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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2021; 36(3): 209-215

Published online September 30, 2021 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.3.209

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

대왕버섯 (Pleurotus nebrodensis) 추출물의 미백 및 주름 개선 효과

Skin Whitening and Anti-wrinkle Effects of Pleurotus nebrodensis Extracts

In Hae Kim and Jae Hwa Lee*

Department of Pharmaceutical Engineering, College of Medical & Life Science, Silla University, Busan 46958, Korea

Correspondence to:Department of Pharmaceutical Engineering, College of Medical & Life Science, Silla University, Busan 46958, Korea Tel: +82-51-999-5831, Fax: +82-51-999-5636 E-mail: jhalee@silla.ac.kr

Received: May 4, 2021; Revised: September 25, 2021; Accepted: September 27, 2021

Pleurotus nebrodensis have been used as a traditional remedy and a food source. Our study focuses on figuring out the possibility of Pleurotus nebrodensis as cosmetic materials. We examined anti-oxidant, anti-wrinkle, anti-inflammation and whitening effects. The SOD-like activity was 69.7 ± 2.31 at 125 μg/mL, compared to the standard sample L-ascorbic acid 1 mM 34.7 ± 0.79. It was 11.5 ± 0.27 mg/g Naringin base and 64 ± 1.45 GAE (Gallic acid) base as a measurement result of total flavonoid and total polyphenol contents. GME showed 24.5% (L-tyrosine), 16.6% (L-DOPA) of tyrosinase inhibition assay, respectively. In elastase inhibition assay showed 36.2% of inhibition at a concentrations 200 μg/mL, tyrosinase and elastase activation were found to inhibited dose-dependent. As a result of measuring the collagen precursor pro-collagen type 1, the amount of collagen synthesis was 434 ng/mL at a concentration of 500 μg/mL. The higher the concentration of GME the greater the wrinkle reduction and whitening effects. Anti-inflammatory activites measured nitric oxide (NO) and cell viability in LPS-induced macrophage RAW264.7 cell, it was found to inhibit NO production in a concentration-dependent manner. These results suggest methanol extracted Pleurotus nebrodensis has excellent activities in the anti-wrinkle, anti-inflammation and whitening. Therefore, Giant mushroom Pleurotus nebrodensis may have value as the potential cosmetic formulations.

Keywords: anti-wrinkle, collagen, melanin, nitric–,oxide, Pleurotus nebrodensis

노화 (Aging)는 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되고 질병과 사망에 대한 감수성이 급격히 증가하면서 쇠약해지는 과정을 의미하며, 생물학적 노화 (biological aging)는 노화과정 동안 기관 (organ)과 기능 (function)의 개별적 변이가 일어나는 것을 말한다. 특히, 피부는 노화 연구에 매우 적합한 장기 (organ)이며, 노화에 영향을 주는 외부 자극을 끊임없이 받는 기관이다 [1]. 피부노화는 시간의 흐름에 의해 자연적으로 발생하며 섬유아세포의 작용과 세포 수가 감소하여 collagen, elastin, fibrin 등 세포 외 기질 단백질 섬유의 합성양이 줄어들고 구조가 느슨해져서 탄력이 감소 된다. 또한, 피부세포 내 수분이 손실되고 각질층의 구조가 변하는 내인성 노화와 외부의 환경요인에 의해 발생하는 외인성 노화로 분류할 수 있다. 태양광선의 자외선에 대한 자극이 반복되면서 활성 산소종 (ROS)을 발생시키고 전염증성 사이토카인의 생성이 촉진되어 여러 가지 신호전달 체계를 활성화하고 activator protein-1(AP-1)과 nuclear factor κB (NF-κB)의 활성화에 의한 염증반응과 작용이 증가되며 피부를 구성하는 지질, 단백질, 핵산, 효소 등이 손상되어 노화가 일어나는 외인성 노화로 구성되어 있다 [2].

