노화로부터의 보호 능력을 평가하였다.

2.1. 사용 균주 및 종균 제조

프로바이오틱 균주인 Limosilactobacillus fermentum IDCC3901은 수제 치즈에서 분리되었으며, 균주 번호 BAA-2842로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁되어 있다. 이 균주를 MRS (Difco, USA) 배지를 이용하여 37°C에서 20시간 동안 배양한 다음, 균체를 회수하여 신선한 MRS 배지와 glycerol (Duksan, Korea)이 4:1(v/v)로 혼합된 용액에 현탁하였다. 균 현탁액은 vial에 2 mL씩 분주하여 −70°C 이하의 deep freezer에 보관하였다.

2.2. 유산균 균체 파쇄액 및 배양 상등액 제조

유산균의 배양 유래 물질을 제조하는 공정은 Fig. 1에 묘사하였다. MRS 배지에 L. fermentum IDCC 3901의 종균을 초기 농도 1 × 10⁸ colony forming unit (CFU)/mL가 되도록 접종하여 37°C에서 18시간 배양한 다음, 전배양 용액을 MRS 배지에 10% (v/v) 접종하여 12시간 동안 증식하여 생균수가 2.8 × 10⁹ CFU/mL가 되도록 배양하였다. 배양 종료액은 6,700×g로 10분간 원심분리 하여 균체와 상등액을 분리하여 회수하였다. 회수된 균체는 증류수로 2회 세척한 다음 다시 증류수를 배양액 양만큼 넣어 121°C에서 20분 간 멸균하여 세포질 용액을 용출시켰다. 균 파쇄액과 pH 6.5로 중화한 배양 상등액을 각각 0.2 μm필터로 여과하여 균체를 비롯한 잔여물을 제거하여 나노 단위 크기의 성분만 포함하는 시료를 얻었다. 각 시료를 희석하지 않은 것은 고농도(1,000 μL/mL) 시험물질로 정하여 그대로 사용하였고, 증류수로 희석하여 중농도(500 μL/mL)와 저농도(균 파쇄액: 100 μL/mL, 배양 상등액: 250 μL/mL)의 시험물질을 제조하여 사용하였다.

Figure 1. Manufacturing process of fermentation products of L. fermentum IDCC 3901.

2.3. 세포 배양 및 시험 물질 처리

인간 각질형성세포(human keratinocytes, HaCaT cell)는 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM, Welgene, Korea)에 10% fetal bovine serum (FBS, Thermo Fisher Scientific, USA) 및 100 unit/mL penicillin-streptomycin이 첨가된 배지에서 37°C, 5% CO2 조건 하에 배양하였다. 각 시험 수행 시에는 24시간 배양한 세포에 시험 물질인 균체 파쇄액과 배양상등액의 농도별 희석액을 20 μL씩 처리한 다음 UVB를 40 mJ/cm2로 조사하였다.

2.4. 세포 생존율

균체 파쇄액과 배양 상등액 시료의 세포 독성과 UVB 조사에 의한 세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT, Promega, USA)를 이용한 방법으로 측정하였다. HaCaT 세포를 5 × 10⁴ cells/well이 되도록 96 well plate에 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 시험 물질을 처리하고 UVB를 조사한 후 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 MTT 시약을 처리하고 4시간 동안 배양한 다음, 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 처리하여 용해시킨 후 plate reader (Bio-Tek, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율의 확인은 UVB를 조사한 군과 조사하지 않은 군으로 나누어 수행하였다.

2.5. ROS 생성량

시험 물질 처리에 의한 세포 내 ROS 생성량 측정은 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay로 수행하였다 [26]. HaCaT 세포를 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 다음 시험 물질과 UVB를 처리한 후 2시간 동안 배양하였다. DCFH-DA (Sigma-Aldrich, USA)를 20 μM 첨가하고 30분 간 처리한 다음 Phosphate-buffered saline (PBS)로 3회 세척하였다. Free radical 생성량은 excitation 485 nm과 emission 530 nm의 형광도를 통해 측정하였으며, 결과는 UVB를 조사하지 않은 군 대비 백분율로 나타내었다.

