Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal

pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

Article

Home All Articles View

Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2024; 39(4): 136-144

Published online December 31, 2024 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2024.39.4.136

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

효모인공염색체를 이용한 한천분해효소 생산 및 세포생리학적 분석

Production of Agarase Using Yeast Artificial Chromosome and Cellular Physiological Analysis

Min-Jun Seong1 and Yeon-Hee Kim2*

1Synthetic Biology Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Daejeon 34141, Korea
2Department of Biomedical Engineering, Dong-Eui University, Busan 47340, Korea

Correspondence to:Tel: +82-51-890-2281, Fax: +82-504-250-6356
E-mail: yeonheekim@deu.ac.kr

Received: July 29, 2024; Revised: December 4, 2024; Accepted: December 10, 2024

Yeast artificial chromosomes (YACs) with expression clusters of three genes (AGAH71, AGAG1, and NABH558) responsible for agar degradation were constructed using chromosome manipulation technique. The three agar-degrading genes were stably introduced into chromosome II of the Saccharomyces cerevisiae strain, confirming efficient production and secretion of various agarases. For efficient chromosome manipulation, each splitting fragment (DNA module) was transformed, and yeast chromosome II (825 kb) was successfully split 270 kb-YAC, 38 kb-mini YAC and 524 kb-YAC through two-rounds chromosome splitting, resulting in the construction of the YKY180 strain, which has a total of 18 chromosomes. Splitting efficiency for chromosome manipulation was 27~100% and the expression level of foreign genes on 38 kb-mini YAC and enzyme activity were indistinguishable from those of the host strain. This means that the structural alteration of the chromosome did not affect gene expression level. The 38 kb-mini YAC demonstrated stable mitotic stability for up to 200 generations, and it was capable of producing various metabolites from agar degradation. This suggests that the artificially manipulated mini-YAC could have diverse industrial applications.

Keywords: chromosome manipulation, yeast artificial chromosome (YAC), agarase, mitotic stability, Saccharomyces cerevisiae

Algal galactan에 속하는 한천(agar)은 홍조류(red algae)의 대표적인 세포벽성분으로 agarose와 agaropectin으로 구성된 polysaccharide이다. 이 중합체는 D-galactose와 3,6-anhydro-L-galactose (AHG)가 α-1,3 결합과 β-1,4 글라이코시드 결합(glycosidic bond)으로 연결되어 있는 구조(β-(1,4)-D-galactose-α-(1,3)-3,6-anhydro-L-galactose)로 되어있다 [1]. 한천은 뛰어난 gelation property를 가지고 있기 때문에 주로 bacteriological culture media의 gelling agent로 사용되고 있으며, biological research에서 chromatography 또는 electrophoresis를 위한 중요한 material로 이용되고 있다. 또한 한천은 오랫동안 안전한 식품으로 인정되어 한천 및 한천의 분해산물은 건강식품의 첨가물 및 의약적인 목적으로도 그 활용범위가 넓고, 화학연료를 대체할 지속가능한 marine biomass로도 주목을 받고 있다 [2]. 그러므로 한천 biomass를 이용한 한천의 다양한 부산물(byproduct)을 biotechnological 및 bioindustrial application에 사용하기 위해 효율적으로 한천을 분해하는 효소의 탐색, 효소의 대량생산 및 한천 분해공정 개발 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 [3-9].

한천을 이용한 한천 부산물의 생산을 위해서는 agarose를 (neo)agaro-oligosaccharide 및 단당화하기 위한 chemical liquefaction과 enzymatic saccharification의 방법을 사용할 수 있다. Chemical liquefaction은 효율적이지만 산(acid hydrolysis)과 고온 처리 및 다음 공정을 위한 중화과정을 거쳐야 하고, 균일한 부산물이 생성되기 어려우며 처리공정에서 환경오염을 일으킬 수 있다 [9-11]. 따라서 agarose로부터 균일한 생산물을 얻기 위한 선택적 당화가 가능하고 발효부산물이 환경에 미치는 영향이 적은 효소학적인 공정이 바람직하다고 할 수 있다. 한천 바이오매스의 효소학적 당화를 위해서는 agarose의 α-1,3결합을 절단하여 agarooligosaccharide를 생산하는 α-agarase [3,7]와 β-1,4 결합을 절단하여 neoagarooligosaccharide를 생산하는 β-agarase가 필요하다 [4,12]. 또한 β-agarase에 의 한 생성물 중 neoagarobiose (3,6-anhydro-L-galactosyl-α-(1,3)-D-galactose)는 α-neoagarobiose hydrolase (NABH)에 의해 더 가수분해되어 최종적으로 D-galactose와 AHG (3,6-anhydro-L-galactose)로 분해된다 [5]. 이전의 연구에서 3종의 한천분해효소를 사용하여 agarose의 전처리과정 없이 하나의 batch에서 효소학적 당화 및 발효(unified enzymatic saccharification and fermentation (USF))를 통해 10 g/L agarose부터 1.97 g/L 바이오에탄올의 생산을 보고하였다[2]. 본 연구에서는 3종의 한천분해효소를 episomal type (YEp type)의 plasmid 형태가 아닌 효모염색체에 안정적으로 도입하여 agarose의 당화반응 동안 효소의 활성을 안정적으로 유지하는지를 확인하고자 하였다. 한천분해효소를 코드하는 유전자의 염색체내로 도입은 one-step integration 방법[13]을 사용하여 3종의 유전자를 동시에 효율적으로 도입하고, 이러한 유전자 cluster를 가진 염색체 부위를 염색체가공(chromosome manipulation)을 통해 효모인공염색체(yeast artificial chromosome, YAC)화 하여 한천분해가 가능한 효소를 가진 미니 효모인공염색체(mini-YAC)의 구축가능 여부를 조사하였다.