노화 관련으로 SOD-catalase는 superoxide radical을 산소로 산화시켜 활성산소가 일으키는 생체내의 손상을 방지하고 보호하며, 피부의 산화 방지, 주름 예방 나아가 항노화에 관련 실험으로 폭넓게 사용되고 있다 [3]. 활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 인자로 작용하는 Nitric oxide (NO)는 iNOS의 효소 촉매 작용에 통해 생성되는 free radical로 혈압 조절과 신경전달 매개체로 면역반응에 중추적인 역할을 하지만, 과발현 혹은 염증 상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진 시키고 염증매개체의 생합성을 촉진 시켜 염증을 심화하는 것으로도 알려져 있다 [4]. 또한, 피부는 멜라닌으로 인한 피부색의 변화를 볼 수 있는데 멜라닌으로 인한 피부색의 변화는 기미, 주근깨, 검버섯, 반점 등의 과색소침착을 일으키고, 피부의 색소 침착을 유도하는 호르몬인 α-MSH는 각질형성세포로부터 분비되며, 인접한 멜라닌 형성세포는 세포막에 존재하는 수용체인 melanocortin-1 receptor (MC1R)을 통해 α-MSH를 인지하여 서로 결합한다. 이러한 결합은 멜라닌 합성에 있어 가장 중요한 세포 내 인자는 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)라 불리는 전사인자이며, 이 전사인자는 최종적인 멜라닌 생성과정을 촉매하는 tyrosinase의 발현을 증가시키는 역할을 담당한다. 발현이 증가된 tyrosinase는 본격적으로 멜라닌 합성을 시작하여 피부의 색소 침착을 유도한다고 알려져 있다 [5, 6].

피부결합조직에는 세포외기질 단백질 중 type I collagen이 가장 많이 존재하며, 그 밖에 elastin, fibronectin, integrin, fibrin, proteoglycans 등이 존재한다. 새롭게 합성된 procollagen은 효소반응을 거쳐 피부세포의 세포 외 공간으로 분비되어 삼중 나선구조 (triple helix configuration)의 microfibril을 형성하고, microfibril들은 leucine-rich small proteoglycans과 결합하여 fibril을 형성하는데, 이러한 과정을 fibrillogenesis라고 한다. 결과적으로 이렇게 만들어진 fibril들이 모여 collagen 섬유를 형성하게 되어 피부의 결합력과 탄력성을 갖게 한다 [7]. Collagen은 피부 진피층의 매트릭스를 이루는 주요 성분으로 collagen의 생합성과 분해는 피부노화의 주요 과정으로 인체 내에서 생성된 ROS가 matrix metalloproteinases (MMPs)의 발현을 유발한다는 보고도 있다 [8]. Collagen의 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포증식과 분화에 관여함이 알려져 있다. 진피 내 collagen의 감소는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있음이 잘 알려져 있다 [9].

최근에는 화장품 소재 분야에서도 천연 화장품, 유기농 화장품, 바이오 화장품 등이 이슈화되고 있고, 특히 먹을 수 있는 식품 소재로부터 화장품 소재로 전환하는 이너뷰티 (Inner-Beauty) 등이 관심을 받고 있다. 특히, 식용과 약용으로 사용되던 버섯류는 이미지의 고급화와 대중성을 지니고 있으며 향장품 소재로써 손색이 없으며, 특히 버섯에 많이 있는 베타글루칸은 피부 유분과 수분을 잡아 주는 보습 기능이 히알루론산보다 20% 우수하다는 평가를 받고 있고, 버섯 유래 베타글루칸이 제3세대 화장품 보습 원료로 사용이 확대되고 있다. 버섯의 기능성 화장품 사용을 보면 Schizophyllum commune (치마버섯)은 버섯 내의 다당체가 보습 화장료로 알려져 있으며 [10], Grifola frondosa (잎새버섯)은 식용과 약용으로 항암, 콜레스테롤 저하, 항균, 비만 치료, 이뇨 작용 등에 효과가 있는 버섯이면서, 화장품에서는 잎새 버섯의 다당체를 이용한 피부 보습, 자극 완화 그리고, 광노화 억제의 효과, 미백 효과를 가지고 있는 것으로 보고 되어있다 [11]. 또한 Dictyophora echinovolvata (망태버섯)은 천연방부제로서 피부 염증 억제, 피부 안정면에서 효능과 안전성 효과가 있으며 Agaricus blazei (아가리쿠스 버섯)은 화장품에 적용함으로써 항암, 면역증강, 생체 항산화 작용에 필수적인 셀레늄의 효과를 상승적으로 작용할 수 있게 하는 화장료의 조성물로 사용되고 있다 [12,13]. Phellinus linteus (상황버섯)은 항암, 그리고 피부 주름 방지 효과, 기미, 주근깨 개선 등의 미백 효과, 항여드름, 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있고 [14], 그 외 Cordyceps sp. (동충하초), Coriolus hirsutus (흰융털 구름버섯) 등과 같이 식용, 또는 약용으로 사용하는 버섯 중에서 주름과 미백 효과를 나타내고 있는 버섯들이 보고되어 있다 [15,16].