2.6. 항산화 효소 활성

SOD 및 CAT 활성은 assay kit (Abcam, UK)를 사용하여 측정하였다. HaCaT 세포를 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 다음 시험 물질과 UVB를 처리하여 2시간 동안 배양한 HaCaT 세포를 lysis buffer에서 homogenization 하여 총 단백질을 추출하여 SOD 및 CAT 활성을 각각 450 및 600 nm의 흡광도를 통해 측정하였다.

2.7. 콜라겐 함량

세포 배양액 내의 콜라겐 함량은 기 보고된 방법을 참고하여 수정하여 진행하였다 [27]. UVB를 조사한 세포 배양 상등액에 포함된 총 용해성 콜라겐을 SirCol 분석 키트(Biocolor Ltd., Northern Ireland)를 사용하여 정량하였다. HaCaT 세포를 24-well 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 시험 물질과 UVB를 처리하고 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 상등액 400 μL에 Sirius red 염료를 1 mL 첨가하고 실온에서 30분 동안 부드럽게 회전하면서 배양하였다. 12,000×g로 10분 동안 원심분리한 후, 콜라겐과 결합한 염료를 0.5 M NaOH을 1 mL 첨가하여 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라겐 생성량은 UVB를 조사하지 않은 군 대비 백분율로 나타내었다.

2.8. MMPs 생성량

세포 배양액 내 MMPs의 양은 Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay를 통해 측정하였다. HaCaT 세포를 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 시험 물질과 UVB를 처리하고 24시간 동안 배양한 다음 Quantikine ELISA kit (R&D Systems, USA)를 사용하여 배양 상등액의 MMP-1과 MMP-9의 양을 측정하고, UVB를 조사하지 않은 군 대비 백분율로 나타내었다.

2.9. 통계 분석

모든 결과는 3회 반복 실험 결과를 평균 ±표준편차(Mean ± Standard deviation)로 나타냈으며, R version 4.2.2를 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다. 일원 배치 분산분석(One way Analysis Of Variance: ANOVA) 이후 Tukey’s HSD post-hoc test를 통해 군 간 다중 비교를 수행하였으며, p<0.05 일 경우 통계적으로 유의적인 차이가 있다고 판단하였다.

3.1. L. fermentum IDCC 3901 배양물질의 세포 독성 평가 및 UVB 조사 후 세포 생존력 평가

수제 치즈에서 분리한 프로바이오틱 균주인 L. fermentum IDCC 3901의 배양물질이 HaCaT 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여 균체 파쇄액과 배양 상등액을 농도별로 처리하여 세포 독성을 관찰하였다. 균체 파쇄액과 배양 상등액 모두 고농도로 처리한 경우, 시료 미처리 군 대비 90% 이상 생존함을 확인하였으며, 이는 모두에서 유의한 수준(p<0.05)으로 독성이 없는 것을 확인하였다(Fig. 2A).

Figure 2. Cytotoxic effects (A) and cell viability with UVB exposure (B) of L. fermentum IDCC 3901-fermented products on HaCaT cells by using the MTT analysis. a-cDifferent letters indicate significant difference at p<0.05 level. The combination letter ‘bc’ is not significantly different from ‘b’ or ‘c’. CL, cell lysate; CFS, cell-free supernatant; N.S, not significant.

시료를 처리하지 않은 상태에서 UVB를 조사한 군의 세포생존율은 67.5%로 UVB를 조사하지 않은 군 대비 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 균체 파쇄액을 처리한 다음 UVB를 처리했을 때의 세포 생존율은 저농도 78.3%, 중농도 84.6%, 고농도 81.9%로 대조군과 비교하여 모두 유의하게 높은 생존율을 확인하였다. 배양 상등액의 경우 저농도 77.0%, 중농도 77.1%, 고농도 81.3%로 대조군과 비교하여 모두 더 높은 수치를 보였으나, 대조군과 유의적인 차이를 보인 고농도와는 달리 저농도와 중농도는 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 2B).