염색체의 가공기술은 기존의 천연염색체(nature chromosome)의 구조 및 기능분석에 주로 사용되어져 왔으나 최근에는 genome reconstruction [14], chromosome fusion [15] 및 synthetic yeast [16,17]의 제작 등 다양한 분야에 활용되고 있으며, 원하는 유전자를 도입한 미니 염색체(mini-chromosome)의 구축 및 transplantation을 통해 최적의 게놈(optimal genome)을 가진 균주의 제작도 가능할 것이라 기대한다. Saccharomyces cerevisiae 균주를 세포공장으로 효율적인 염색체가공 및 다양한 기능적 연구를 위해 이전의 연구에서 PCR-mediated chromosome splitting (PCS) 기술을 개발하였다 [18-20]. PCS법은 염색체 가공을 원하는 염색체부위의 target sequence (표적서열)을 포함한 splitting fragment (DNA module)를 PCR을 통해 제작하고, 효모에 도입하여 인공염색체의 구축 등 염색체 가공 및 특성분석을 용이하게 하기 위해 개발된 염색체분단(chromosome splitting)기술이다. 본 연구에서는 한천분해유전자의 효모염색체내의 도입과 유전자 cluster의 미니인공염색체화를 통해 인공염색체의 안정성 및 도입된 유전자들의 안정적인 발현 및 생산을 알아보고자 하였다.

2.1. 사용균주 및 plasmids

Plasmid 구축 및 증폭을 위한 Escherichia coli 숙주세포는 DH5α 균주를 사용하였고, 한천분해를 위한 3종의 유전자 도입 및 효모염색체의 가공을 위한 효모 숙주세포는 S. cerevisiae FY834 균주 [2]를 사용하였다. S. cerevisiae FY834 균주는 형질전환 및 인공염색체 구축 시 사용할 수 있는 선별마커(selective marker)가 다양하고 한천의 분해산물인 galactose를 탄소원으로도 잘 이용하여 유전자발현 및 염색체가공에 적합한 균주로 선정되었다. 한천분해를 위한 3종의 유전자는 β-agarase를 코드하는 Pseudoalteromonas hodoensis H7 유래의 AGAH71 유전자(GenBank accession No. KJ850914) [21]와 Alteromomas sp. GNUM-1 유래의 AGAG1 유전자(GenBank accession No. KF574012) [22] 그리고 α-neoagarobiose hydrolase를 코드하는 Gayadomonas joobiniege G7 유래의 NABH558 유전자(GenBank accession No. OF019566) [23]를 사용하였다. 이들 유전자의 ORF 상류에는 단백질의 분비생산을 위한 S. cerevisiae MFα (mating factor alpha) signal sequence를 포함하고 galactose에 의해 유도되는 GAL10 promoter를 가지고 있어 한천분해효소를 효율적으로 세포밖으로 분비할 수 있도록 하였다 [2,13]. 이 3종의 유전자 발현 cassette를 효모 염색체내로 도입하기 위해 yeast integrative plasmid system (pRS plasmid)을 사용하였고, 효모인공염색체 구축을 위한 DNA module 제작을 위해 pBluescript II SK base plasmid (pBlue-CgLEU2, pBlue-CgHIS3 및 pBlue-CEN4 plasmid)를 PCR의 주형으로 사용하였다 (Table 1).

Table 1 Yeast strains and plasmids used in this study

StrainsGenotypes
S. cerevisiae FY834MATα ura3-52 his3-Δ200 leu2-Δ1lys2-Δ202 trp1-Δ63
FY834/pRS-HMATα ura3-52his3-Δ200 leu2-Δ1lys2-Δ202 trp1-Δ63/CgTRP1
FY834/pRS-GHMATα ura3-52 his3-Δ200 leu2-Δ1lys2-Δ202 trp1-Δ63/CgTRP1
FY834/pRS-NGHMATα ura3-52his3-Δ200 leu2-Δ1lys2-Δ202 trp1-Δ63/CgTRP1
YKY179 (R-split)MATα ura3-52 his3-Δ200 leu2-Δ1lys2-Δ202 trp1-Δ63/CgTRP1/CgLEU2
YKY180 (RL-split)MATα ura3-52 his3-Δ200 leu2-Δ1lys2-Δ202 trp1-Δ63/CgTRP1/CgLEU2/CgHIS3
YKY181 (L-split)MATα ura3-52 his3-Δ200 leu2-Δ1lys2-Δ202 trp1-Δ63/CgTRP1/CgHIS3
PlasmidsDescriptions
pGMFα-AgaH71GAL10p-MFαs.s-AGAH71-GAL7t (AGAH71 EC*), URA3 selective marker [2]
pGMFα -AgaG1GAL10p-MFαs.s-AGAG1-GAL7t (AGAG1 EC), URA3 selective marker [2]
pGMFα -NABH558GAL10p-MFαs.s-NABH558-GAL7t (NABH558 EC), URA3 selective marker [2]
pRS-CTKpRS306/KAP104, CgTRP1
pRS-HpRS-CTK/AGAH71 EC
pRS-GHpRS-CTK/AGAG1 EC-AGAH71 EC
pRS-NGHpRS-CTK/NABH588 EC-AGAG1 EC-AGAH71-EC
pBlue-CgLEU2pBluescript II SK/loxP-CgLEU2-loxP [20]
pBlue-CgHIS3pBluescript II SK/loxP-CgHIS3-loxP [20]
pBlue-CEN4pBluescript II SK/CEN4 [19]

*EC means gene expression cassette.