대왕버섯 (Pleurotus nebrodensis)은 담자균류의 느타리버섯과 (Pleurotaceae) 느타리버섯속 (Pleurotus)의 아위느타리로 불리는 아위버섯의 한 종류이다. 아위느타리는 식용 중에서 가장 크며 버섯살이 부드럽고 향이 좋아서 식용가치가 높으며, 아미노산, 비타민, 미네랄 성분 등이 다량 함유되어 있다 [17].

본 연구는 대왕버섯 (Pleurotus nebrodensis) 추출물을 대상으로 화장품 원료 및 향장품 소재로써의 활용성을 확인하고자 항산화 활성, 미백 활성 및 주름 개선 효능을 조사하였고 RAW 264.7 macrophage cell에 대한 세포 생존율과 항염증 효능을 진행하여 보고하고자 한다.

2.1. 실험재료 및 시약

실험에 사용한 대왕버섯 (Pleurotus nebrodensis)은 ㈜백차 바이오에서 구매하였으며 블랜더를 이용하여 파쇄한 뒤 실험에 사용하였다. 시료 1 kg에 5 L (1:5, w/v%)의 증류수를 넣어 고압멸균기를 이용하여 121oC 4 h 동안 추출하여 원심분리 (5,000 × g, 30 min, 4oC) 하였고, 침전물은 Homogenizer (HG-15D DAIHAN SCIENTIC, Korea)로 균질화한 다음, 다시 원심분리 (10,000 × g, 30 min, 4oC)를 행하였다. 두 번에 걸쳐 얻어진 상층액을 농축시킨 다음, 시료 : EtOH = 1:5 (v/v%)의 비율로 첨가하여 실온에서 24 h 방치 후, 원심분리 (10,000 × g, 30 min, 4oC)하여 농축한 다음 Sep-Pak C18 cartridge (20 mL, Waters)에 주입하여 10% Methanol (RM10), 60% Methanol (RM60) 및 100% Methanol (RM100)을 순차적으로 사용하여 물질을 용출시켰다. 각 농축한 시료는 동결 건조한 후, 본 연구에 사용하였다. 시료의 명칭은 대왕버섯 (Pleurotus nebrodensis) Methanol 60%를 대상으로 Giant Mushroom Extracts (GME)이라 명명하였다.

2.2. SOD-like activity

GME의 Superoxide dismutase-like activity 측정은 SOD 효소의 역가측정 방법인 xanthine oxidase/cytochrome C 방법을 응용한 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Inc., USA)를 이용하여 Superoxide anion radical (O2)의 소거 활성률을 측정하였다 [18]. 적정 농도별로 희석한 시료 20 μL와 WST working solution 200 μL를 첨가한 후, enzyme working solution을 20 μL 첨가하여 37oC에서 20 min 반응 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 kit의 계산법에 따라 SOD-like activity를 측정하였다. 이 역시 표준시료로는 L-ascorbic acid (Sigma chemical Co., Louis, MO, USA)를 사용하였다.

SOD-like activity (%) =[(Exp. – Blank )/Control] Absorbance × 100
2.3. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 함량은, 시료 100 μL에 2% Sodium carbonate (Na2CO3) 2 mL을 혼합 후, 실온에서 5 min 반응 후, 1 N Folin-Ciocalteu phenol Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2 mL을 첨가하여 25oC에서 30 min 반응하였다. ELISA Multiscan eader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 Gallic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준시약으로 이용하여 정량하였고 이 방법은 AOAC의 Folin-Denis 법을 일부 변형하여 사용하였다 [19]. 또한, 총 플라보노이드 함량은 농도를 50 mg/mL로 녹인 각각의 시료 100 μL에 Diethylene glycol 1 mL을 가한 후, 1 N NaOH 100 μL를 첨가하여 37oC에서 1 h 반응 후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 Naringin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA)을 표준시약으로 이용하여 정량하였고 Davis법을 일부 변형한 방법을 사용하였다 [20].