균주의 생사 여부와 상관없이 균체를 구성하는 세포 성분과 대사 산물이 외부 유해인자를 직접 차단할 수 있다는 연구 결과들이 보고된 바 있다. Lactobacillus paracasei SKB1192는 균체 내 성분인 뉴클레오티드가 UVB를 흡수함으로써 피부에 유해성을 차단하는 것으로 확인되었으며 [20], Bacillus coagulans RK-02이 생성하는 대사 산물인 세포 외 다당체(extracellular polysaccharides, EPS)가 UV를 차단하는 효과를 갖고 있다고 보고되었다 [28,29]. Lactobacillus rhamnosus의 발효물은 섬유아세포에서 UVB에 대한 세포손상 및 독성을 감소시켜 세포 사멸을 저해함으로써 피부를 효과적으로 보호할 수 있다고 보고되었다 [30]. 이러한 결과들과 마찬가지로, 본 연구에서도 L. fermentum IDCC 3901이 보유한 세포 성분과 대사 산물이 UVB에 의한 세포 손상을 보호하는 역할을 할 수 있다는 것이 확인되었다.

3.2. L. fermentum IDCC 3901 배양물질의 ROS 소거 및 항산화 효소 활성 유도 능력 평가

이전의 연구에서 프로바이오틱스 미생물의 항산화 활성 능력이 보고되어 있었다 [31]. SOD와 CAT는 생체 내에서 ROS에 의해서 세포기능이 손상되는 것을 방어해주는 중요한 기능을 수행한다. 산화적 스트레스가 주어졌을 때 SOD는 ROS 일종인 superoxide anion을 산소 분자와 과산화수소 분자로 분해하고 CAT는 과산화수소를 물과 산소 분자로 분해함으로써 산화적인 손상으로부터 세포를 보호한다 [32]. L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질에 의한 ROS 생성억제 효과를 확인하기 위해 HaCaT 세포에 시료를 처리하고 UVB 조사에 의해 유도된 ROS의 소거 효과를 확인하였다. 먼저, 시료를 처리하지 않은 상태에서 UVB를 조사한 군의 ROS 생성량은 155.7%로 UVB를 조사하지 않은 군 대비 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 균체 파쇄액과 배양 상등액 처리 후 UVB 조사 시 시료 미첨가 군과 비교했을 때 농도 의존적으로 감소된 ROS 생성량을 나타내었다. 균체 파쇄액을 처리한 경우 모든 농도에서 시료 미첨가 군 대비 유의적인 차이를 보였고, 특히 중농도과 고농도에서는 30% 이상 감소된 ROS 생성량을 보였다. 배양 상등액의 경우 저농도는 시료 미첨가 군 대비 유의적인 차이를 보이지 않았으나 중농도와 고농도에서는 유의적인 차이를 나타내었다. 이때, 고농도의 배양 상등액은 균체 파쇄액의 저농도 보다는 ROS 소거능이 높았으나, 중농도와 고농도보다는 ROS 소거능이 낮은 모습을 보였다(Fig. 3). 이러한 결과로부터 L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질이 UVB 조사에 따른 과도한 ROS 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 동일한 양을 처리했을 때에는 균체 파쇄액에서 더 높은 효과를 나타냄을 확인하였다.

Figure 3. Intracellular ROS levels in UVB-irradiated HaCaT cells, determined by the DCF-DA method. a-dDifferent letters indicate significant difference at p<0.05 level. The combination letter ‘ab’ is not significantly different from ‘a’ or ‘b’. CL, cell lysate; CFS, cell-free supernatant.