2.2. 발현 plasmid의 구축

3종의 한천분해효소를 코드하는 유전자 발현 cassette를 가지고 있는 pRS-NGH plasmid의 구축을 위해서, pRS-CTK plasmid를 vector로 사용하여 AGAH71, AGAG1NABH558 유전자 발현 cassette를 In-Fusion HD cloning Kit (Clonetech Laboratories, Inc. Takara)를 사용하여 순차적으로 도입하였다. pRS-CTK plasmid는 integrative plasmid로 reusable selective marker인 loxP-CgTRP1-loxP cassette와 상동성재조합(homologous recombination)을 위한 target gene인 KAP104 gene을 포함하고 있다. 본 연구에 사용한 Candida glabrata 유래의 TRP1 (CgTRP1)유전자는 S. cerevisiaeTRP1 gene과 효모세포 내에서 같은 기능을 하지만 염기서열의 상동성은 61%로 S. cerevisiae genome내에서 비특이적인 재조합이 일어나는 것을 방지하기 위해 사용되었다. KAP104 gene은 S. cerevisiae의 2번염색체에 위치한 유전자로 재조합에 의한 기능적 문제(결실 및 증가 등)가 생겨도 세포의 생장에 영향을 미치지 않는 유전자로 선택되었고, 또한 원하는 integration position에 따라 다른 유전자로도 대체될 수 있다. pRS-H plasmid의 구축을 위해서는 pGMFα-AgaH71 plasmid [2]를 주형으로 해서 InAga-F/pRStuI-R primer set를 이용하여 AGAH71 유전자 발현 cassette (GAL10p-MFαs.s-AGAH71-GAL7t)를 PCR로 증폭하였다. 그리고 StuI으로 선형화한 pRS-CTK plasmid에 AGAH71 유전자 발현 cassette를 In-fusion cloning하여 pRS-H plasmid를 구축하였다. 같은 방법으로 InAga-F/pRStuI-R2 primer set를 이용하여 pGMFα-AgaG1 plasmid [2]로부터 AGAG1 유전자 발현 cassette를 제작하고 pRS-H plasmid에 도입하여 pRS-GH plasmid를 구축하고, 같은 primer set로 pGMFα-NABH558 plasmid로부터 NABH558 유전자 발현 cassette를 제작하고 pRS-GH plasmid에 도입하여 최종적으로 pRS-NGH plasmid를 구축하였다. Plasmid구축에 사용한 oligonucleotide는 Table 2에 나타내었다. 이전의 연구[24]에서 한천의 분해에 관여하는 각 유전자를 NGH (NABH588 gene expression cassette (EC)-AGAG1 EC-AGAH71 EC)의 순서로 배열한 경우가 HGN (AGAH71 EC-AGAG1 EC-NABH588 EC)의 배열보다 transcription level 및 한천분해효소의 활성이 각각 25% 및 40% 증가된 보고로부터, 각 유전자들의 plasmid내 배열은 가장 활성이 낮고 자연계에서 발현정도가 낮은 neoagarobiose hydrolase (NABH) 유전자 발현 cassette의 위치를 다른 유전자 발현 cassette보다 upstream에 두어 transcription level 및 효소활성을 높이고자 하였다.

Table 2 Oligonucleotides used in this study

OligonucleotidesSequences (5’-3’)
InAga-FTTCACCAGCTAAAGGCCTCATCGCTTCGCTGATTA
pRStuI-RAAAGGAACCTAGAGGTCGATAACGACACCGACAAT
pRStuI-R2AGCGAAGCGATGAGGTCGATAACGACACCGACAAT
MNN2-1GCAATCGCCTTATCATGAGT
MNN2-2TAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAAATGGTGTAGCAATGTTACAA
MNN2-3TAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAAGAAACCCGTCTTCATCATGG
MNN2-4TGCTCTTACTGGATGCTGAC
SCO2-1GGGATGTTGTTTGAGGAGTG
SCO2-2TAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAAAAGACATCCGGTGTATCTCT
SCO2-3TAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAAGAAAGAGTACTTAAGAGATT
SCO2-4GCATCGGATTTTATGTATGT
SK-FTTACGCCAAGCGCGCAATTA
Tr-R(CCCCAA)6TAATACGACTCACTATAGGG

Underlined letters indicated overlap sequences used for the second PCR.



2.3. 형질전환 및 배지, 배양조건

S. cerevisiae FY834 균주에 각각의 plasmid를 도입하기 위해서 salmon testes 유래의 single-stranded carrier DNA를 사용하는 high efficiency transformation법[2]을 이용하였고, Trp+ 형질전환주는 synthetic complete (SC) medium [7]에서 선별되었다. S. cerevisiae 균주의 증식배지로는 YPD [10 g yeast extract, 20 g peptone, 10 g dextrose per liter] 배지를 사용하였고, 한천분해효소의 유전자 발현유도를 위해서는 YPDG [10 g yeast extract, 20 g peptone, 10 g dextrose, and 10 g galactose per liter] 배지를 사용하였다. 재조합 효모균주는 5 mL YPD배지에서 16~24시간 동안 전배양 한 후, 10 mL 또는 50 mL YPDG 배지에 각각 접종(initial OD600 0.1)하여 30oC, 190 rpm에서 각각 48시간 또는 72시간 배양하였고, 가공된 인공염색체의 세포내 안정성을 조사하기 위해서는 4%의 dextrose가 포함된 YPD배지에서 13일 동안 배양하였다. 효모세포의 optical density (OD)는 spectrophotometer를 사용하여 660 nm (OD660)에서 측정하였고, dry cell weight (DCW)는 미리 측정된 conversion factor (0.3 DCW (g/L)/OD660)를 적용하여 산출하였다.

2.4. 한천분해효소 활성 측정

한천분해효소의 활성측정은 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method [2]를 사용하여 agarose로부터 분해된 환원당(galactose)을 측정하여 계산하였다. 세포외로 분비된 한천분해효소가 포함된 배양액(효소액)을 0.2% agarose 용액과 40oC에서 10분간 반응한 후, DNS 용액을 첨가하여 10분간 boiling하여 540 nm에서 흡광값을 측정하였다. 1 unit는 1분간 1 μmole의 환원당을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 또한 한천분해효소의 정성적 분석을 위해 YPDG 고체배지에서 재조합균주를 48시간 이상 증식시킨 후, iodine solution [0.05 M I2 in 0.12 M KI]으로 직접 염색하여 한천분해효소에 의해 분해된 환(clear halo)을 조사하였다.