2.4. Nitric Oxide (NO) 활성

GME의 NO 생성 저해 활성은 nitrite assay를 사용하여 측정하였다 [21]. NO 합성의 indicator로 사용되는 NO2 농도는 Griess reagent (1% sulfonic acid, 0.1% N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride, 2.5% phosphoric acid)를 이용하여 배양 배지에서 측정하였다. 세포배양액 100 μL를 동량의 Griess reagent와 혼합하여 실온에서 10 min 반응시킨 후, 546 nm에서 ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)로 측정하였다. 모든 실험에서 fresh culture medium을 blank로 사용하였다.

2.5. 미백 활성

GME의 미백 활성 측정을 위하여 in-vitro tyrosinase 저해 활성과 B16-F10 mouse melanoma cells를 이용한 in-vivo 멜라닌 생합성 저해 효과를 측정하였다. L-tyrosine과 L-DOPA에 대한 inhibition assay는 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.8) 200 μL, 추출물 시료 20 μL, tyrosinase (1,000 ~ 1,500 U/mL) 20 μL에 1.5 mM 기질인 L-tyrosine과 L-DOPA를 20 μL를 혼합하여 37oC에서 15 min 반응한 다음, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 L-tyrosine (490 nm), L-DOPA (475 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로는 기능성 미백 소재인 Arbutin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA)을 사용하였다 [22].

Tyrosinase inhibition ratio (%) =[(Exp. – Blank)/Control] Absorbance × 100

세포 내의 멜라닌 생합성 저해 효과를 측정하기 위하여 6 well plate에 세포를 1 × 105 cells/well로 분주하여 24 h 동안 배양한 후 시료를 농도별로 처리하고, 1 h 후에 200 nM의 α-MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA)를 각 세포에 처리하여 72 h 동안 배양하였다. 배양된 세포는 PBS로 세척 한 뒤 10% DMSO가 포함된 1.0 N NaOH 용액을 처리하여 60oC에서 1 h 동안 반응시킨 후 ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 이용하여 490 nm에서 흡광도 측정하였다 [23].

2.6. 주름 개선 효과

GME의 anti-wrinkle 효과는 porcine elastase 저해 활성과 Type 1 pro-collagen 합성 효과를 측정하였다. Elastase 저해활성은 50 mM Tris-Cl 완충용액 (pH 8.0)에 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 1.5 mM의 농도로 용해된 기질액 20 μL에 각 농도별 시료 20 μL 첨가하여 여기에 porcine pancreatic elastase (1,000~1,500 U/mL) 20 μL 첨가하여 25oC 수용액 상에서 10 min 반응시켜 ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 Urosolic acid (Sigma-Aldrich St. Louis, MO. USA)를 사용하여 측정하였다. 각 시료의 억제 작용 N-Succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide를 N-succinyl-(Ala)3 와 p-nitroanilide로 분해되는 것의 필요한 μg/mL 농도로 나타내었다. 색보정은 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide가 용해된 완충용액 대신 Tris-HCl 완충용액을 첨가하여, 실험군과 같은 농도의 시료를 첨가하였다 [24].

Elastase inhibition ratio (%) =[(Exp. absorbance - Blank)/Control] Absorbance × 100

Type 1 pro-collagen 합성 촉진 활성 측정은 CCD-986sk human dermal fibroblast (섬유아세포)를 24 well plate에 5 × 104 cells/well의 농도로 접종한 후 24 h 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척 후 serum-free 배양액을 첨가하여 배양한 다음, 24 h 후 시료를 처리하고, 72 h 동안 배양한 배양액을 수집하여 측정에 사용하였다. 세포배양액 내의 콜라겐 합성 정도는 Type 1 pro-collagen C-peptide assay kit (Takara Bio Inc. Korea)를 사용하여 콜라겐의 함량을 측정하였다 [25].

2.7. 세포 독성 평가

살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)가 MTT formazan으로 전환되므로 이것의 양을 재면 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다. 96 well plate에 5 × 104 cells/well 농도의 cell line을 대상으로 10% fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 배지로 접종하여 24 h 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 serum-free 배지로 교체하고 시료를 농도별 처리하여 24 h 배양하였다. CCK-8 assay kit (Enzo Life Science, New york, USA) 용액을 첨가하여 24 h 배양 후, 37oC에서 2 h 반응시켰다. ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland)를 사용하여 450 nm에서 측정하여 세포 독성은 대조군과 비교하여 흡광도의 백분율로 나타내었다 [26].