L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질에 의한 세포의 항산화 효소 활성 유도 효과를 확인하기 위해 SOD 및 CAT 활성을 측정하였다. SOD 활성 평가 실험에서 UVB를 조사하지 않은 군은 5.9 U/mL의 활성을 나타내었으나, UVB를 조사한 시료 미첨가 군은 1.6 U/mL로 유의적으로 감소된 활성을 나타내었다. 균체 파쇄액을 처리한 후 UVB를 조사한 경우 저농도는 시료 미첨가 군 대비 유의적인 차이가 없었으나, 중농도와 고농도에서는 각각 4.3 및 5.4 U/mL로 농도 의존적이고 유의적인 SOD 활성 회복을 보였다. 배양 상등액 처리 시에도 저농도와 중농도는 시료 미첨가 군 대비 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 고농도에서는 3.0 U/mL로 유의적으로 높게 나타났다(Fig. 4A). CAT 활성 평가 실험에서 UVB를 조사하지 않은 군은 8.3 U/mL의 활성을 나타내었으나, UVB를 조사한 시료 미첨가 군은 3.9 U/mL로 유의적으로 감소된 활성을 나타내었다. 균체 파쇄액을 처리한 후 UVB를 조사한 경우 저농도는 시료 미첨가 군 대비 유의적인 차이가 없었으나, 중농도와 고농도에서는 각각 5.8 및 6.0 U/mL로 유의적인 활성 회복을 보였다. 배양 상등액 처리 시에는 저농도와 중농도는 시료 미첨가 군 대비 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 고농도에서는 5.0 U/mL로 유의적으로 높게 나타났다(Fig. 4B). 균체 파쇄액과 배양 상등액 간의 비교 시 중농도와 고농도에서 균체 파쇄액이 배양 상등액 대비 보다 유의적으로 높은 SOD 및 CAT 활성 유도능을 나타내었다.

Figure 4. Antioxidant enzyme activity induced by L. fermentum IDCC 3901-fermented products in UVB-irradiated HaCaT cells. SOD (A) and CAT (B) activities were measured using colorimetric assay kits. One unit of SOD is defined as the amount that inhibits the xanthine oxidase activity by 50% under the assay conditions, while one unit of CAT activity is defined as the amount that degrades 1 μmol of hydrogen peroxide per minute. ad Different letters indicate significant difference at p<0.05 level. The combination letter ‘cd’ is not significantly different from ‘c’ or ‘d’. SOD, superoxide dismutase; CAT, catalase; CL, cell lysate; CFS, cell-free supernatant.

위 결과로부터 L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질이 UVB 조사 시 생성되는 ROS를 소거하게 만드는 항산화능력을 유도하며, 이는 항산화 효소 활성을 회복시키기 때문일 것으로 추측할 수 있었다. 각종 유산균 사균체가 우수한 수준의 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능이 있다고 보고되었다 [22,33]. 이러한 유산균의 항산화 활성에는 균체 표면의 EPS, 세포질에 존재하는 각종 다당류, 대사 물질로서 생성된 glutathione, α-tocopherol 등이 관여하는 것으로 알려져 있다 [34]. 따라서 L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질로부터 유효 성분을 추출하여 특성과 기전을 규명한다면 노화와 관련한 산업 분야에서의 이용 가능성을 한층 높여줄 수 있을 것으로 생각된다.