2.5. Splitting fragment (DNA module)의 제작

한천분해효소의 유전자 발현 cassette를 가진 효모 2번 염색체의 일부를 효모인공염색체화 하기 위한 염색체 splitting의 모식도는 Fig. 1에 나타내었는데, 먼저 효모 2번 염색체(825 kb)의 오른쪽 말단으로부터 523 kb (nucleotide position 290,035 of chromosome II)부분을 splitting (first splitting)하기 위해 상동성재조합(homologous recombination)을 위한 target sequence (T.S)를 포함하는 2개의 splitting fragment (SF)-I과 II를 제작하였다. SF-I (2.4 kb)는 형질전환주 선별마커로 CgLEU2 유전자, telomere seed sequence (5'-C4A2-3')6 및 target sequence로 구성된 DNA module로서, CgLEU2 (C. glabrata LEU2 gene) 유전자는 S. cerevisiae LEU2 유전자와 염기서열은 다르지만 상보적 기능을 가지고 있어 선택되었다. 이는 CgTRP1 선별마커와 마찬가지로 상동성재조합을 기본원리로 하는 염색체공학 기술에서 target sequence외의 다른 서열에 의한 비정상적인 상동성재조합을 막기 위해 사용되었다. CgLEU2 유전자는 pBlue-CgLEU2 plasmid를 주형으로 하고 SK-F/Tr-R primer set를 사용해 PCR로 증폭하였고, target sequence는 FY834/pRS-NGH 균주의 genomic DNA를 주형으로 SCO2-1/SCO2-2 primer set를 사용해 SCO2 유전자의 약 500 bp (289,555~290,035 bp of chromosome II) 영역을 PCR로 증폭하였다. 이렇게 증폭된 두개의 PCR 단편을 주형으로 SCO2-1/Tr-R primer set를 이용해 다시 한번 overlap PCR을 통해 SF-I을 제작하였다. SF-II (1.3 kb)는 centromere gene (CEN4), telomere seed sequence 및 target sequence로 구성된 DNA module로서, SF-I과 같은 방법으로 두번의 PCR과 한번의 overlap PCR을 통해 제작되었으며, CEN4 유전자의 증폭을 위해 pSK-CEN4 plasmid를 주형으로 사용하였고, target sequence는 SCO2 유전자의 약 500 bp (290,036~290,555 bp) 영역을 SCO2-3/SCO2-4 primer set를 사용해 PCR로 증폭하였다.

Figure 1. Splitting position in chromosome II (825 kb) of FY834/pRS-NGH strain (A). The chromosome II was split into 305 kb and 524 kb-YAC by 1st splitting and YKY179 strain (R-split) was constructed. Subsequently, the 305 kb YAC was successfully split into 270 kb-YAC and 38 kb mini-YAC by 2nd Splitting and YKY180 strain (RL-split) was constructed (B). The SCO2 and MNN2 genes were used as target gene for each splitting.

다음으로 효모 2번 염색체의 왼쪽 말단으로부터 268 kb (nucleotide position 268,209 of chromosome II)부분을 splitting (second splitting)하기 위해 필요한 SF-III과 SF-IV DNA module도 SF-I과 SF-II 제작과 유사한 방법으로 확보하였다. SF-III (2.2 kb)는 형질전환주 선별마커로 CgHIS3 유전자, telomere seed sequence 및 target sequence로 구성된 DNA module로서, CgHIS3 유전자는 pSK-CgHIS3 plasmid를 주형으로 하여 확보하였고, target sequence는 MNN2 유전자의 약 500 bp (267,720~268,209 bp of chromosome II) 영역을 PCR로 증폭하였다. 이렇게 증폭된 두개의 PCR 단편을 주형으로 사용하여 다시 한번 overlap PCR을 통해 SF-III을 제작하였다. SF-IV (1.3 kb)는 centromere gene (CEN4), telomere seed sequence 및 target sequence로 구성된 DNA module로서, SF-II과 같은 방법으로 제작되었으며, target sequence는 MNN2 유전자의 약 500 bp (268,210~268,719 bp of chromosome II) 영역을 PCR로 증폭하였다. 이렇게 제작된 각각의 DNA module은 FY834/pRS-NGH 균주에 순차적으로 도입되었다.

2.6. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)와 Southern hybridization

S. cerevisiae의 karyotype (핵형) 분석을 위해 각 균주를 YPD배지에서 24시간 정도 배양한 후, chromosomal DNA를 agarose plug (1% low melting agarose)의 형태로 제작하였다[18]. 제작된 chromosomal DNA plug는 CHEF-DRIII system (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 1% agarose (pulsed field certified agarose, Bio-Rad Laboratories) gel에서 약 22시간동안 분리되었고, 염색 후 UV상에서 karyotype을 분석하였다. 또한 pulsed field gel electrophoresis (PFGE) 후 효모인공염색체의 확인을 위한 DNA transfer 및 Southern hybridization은 Kim et al. [18]의 방법에 따라 수행되었고, probe DNA의 labelling 및 detection을 위해 ECL direct nucleic acid labelling system (Amersham Biosciences)을 사용하였다.