2.8. 통계처리

실험값의 측정값은 3회 반복 실험에 의한 평균값으로 나타내었고, 대조군과 실험측정치의 통계학적 유의성 검정은 Student’s-test를 사용하여 표준편차 (p-value < 0.05) 수준에서 검정하였다.

3.1. 항산화 활성

대왕버섯 추출물 (GME) 항산화 활성은 화장품 관련 실험에 폭넓게 사용되고 있는 SOD-like activity와 간접적인 항산화 측정으로 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정하여 항산화 활성의 기준으로 제시하였다. 화장품에 있어서 항산화제의 역할은 피부조직과 결합으로 피부노화의 주범인 free radical의 활동을 방해하여 피부세포의 산화 손상에 대한 화학적 예방효과가 있는 것으로 알려져 있다. GME의 SOD 결과를 보면 125 μg/mL에서 69.7 ± 2.31이며 표준시료인 L-ascorbic acid 1 mM 34.7 ± 0.79와 비교하였다 (Table 1). 폴리페놀의 함량을 조사한 결과 64 ± 1.45 mg/g Gallic acid base로 나타났고, 플라보노이드 함량은 11.5 ± 0.27 mg/g Naringin base로 나타났으며, 각각 표준시료인 Gallic acid와 Naringin의 전환 값으로 표기하였다 (Table 2). 식물 유래의 항산화 물질은 대부분 phenyl hydroxyl group을 가지고 있어 라디컬 소거 활성을 나타내는 것으로 버섯 유래 추출물인 GME는 소재 특성상 베타글루칸의 함량이 높아서 항산화 활성은 다소 미흡한 결과를 나타내는 것으로 판단된다.

Table 1 . Superoxide Dismutase (SOD)-like activity of giant mushroom (GME) from Pleurotus nebrodensis

Conc. (μg/mL)15.631.262.5125L-ascorbic acid (1 mM)
GME19.0 ± 1.2232.2 ± 2.0064.7 ± 1.7869.7 ± 2.3134.7 ± 0.79

*Each value is expressed as a means ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test. *p < 0.05 **p < 0.01 compared with control.


Table 2 . Total polyphenol contents and flavonoid contents of giant mushroom (GME) from Pleurotus nebrodensis

Total polyphenol content (Gallic acid mg/g*)Total flavonoid content (Naringin mg/g*)
GME*64 ± 1.45 mg/g GME base*11.5 ± 0.27 mg/g Naringin

*mg/g, base on dry weight. Each value is expressed as mean ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control.


3.2. 미백 활성

화장품 소재로서의 가치를 알아보기 위해 대왕버섯 추출물의 미백 활성을 조사하였으며, 표준시료인 Arbutin 1 mM과 비교하여 L-DOPA, L-tyrosine 두 기질을 대상으로 tyrosinase 저해 활성과 B16F10 mouse melanoma cell을 대상으로 멜라닌 생합성 저해 활성을 진행하였다. GME의 세포 내 멜라닌 생합성 저해 효과를 살펴본 결과 500 μg/mL의 농도에서 13.6%로 우수한 멜라닌 저해 활성을 나타내었다 (Fig. 1). Tyrosinase 저해 활성을 보면 기질 L-tyrosine의 경우 200 μg/mL의 농도에서 24.5%의 활성을 L-DOPA는 같은 농도에서 16.6%의 저해 활성을 나타내었다 (Fig. 2). 실험 데이터를 참조하여 GME는 표준시료인 Arbutin과 비교하여도 높은 tyrosinase 저해 활성과 멜라닌 합성 저해 활성으로 미백 소재로의 가능성을 볼 수 있었다. 이러한 미백 활성의 작용원리로 보면, 피부가 자외선과 외부로부터 자극을 받게 되면 멜라닌 형성세포가 멜라닌을 형성하게 되는데, 멜라닌은 각질 형성세포로 전달되고 멜라닌이 각질형성세포로 이동함에 따라 멜라닌으로 인한 피부의 색소 침착을 볼 수 있다. 먼저 L-tyrosine은 tyrosinase의 효소 촉매반응을 통해 L-DOPA로 변화되며, L-DOPA는 tyrosinase-related protein 1 (TRP-1), tyrosinase-related protein 2 (TRP-2)에 의해서 최종 멜라닌으로 전환된다. 이 중 tyrosinase는 멜라닌 생성반응을 조절하는 대표적인 효소이므로 대표적인 미백용 화장품 원료인 Arbutin, 닥나무추출물, 감초추출물은 tyrosinase의 활성 억제를 주요 효능으로 하고 있다 [27].