3.3. L. fermentum IDCC 3901 배양물질의 콜라겐 생성 및 MMPs 억제능 평가

L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질에 의한 HaCaT 세포의 콜라겐 생성 촉진을 확인하기 위해 콜라겐 함량을 측정하였다. 먼저, 시료를 처리하지 않은 상태에서는 UVB를 조사하자 콜라겐 함량이 41.8%만큼 감소하였다. 이때 균체 파쇄액을 처리한 경우 모든 농도에서 시료 미처리 군 대비 콜라겐 함량이 유의하게 증가하였다. 배양 상등액의 경우 저농도와 중농도에서는 시료 미처리 군 대비 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 고농도에서는 유의적인 증가를 보였다. 시료간 비교 시에는 배양 상등액의 고농도가 균체 파쇄액의 중농도 및 고농도와 유의적인 차이를 보이지는 않았다(Fig. 5). L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질에 의하여 증가된 콜라겐 함량이 콜라겐 분해를 촉진하는 MMPs의 활성 차이에 의한 것인지 확인하기 위해 MMP-1과 MMP-9의 발현 억제능을 확인하여 UVB를 조사하지 않은 군 대비 백분율로 나타내었다. 먼저, 시료를 처리하지 않은 상태에서는 UVB를 조사하자 MMP-1과 MMP-9의 생성량이 유의적으로 증가하는 모습을 보였다. MMP-1의 경우 균체 파쇄액 처리 시 모든 농도에서 유의적인 차이를 보이며 감소하였으며, 특히 중농도와 고농도에서는 각각 109%와 102%로 UVB를 조사하지 않은 군과도 유의적인 차이가 없었다. 배양 상등액에서는 고농도에서 MMP-1의 농도가 유의적으로 감소하는 모습을 나타냈다(Fig 6A). MMP-9의 경우 균체 파쇄액과 배양 상등액 모두 중농도와 고농도에서만 유의적으로 감소한 수치를 보였다(Fig 6B). 이러한 결과를 통해 L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질이 UVB 조사 시 MMP-1과 MMP-9의 발현증가를 억제하는 능력을 갖고 있는 것을 확인했으며, 콜라겐의 분해를 억제하여 광노화에 의한 주름 생성을 억제할 가능성을 확인하였다. 또한, 두 시험 물질을 비교할 때 MMP-1과 MMP-9 모두 동일 농도에서 균체 파쇄액의 효능이 더 우수함을 알 수 있었다. 이전 연구에서 유산균 발효물이 콜라겐 생합성을 촉진하고 MMP-1과 MMP-9의 활성을 저해하는 것으로 보고되고 있었다 [35,36]. 특히 Lacticaseibacillus rhamnosus를 접종하여 배양한 대두 발효물이 UVB에 의한 콜라겐 합성을 증가시켜 주름 생성을 예방하는 효능을 발휘하였고, 그뿐 아니라 멜라닌 생성 억제를 통한 색소 침착도 예방하였다 [30]. 이는 항산화와 주름 개선 효능을 중점적으로 파악한 본 연구에 대해 미백이나 보습 등의 추가 연구의 필요성을 제시한다. 또한, 본 연구에서는 콩 유래의 배지 성분은 존재하지 않았기에 L. fermentum IDCC 3901을 대두 성분이 포함된 배지에 서 배양할 경우 높은 수준의 광노화 보호 효능을 기대할 수 있으므로 이에 대한 추가 연구를 수행할 가치가 있다.

Figure 5. Collagen content in UVB-irradiated HaCaT cells. a-dDifferent letters indicate significant difference at p<0.05 level. The combination letter ‘cd’ is not significantly different from ‘c’ or ‘d’. CL, cell lysate; CFS, cell-free supernatant.

Figure 6. Effect of L. fermentum IDCC 3901-fermented products on MMPs expression under UVB-irradiated condition. MMP-1 (A) and MMP-9 (B) levels in the culture supernatant of HaCaT cells were detected by ELISA. a-eDifferent letters indicate significant difference at p<0.05 level. The combination letters 'ab', 'bc', 'cd', and 'dé are not significantly different from their individual letters. CL, cell lysate; CFS, cell-free supernatant.