2.7. 한천분해산물의 TLC 분석

한천분해효소에 의해 가수분해된 agarose의 분해산물은 thin layer chromatography (TLC)를 이용하여 분석하였다. 효소반응을 위해 10 mL의 1% agarose (LE agarose), 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) buffer와 10 mL의 enzyme solution (1 unit/mL)을 40oC에서 4~24시간 동안 반응시켰다. Enzyme solution은 효소가 분비된 배양액을 concentrator 30K (PierceTM Protein concentrator, ThermoFisher)를 이용하여 농축하여 사용하였다. 각각의 반응액은 2 μL씩 4~5번 반복하여 TLC silica gel 60 plate (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 점적한 후 n-butanol/ethanol/water (5:3:2, v/v/v) 용액을 전개용매로 2회 전개하였다. 생성물은 ethanol-sulfuric acid (90: 10) 용액으로 spray한 후, 110oC에서 5분간 발색시켰다. Standard물질로는 1%의 neoagarooligosaccharide (NAO), neoagarotetrose (NA4), neoagarobiose (NA2), galactose (Gal), anhydrogalactose (AHG)를 사용하였다.

3.1. 한천분해유전자의 염색체내 안정적 발현

한천분해효소를 코드하는 3종의 유전자(AGAG1, AGAH71 and NABH558)를 각각 염색체내에 안정적으로 도입 및 순차적으로 발현시키기 위해서 pRS-H, pRS-GH 및 pRS-NGH plasmid를 구축하였다. 또한 각 유전자의 coding region은 MFα 분비서열(MFαs.s)의 염기성 아미노산 잔기 Lys-Arg(KR) 뒤에 연결되도록 design하여, 번역 후 분비과정 중 효모세포내의 KEX2 protease (yeast endopeptidase) [25]에 의해 절단되어 성숙형(mature form)의 한천분해효소가 안정적으로 세포 밖으로 분비될 수 있게 하였다. 구축된 pRS-H, pRS-GH 및 pRS-NGH plasmid는 KAP104 target sequence의 HpaI 제한효소에 의해 선형화되어 S. cerevisiae FY834 균주의 2번 염색체내에 integration되었고, CgTRP1 gene을 선별마커로하여 형질전환주를 각각 선별하였다. 선별된 형질전환주 각각의 genomic DNA를 주형(template DNA)으로 하여 AGAH71, AGAG1NABH558 유전자를 증폭하여 각 plasmid의 염색체내의 도입여부를 확인하였다(data not shown). 효모 2번염색체에 도입된 각 유전자들의 발현 및 한천분해효소의 분비생산을 알아보기 위해, 각 형질전환주를 YPDG 배지에서 72시간동안 배양한 후, 배지에 분비된 효소의 활성을 측정하였다(Table 3). FY834/pRS-H 균주에 비해 FY834/pRS-GH 균주에서는 β-agarase의 활성(specific activity)이 약 2배정도 증가되었음을 확인하였고, 이는 β-agarase를 코드하는 AGAH71AGAG1유전자를 모두 가지고 있기 때문이며, FY834/pRS-NGH 균주에서는 NABH558 유전자가 추가된 경우로 원래부터 활성이 높지 않은 NABH의 활성이 더해져 FY834/pRS-GH 균주에 비해 총 한천분해효소의 활성이 약 1.2배 정도 증가되었음을 확인하였다. 또한 이전의 연구에서 episomal (YEp) type의 NABH plasmid를 가진 균주를 48시간동안 비선택배지에서 배양했을 때의 plasmid stability가 약 46%~68% 정도로 저하되었음을 감안하면[26], pRS type plasmid (integrative system)를 사용한 균주의 plasmid stability는 100%를 보이므로 장기간 배양에서 지속적인 한천분해효소의 생산 및 활성을 유지할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 효모 2번 염색체에 안정적으로 도입된 유전자의 부위를 인공염색체화 하기 위해 FY834/pRS-NGH 균주를 염색체가공을 위한 숙주세포로 선정하였다.

Table 3 Comparison of cell growth and agarase activity in yeast transformants expressing various agarases

TransformantsDry cell weight (g/L)Agarase activity (unit/mL)Specific activity (unit/g-DCW)
FY834/pRS-H8.670.3236.9
FY834/pRS-GH7.890.4860.8
FY834/pRS-NGH8.010.5568.7
YKY179 (R-split)6.750.4363.7
YKY180 (RL-split)6.580.4568.4

These strains were cultivated in 50 mL YPDG medium for 72 hrs.

One unit of agarase activity was defined as the amount of enzyme that produced 1 μmole of galactose per minute under the assay condition.