Figure 1. Inhibitory effect of giant mushroom (GME) on α-MSH stimulated melanogenesis of mouse B16-F10 melanoma cells. Melanin content in GME treated B16-F10 cells at day 3. Cells were cultured at 37oC for 72 h in DMEM supplemented with α-MSH (200 nM) with the extract in a concentration dependent manner. Each value is expressed as mean ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control.
Figure 2. Inhibitory effect of giant mushroom (GME) against mushroom tyrosinase activity. The activity of mushroom tyrosinase which is involved hydroxylation reaction from L-tyrosine to DOPA was measured by the change in absorption at 490 nm after incubation with various concentration of GME. The activity of mushroom tyrosinase which is involved oxylation reaction from DOPA to DOPA quinone was measured by the change in absorption at 490 nm after incubation with various concentration of GME. Each value is expressed as mean ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control.
3.3. 주름 개선 효과

일반적으로 피부 상피세포는 건조중량의 약 70~80%를 차지하는 주요 구성 성분인 collagen, elastin 및 hyaluronic acid와 함께 피부의 탄력 및 주름 관련 주요 성분으로 알려져 있다. 또한, 피부에서 Type 1 collagen의 합성과 분해 효소의 하나인 MMP-1의 활성이 균형을 이루고 있지만, 내외부적인 요인에 의하여 피부노화가 진행되는 피부조직에서는 Type 1 collagen의 합성이 저하되고, MMP-1의 효소 활성이 증가되는 것으로 보고 있다 [28]. 콜라겐 합성 촉진 효능은 주름 방지를 위한 효과적인 방법이라 판단되어 대왕버섯 추출물 (GME)의 피부 탄력 및 주름 개선 효과를 측정하기 위하여 porcine elastase 저해 활성과 피부 유래 섬유아세포를 대상으로 Type 1 pro-collagen 합성을 조사하였다. Porcine elastase 저해 활성은 시료의 농도 31.2, 62.5, 125, 250 및 500 μg/mL의 농도에서 농도 의존적으로 활성을 나타내었으며, 각각의 활성은 7.5, 10.6, 15.7, 22.9, 36.2%로 나타내었으며, 표준시료인 Urosolic acid와 비교하여 높은 활성을 나타내었다 (Fig. 3).

Figure 3. Inhibitory effect of giant mushroom (GME) against porcine elastase activity. Urosolic acid was used as a positive control. Each value is expressed as mean ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control.

또한, 탄력 및 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 Type 1 pro-collagen의 합성 촉진 효능평가를 Fig. 4에 나타내었다. 그 결과를 보면, 시료 500 μg/mL의 농도에서 434 ng/mL으로 조사되었고, 시료를 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때, 농도 의존적으로 pro-collagen 합성량이 증가함을 확인하였다. 피부의 진피층에는 Type I collagen과 Type III collagen이 각각 80~85%, 15~20%의 비율로 존재하며, 다음의 과정을 통해 생성된다. 진피 섬유아세포에서 발현된 pro-alpha 1과 pro-alpha 2의 사슬 (chain)은 삼중나선 (triple helix) 구조를 이루면서 collagen의 전구체인 pro-collagen으로 만들어져 세포 밖으로 분비되고, 다른 pro-collagen과 결합하여 완전한 형태의 Type I collagen을 생성한다. 또한, matrix metalloproteinase (MMP) 중 하나인 collagen 분해 효소 collagenase를 생성하여 collagen의 양을 조절하는 것으로 알려져 있다 [29]. 이러한 결과로 바탕으로 대왕버섯 추출물은 주름 개선 효과가 뛰어난 소재임이 입증되었고, 자외선 차단, 피부노화 및 미백, 피부보호 등과 관련된 화장품 소재뿐만 아니라 먹는 화장품, 이너뷰티의 새로운 향장품 원료로써의 가능성을 제시하였다.