3.4. 배양 유래 물질 제형 간의 농도 별 효능 고찰

살아있는 프로바이오틱스 제형이 아닌 균체 또는 배양액을 열처리(heat treatment) 등의 방식으로 후처리하여 제조한 물질을 효능 평가 제형으로서 활용한 연구는 최근 10여년 간 활발히 보고되어 왔다 [37]. 파라바이오틱스(parabiotics)나 포스트바이오틱스(postbiotics) 등의 이름으로 개발된 제형들은 섭취를 통해 미용 효과를 나타내는 이너 뷰티 소재로서의 가능성을 보이기도 했다 [23]. 균체(cell body)는 입자 크기가 마이크로 단위로서 매우 크고 용해성이 떨어지므로 미용 제품 소재로 적용하기엔 제형적으로 한계가 있기에 균체 파쇄액과 배양 상등액을 사용한 제형을 화장품 소재로 사용하는 사례가 증가하고 있다 [38]. 하지만 미용 제품 소재로서 두 배양 유래 물질의 효능을 직접 비교한 연구는 드물었다. 따라서 본 연구에서는 프로바이오틱스로 산업에 활용되고 있는 L. fermentum IDCC 3901의 균체 파쇄액과 배양 상등액의 광노화 억제 효과를 비교하였으며, 시험 물질 종류 및 농도에 따른 모든 실험 결과의 통계적 유의성을 Table 1에 정리하였다. 그 결과 균체 파쇄액의 중농도와 고농도, 배양 상등액의 고농도는 UVB를 조사하여 수행한 모든 시험에서 대조군 대비 유의한 효능을 나타내었다. 배양 상등액의 중농도는 ROS와 MMP-9을 제외한 모든 실험에서 유의성을 나타내지 못한 것으로 볼 때, 균체 파쇄액이 동일 농도에서 배양 상등액보다 더 높은 효능을 보였다. 이전에 보고된 바로는 Lactobacillus가 보유한 EPS나 표면 막 단백질(surface layer proteins)이 항산화 효과를 나타낼 수 있으며 [39,40], 리포타이코산(lipoteichoic acid)의 경우 항산화를 포함한 광노화 보호능을 발휘할 수 있음이 보고되었다 [41]. 이러한 기존 연구들은 유산균 균체 구성 성분이 높은 광노화 억제 효과를 가지는 본 연구의 결과를 뒷받침한다.

Table 1 Summary of statistical significance in the anti-photoaging effects induced by fermentation products of L. fermentum IDCC 3901

Material	Concentration (μL/mL)	Cell protection Cell viability	Antioxidant			Antiwrinkle
			ROS	SOD	CAT	Collagen	MMP-1	MMP-9
Cell lysate	100	0.022	0.014	N.S	N.S	0.04	<0.001	N.S
	500	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
	1000	0.002	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
Culture supernatant	250	N.S	N.S	N.S	N.S	N.S	N.S	N.S
	500	N.S	0.005	N.S	N.S	N.S	N.S	0.001
	1000	0.003	<0.001	<0.001	0.002	<0.001	0.044	0.001

All measurements were performed in triplicate.

The data shows the P value in comparison to the UVB-irradiated control group.

ROS, reactive oxygen species; SOD, superoxide dismutase; CAT, catalase; MMP, matrix metalloproteinase; N.S, not significant.

본 연구에서는 프로바이오틱스 세균 배양 유래 물질이 인간각질형성세포에서의 UVB에 의한 광노화에 미치는 영향을 확인하였다. 인체 적용을 위한 제형 설계를 고려하여 프로바이오틱 균주인 L. fermentum IDCC 3901을 배양한 후 획득한 균체를 파쇄한 세포 용해물과 배양 상등액을 사용하였다. 균체 파쇄액과 배양 상등액을 농도별로 고농도, 중농도, 저농도로 각각 처리하고 UVB 조사에 대한 세포 생존률, 항산화능력, 콜라겐 함량 및 콜라겐 분해에 영향을 미치는 MMPs 발현 억제력을 측정하여 결과를 확인하였다. 균체 파쇄액과 배양 상등액 모두 HaCaT cell에 대해 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. L. fermentum IDCC 3901이 보유한 세포 성분과 대사 산물이 UVB에 의한 세포 사멸을 억제하고, UVB 조사 시 생성되는 ROS를 소거하는 항산화 효소 활성을 회복시키며, MMP-1과 MMP-9 단백질 발현을 감소시킴으로써 콜라겐 분해를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질은 UVB에 의한 피부 손상을 보호하는 항산화, 항노화 화장품 소재로 활용이 가능할 것으로 생각된다. 향후에 L. fermentum IDCC 3901의 배양 유래 물질에서 주된 효능을 담당하는 유효 성분을 분리하여 더 높은 효능을 발휘하고 명확한 기전 설명을 가능케 하는 추가 연구를 수행한다면 경쟁력 있는 산업 소재를 개발하는데 기여할 수 있을 것이다.