3.2. 한천분해유전자를 가진 미니 효모인공염색체(mini-YAC)의 구축

한천분해유전자 발현 cassette를 도입한 FY834/pRS-NGH 균주의 2번 염색체에는 GAL7 (galactose-1-phosphate uridyl transferase), GAL10 (UDP-glucose-4-epimerase), 그리고 GAL1 (galactokinase) 유전자 등 galactose 대사에 관여하는 유전자들이 밀접하게 위치하고 있어 이 염색체부위를 인공염색체화 함으로써 한천분해에 의해 생성된 galactose의 대사를 더욱 용이하게 할 수 있는 효모인공염색체의 구축이 가능해지게 된다. 따라서 한천분해유전자 발현 cassette 및 GAL7, GAL10, GAL1 유전자를 가진 염색체부위를 인공염색체로 가공하기 위해, 염색체가공을 위한 DNA module 인 splitting fragment I (SF-I)과 SF-II module을 이용하여 FY834/pRS-NGH 균주에 형질전환하였다. SF-I과 SF-II는 효모 2번 염색체상의 SCO2 유전자 부위에 homologous recombination을 유도하여 825 kb의 2번 염색체를 524 kb와 305 kb-YAC로 가공될 수 있도록 한다 (Fig. 1(B)). 효모인공염색체의 확인을 위해 선별된 Leu+ 형질전환체 각각의 karyotype (핵형)을 PFGE를 통해서 분석해 본 결과, 825 kb의 2번 염색체가 524 kb와 305 kb의 효모인공염색체로 splitting되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 2(A), lane 2). 또한 305 kb-YAC에 도입된 AGAH71 유전자와 splitting에 의해 524 kb-YAC에 도입된 CEN4 유전자를 probe로 한 Southern hybridization 분석에서도 각각의 인공염색체를 확인할 수 있었다 (Fig. 2(A), lane 2). 핵형을 분석한 6개의 형질전환주에서 모두 인공염색체를 확인할 수 있었고, 그 중 하나의 균주를 선택하여 YKY179 균주(R-split strain)로 명명하고 second splitting을 위한 숙주세포로 사용하였다. 다음으로 YKY179 균주의 305 kb 효모 인공염색체상의 MNN2 유전자부위의 splitting을 위해 SF-III과 SF-IV module을 형질전환하여 His+ 형질전환주를 확보하였다. SF-III과 SF-IV module의 도입에 의해 305 kb-YAC는 270 kb-YAC와 38 kb-mini YAC 로 가공되는데(Fig. 1(B)), 형질전환균주에서 38 kb-mini YAC를 확인할 수 있었고 AGAH71 유전자를 probe로 한 Southern hybridization에서 305 kb-YAC가 사라지고 38 kb-mini YAC의 위치에서 detection이 되는 것을 확인하였다(Fig. 2(A), lane3). 최종적으로 두번의 염색체 splitting을 통해 효모 2번염색체를 3개의 효모인공염색체로 가공함으로써 총 18개의 염색체를 가진 효모균주(YKY180, RL-split strain)를 구축하였다. 각 염색체가공에서 splitting efficiency를 조사해 보면 first splitting (right part splitting)의 경우 splitting efficiency가 100% (6/6)인 반면에 second splitting (left part splitting)의 경우는 약 27% (3/11)정도의 efficiency를 보임을 알 수 있었다. 하지만 단독으로 MNN2 유전자부위의 splitting을 시도해 보았을 때(YKY181, L-split strain)의 splitting efficiency는 약 69% (9/13)였다(data not shown). 이는 splitting efficiency가 염색체가공의 target sequence에 매우 의존적이며, target sequence의 크기 또는 splitting의 위치에 따라 낮거나 높아지는 경우가 보고되어 있어 [18,19] target sequence (gene)의 선정이 중요한 요소가 될 수 있음을 시사한다. 또한 유전자편집기술인 CRISPR/Cas9 system의 효율적인 double strand breaks 유도를 이용한 PCS법에 의해 splitting efficiency 향상 및 multiple splitting도 기대해볼 수 있을 것이다[27].

Figure 2. Confirmation of the split-YACs by Puled field gel electrophoresis (PFGE) and Southern hybridization (A). AGAH71 and CEN4 genes were used as probes. The 38 kb-mini YAC contains NABH558, AGAG1, AGAH71, CEN4, and CgLEU2 genes as foreign genes. Lane 1 FY834/pRS-NGH strain (Host strain), lane 2; YKY179 strain (R-split), lane 3; YKY180 strain (RL-split). Comparison of agarase activity in host strain and transformants containing split-YACs (B). Each strain was grown on YPDG medium and then stained using iodine solution. 1; S. cerevisiae FY834, 2; FY834/pRS-NGH, 3; YKY181 strain (L-split), 4; YKY179 strain (R-split), 5; YKY180 strain (RL-split)

3.3. 미니 효모인공염색체(mini-YAC)의 세포생리학적 조사

염색체공학기술은 기존의 염색체를 임의로 가공하여 염색체의 구조가 유전자의 발현에 미치는 영향과 단백질 기능과의 상관관계 및 physical mapping 연구 등 다양한 목적으로 이용되어 왔다. 본 연구에서 도입한 한천분해 관련 유전자들을 가진 인공염색체의 경우, 인공염색체 상의 유전자들이 세포내 정상적인 발현 및 유지가 가능한지 또는 세포분열시 안정적인 mitotic stability를 보이는지 세포생리학적 분석이 필요하다. 따라서 YKY180 균주를 이용하여 도입한 유전자들의 안정적 발현이 유지되는지 분석해 보았다. 먼저 한천분해 유전자의 유도를 위해 1% galactose가 함유된 YPDG 배지에서 각 균주를 48시간정도 배양한 다음, iodine solution을 이용해서 한천 분해능을 확인해 보았다. 그 결과, 한천분해효소를 생산하지 않는 FY834균주에서는 한천의 분해환을 확인할 수 없었고, 한천분해 유전자를 도입한 다른 형질전환주에서는 비슷한 크기의 분해환을 확인할 수 있었다(Fig. 2(B)). 또한 DNS assay를 통한 정량분석에서 유의미한 한천분해효소 활성(specific activity)의 저하도 관찰되지 않아 도입된 한천분해 유전자의 발현 및 한천분해효소의 활성에는 인공염색체의 구조가 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다(Table 3). 따라서 목적으로 하는 외래유전자의 도입을 통한 다양한 효모인공염색체의 구축이 가능함을 시사한다. 또한 새롭게 구축한 38 kb-mini YAC가 세포분열 동안 안정적으로 세포내에서 결실되지 않고 유지될 수 있는지 조사해보기 위해 YKY180 균주를 YPD 배지(nonselective medium)에서 장시간 배양해 본 결과(Fig. 3), 약 200 generations 동안 38 kb-mini YAC의 결실없이 안정적인 mitotic stability를 가지고 있음을 확인 할 수 있었다. 이로써 목적에 따른 외래 유전자를 도입한 미니 효모인공염색체의 구축과 함께 효모인공염색체가 세포내에서 안정적으로 유지될 수 있음이 확인되었다.

Figure 3. Confirmation of mitotic stability in YKY180 strain (RL-split) by PFGE and Southern hybridization. The AGAH71 gene was used as probe. Lane H; YKY180 strain (RL-split), lane 1; YKY180 strain (RL-split) cultivated into YPD (2%) medium for 1 day, lane 2~12; YKY180 strain (RL-split) cultivated into YPD (4%) medium for 3 day to 13 days, respectively.