Figure 4. Type 1 pro-collagen synthesis of CCD-986sk human dermal fibroblast treated with giant mushroom (GME). The type 1 pro-collagen contents on culture media were determined by ELISA method. Each value is expressed as mean ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test *p < 0.05, **p < 0.01 compared with control.
3.4. LPS로 유도된 NO 생성과 세포독성효과

GME의 면역조절 반응을 알아보기 위해 대식세포인 RAW 264.7 cell을 대상으로 NO 측정을 조사하였고, LPS로 염증반응을 유도하여 황염증 효과를 입증하였다. NO의 과발현은 염증과 암 발생의 질환을 유도하고, 특히 만성염증이 발생한 부위에서 암이 발생하는 경향성이 높다고 보고되어 있다 [30]. 활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 역할을 하는 NO 생성에 대왕버섯 추출물이 LPS에 의해 유도된 RAW264.7 macrophage로부터 NO 생성 억제 결과를 Fig. 5에 나타내었다. GME의 농도별로 시료를 24 h 처리한 후 배양 상층액 내의 Nitrate 양을 측정하였다. 그 결과를 보면 시료의 농도가 25, 50, 100 및 250 μg/mL에서 각각 25.5, 24.7, 23, 20.4 μM로 조사되었고 농도 의존적으로 NO 생성을 저해하는 것으로 나타내었다.

Figure 5. Effect of giant mushroom (GME) on LPS-induced NO generation in RAW 264.7 cells. NO generation was investigated by measuring the accumulated nitrite. The cells were treated with or without 1 μg/mL of LPS in the absence or presence of various concentrations of GME for 24 h. Each value is expressed as mean ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test *p < 0.05, **p < 0.05 compared with control.

대왕버섯 추출물의 NO 생성을 억제하는 것이 세포 독성으로 인한 cell population의 저하에서 기인하는지 관찰하기 위해 CCK-8 assay kit을 사용하여 세포 생존률을 측정하였다. 그 결과를 살펴보면 높은 농도인 100 μg/mL에서 89%의 생존력을 나타내었고, 낮은 농도인 25 μg/mL에서는 98%의 생존력을 나타내었고, 이러한 결과로 미루어 짐작하기를 세포 독성에 의한 cell population의 저하에서 NO 생성이 억제되지 않는 것으로 판단된다 (Fig. 6).

Figure 6. Effect of giant mushroom (GME) on cell viability in LPS-stimulated of RAW 264.7 cell. Cell were treated with various concentration of the GME in a 96 well plate for 24 h, cell viability was determined by CCK-8 assay. Each value is expressed as mean ± SD of triplicate determinations. p-value: Students's t-test *p < 0.05, **p < 0.05 compared with control.

본 연구는 식용으로만 사용된 대왕버섯 (Pleuro nebrodensis)은 추출물의 화장품 원료 및 향장품 소재 적용을 위하여 항산화, 미백과 주름 개선 효과 및 항염증 활성을 조사하였다. 미백 활성으로는 α-MSH로 자극된 B16F10 mouse melanoma cell에 처리하여 멜라닌 합성량과 in vitro tyrosinase 저해 활성으로 미백 소재로서의 가능성을 입증하고자 하였다. Tyrosinase 저해 활성은 표준시료인 Arbutin과 비교하여 우수한 활성을 나타내었고 멜라닌 생합성 (melanogenesis) 저해 활성도 확인할 수 있었다. 주름 개선 효능으로는 porcine elastase 저해 활성으로 표준시료인 Urosolic acid와 비교하여 우수한 저해 활성을 나타내었고, 콜라겐 합성량도 콜라겐 전구체인 Type 1 pro-collagen을 측정한 결과 농도 의존적으로 콜라겐 합성량을 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 또한, LPS로 유도된 macrophage RAW264.7 cells을 대상으로 NO를 측정한 결과 농도 의존적으로 NO 생성을 저해하는 것으로 나타내었다. 위의 결과를 토대로 대왕버섯 추출물은 미백, 주름 개선 효과와 더불어 항염증 효과까지 있는 화장품 소재임이 증명되었고, 기능성 향장품 소재 및 항노화 관련 바이오 제품 소재로서의 가능성을 확인하는 계기가 되었다. 대왕버섯은 식용가치와 더불어 이너뷰티의 원료로서의 이용 가치가 있음을 시사하는 계기가 되었고, 차후 화장품 제형 적용에 관한 연구가 추가로 진행되어야 할 것으로 생각된다.

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