3.4. 미니 효모인공염색체(mini-YAC)를 이용한 대사산물의 분석

한천의 효율적인 분해를 위해 3가지의 한천분해효소 유전자가 도입된 미니 효모인공염색체를 가진 YKY180 균주를 구축하고 plasmid사이즈의 인공염색체가 효모의 성장에 필요한 필수유전자(essential gene)가 없음에도 불구하고 세포내에서 염색체로서 안정적으로 유지됨을 확인하였다. 또한 효모염색체의 구조변화에 따른 한천분해효소 유전자의 발현율의 차이는 없었으나 한천을 이용한 분해산물의 분석을 통해 미니 효모인공염색체의 산업적 활용가능성을 확인해 보기 위해 한천 분해산물을 TLC를 사용하여 분석하였다. 먼저 YKY180 균주를 galactose 유도배지에서 72시간 배양한 후 배양액을 농축하여 효소액으로 사용하였고, 0.5% agarose를 기질로 하여 40oC에서 4, 8, 12, 24 시간 반응시켰다. 그 결과, 반응 4시간째부터 agarose 분해에 의한 다양한 형태의 한천올리고당(NAO, NA6, NA4 and NA2)이 확인되었고, 반응 시간이 길어짐에 따라 더욱더 agarose를 효율적으로 분해함을 확인할 수 있었다(Fig. 4, lane 6~9). 한천의 산업적 이용을 위해 산 처리와 같은 화학적방법을 많이 사용했다면 효소에 의 한 선택적이고 균일한 한천분해산물의 생산이 가능하므로 한천분해효소를 가진 미니 효모인공염색체를 통한 산업적 균주의 개발도 더욱 가속화될 수 있다고 생각한다. Plasmid 형태의 유전자 삽입을 통한 균주 개발이 유전자의 크기 및 개수에 제한이 있었다면, 크기에 제한적이지 않는 효모인공염색체상의 외래 유전자 발현cluster 삽입은 그 활용범위가 넓고 안정적이며 다양한 숙주에 transplantation이 가능하며 자유로운 균주 육종에 활용될 수 있을 것이라 기대된다.

Figure 4. TLC chromatograms of hydrolysis products of agarase on agarose. The enzymatic reaction of agarase was carried out at 40°C in TE buffer containing 0.5% agarose as a substrate. Lane 1; neoagarooligosaccharide (NAO), lane 2; neoagarotetrose (NA4), lane 3; neoagarobiose (NA2), lane 4; galactose (Gal), lane 5; anhydrogalactose (AHG), lane 6~9; products hydrolyzed by agarase for 4,8, 12 and 24 h, respectively.

본 연구에서는 한천으로부터 다양한 대사산물의 생산을 위해 염색체가공기술을 이용하여 한천분해를 위한 3개의 유전자(AGAH71, AGAG1NABH558) 발현 cluster를 가진 효모인공염색체의 구축을 시도하였다. 먼저 3종의 한천분해유전자를 S. cerevisiae 균주의 2번 염색체에 안정적으로 도입하여 다양한 한천분해효소가 효율적으로 생산 및 분비됨을 확인하였다. 효모염색체의 가공을 위해 splitting fragment (DNA module)를 제작하고 두번의 염색체 splitting에 의해 825 kb의 효모 2번염색체는 270 kb-YAC, 38 kb-mini YAC와 524 kb-YAC로 가공되었으며, 총 18개의 염색체를 가진 YKY180 균주를 구축하였다. 염색체가공을 위한 splitting efficiency는 27~100%였으며, 38 kb-mini YAC상에 있는 한천분해유전자의 발현 및 효소활성은 염색체가공 전과 비교하여 유의미한 변화 및 저하는 관찰되지 않아 염색체 구조변화에 의한 유전자 발현의 영향은 없음을 확인하였다. 38 kb-mini YAC는 200 generation동안 안정적인 mitotic stability를 보였으며 한천의 분해에 의한 다양한 대사산물을 생산할 수 있어 인공적으로 가공된 미니 효모인공염색체의 다양한 산업적 활용을 기대할 수 있을 것이다.

  1. Duckworth, M., and W. Yaphe (1971) The structure of agar. I. Fractionation of a complex mixture of polysaccharides. Carbohydr. Res. 16: 189-197.
    CrossRef
  2. Lee, J. S., S. K. Hong, C. R. Lee, S. W. Nam, S. J. Jeon, and Y. H. Kim (2019) Production of ethanol (agaro-bioethanol) from agarose by unified enzymatic saccharification and fermentation in recombinant yeast. J. Microbiol. Biotechnol. 29: 625-632.
    Pubmed CrossRef
  3. Potin, P., C. Richard, C. Rochas, and B. Kloareg (1993) Purification and characterization of the α-agarase from Alteromonas agarlyticus (Cataldi) comb. nov., strain GJ1B. Eur. J. Biochem. 214: 599-607.
    Pubmed CrossRef
  4. Kirimura, K., N. Masuda, Y. Iwasaki, H. Nakagawa, R. Kobayashi, and S. Usami (1999) Purification and characterization of a novel β-agarase from an alkalophilic bacterium, Alteromonas sp. E-1. J. biosci. Bioeng. 87: 436-441.
    Pubmed CrossRef
  5. Ha, S. C., S. Lee, J. Lee, H. T. Kim, H. J. Ko, K. H. Kim, and I. G. Choi (2011) Crystal structure of a key enzyme in the agarolytic pathway, α-neoagarobiose hydrolase from Saccharophagus degradans 2-40. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412: 238-244.
    Pubmed CrossRef
  6. Hassairi, I., R. Ben Amar, M. Nonus, and B. B. Gupta (2001) Production and separation of α -agarase from Altermonas agarlyticus GJ1B. Bioresource Technology. 79: 47-51.
    Pubmed CrossRef
  7. Seok, J. H., H. S. Kim, Y. Hatada, A. W. Nam, and Y. H. Kim (2012) Construction of an expression system for the secretory production of recombinant α-agarase in yeast. Biotechnol. Lett. 34: 1041-1049.
    Pubmed CrossRef
  8. Ando, S., I. Arai, K. Kiyoto, and S. Hanai (1986) Identification of aromatic monomers in steam-exploded poplar and their influences on ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae. J. Ferment. Technol. 64: 567-570.
    CrossRef
  9. Jung, Y. H., I. J. Kim, J. J. Kim, K. K. Oh, J. I. Han, I. G. Choi, and K. H. Kim (2011) Ethanol production from oil palm trunks treated with aqueous ammonia and cellulase. Bioresour. Technol. 102: 7307-7312.
    Pubmed CrossRef
  10. Kumar, P., D. M. Barrett, M. J. Delwiche, and P. Stroeve (2009) Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind. Eng. Chem. Res. 48: 3713-3729.
    CrossRef
  11. Olsson, L., and B. Hahn-Hägerdal (1996) Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production. Enzyme Microb. Technol. 18: 312-331.
    CrossRef
  12. Seok, J. H., H. G. Park, S. H. Lee, S. W. Nam, S. J. Jeon, J. H. Kim, and Y. H. Kim (2010) High-level secretory expression of recombinant β-agarase from Zobellia galactanivorans in Pichia pastoris. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 38: 40-45.
  13. Jung, H. M., and Y. H. Kim (2019) Comparison of methods for stable simultaneous expression of various heterologous genes in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Biotechnol. Letters. 47: 667-672.
    CrossRef
  14. Park, A. H., M. Sugiyama, S. Harashima, and Y. H. Kim (2012) Creation of an ethanol-tolerant yeast strain by genome reconstruction based on chromosome splitting technology. J. Microbiol. Biotechnol. 22: 184-189.
    Pubmed CrossRef
  15. Luo, J., X. Sun, B. P. Cormack, and J. D. Boeke (2018) Karyotype engineering by chromosome fusion leads to reproductive isolation in yeast. Nature. 560: 392-396.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  16. Shao, Y., N. Lu, Z. Wu, C. Cai, S. Wang, L. L. Zhang, F. Zhou, S. Xiao, L. Liu, X. Zeng, H. Zheng, C. Yang, Z. Zhao, G. Zhao, J. Q. Zhou, X. Xue, and Z. Qin (2018) Creating a functional singlechromosome yeast. Nature. 560: 331-335.
    Pubmed CrossRef
  17. Richardson, S. M., L. A. Mitchell, G. Stracquadanio, K. Yang, J. S. Dymond, J. E. DiCarlo, D. Lee, C. L. Huang, S. Chandrasegaran, Y. Cai, J. D. Boeke, and J. S. Bader (2017) Design of a synthetic yeast genome. Science. 355: 1040-1044.
    Pubmed CrossRef
  18. Sugiyama, M., Y. H. Kim, K. Yamagishi, Y. Kaneko, K. Fukui, A. Kobayashi, and S. Harashima (2005) A versatile and general splitting technology for generating targeted YAC subclones. Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 65-70.
    Pubmed CrossRef
  19. Sugiyama, M., S. Ikushima, T. Nakazawa, Y. Kaneko, and S. Harashima (2005) PCR-mediated repeated chromosome splitting in Saccharomyces cerevisiae. BioTechniques. 38: 909-914.
    Pubmed CrossRef
  20. Kim, Y. H., and S. W. Nam (2010) Development of simultaneous YAC manipulation-amplification (SYMA) system by chromosome splitting technique harboring copy number amplification system. J. Life Science. 20: 789-793.
    CrossRef
  21. Park, D. Y., W. J. Chi, J. S. Park, Y. K. Chang, and S. K. Hong (2015) Cloning, expression, and biochemical characterization of a GH16 β-agarase AgaH71 from Pseudoalteromonas hodoensis H7. H. Appl. Biochem. Biotechnol. 175: 733-747.
    Pubmed CrossRef
  22. Chi, W. J., D. Y. Park, Y. B. Seo, Y. K. Chang, S. Y. Lee, and S. K. Hong (2014) Cloning, expression, and biochemical characterization of a novel GH16 β-agarase AgaG1 from Alteromonas sp. GNUM-1. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98: 4545-4555.
    Pubmed CrossRef
  23. Asghar, S., C. R. Lee, W. J. Chi, D. K. Kang, and S. K. Hong (2019) Molecular cloning and characterization of a novel coldadapted alkaline 1,3-α-3,6-anhydro-L-galactosidase, Ahg558, from Gayadomonas joobiniege G7. G. Appl. Biochem. Biotechnol. 188: 1077-1095.
    Pubmed CrossRef
  24. Lee, S. E., and Y. H. Kim (2020) Improvement of a unified saccharification and fermentation system for agaro-bioethanol production in yeast. Microbiol. Biotechnol. Letters. 48: 32-37.
    CrossRef
  25. Latchinian-Sadek, L., and D. Y. Thomas (1993) Expression, purification, and characterization of the yeast KEX1 gene product, a polypeptide precursor processing carboxypeptidase. J. Biol. Chem. 268: 534-540.
    Pubmed CrossRef
  26. Jung, H. W., and Y. H. Kim (2019) Optimal expression system for production of recombinant neoagarobiose hydrolyase in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Biotechnol. Letters. 47: 662-666.
    CrossRef
  27. Sasano, Y., K. Nagasawa, S. Kaboli, M. Sugiyama, and S. Harashima (2016) CRISPR-PCS: a powerful new approach to inducing multiple chromosome splitting in Saccharomyces cerevisiae. Scientific Reports. 6: 30278.
    Pubmed KoreaMed CrossRef

Stats or Metrics

Share this article on :

Related articles in KSBB