본 연구의 재료인 폐MDF는 2013년에 동화기업 (Incheon, Korea)에서 생산한 것을 사용하였으며, 폐MDF를 분쇄기(Cutting mill, Fritsch, Germany)로 분쇄하여 sieve size 1,000 μm를 통과한 분체를 실험에 사용하였다.

전처리에는 아염소산나트륨 (Daejung, Korea)을 사용하였고, 효소 당화에는 상업용 당화 효소 Cellic CTec3 (Novozymes, Denmark)를 사용하였다. 그리고 발효 실험은 jar fermenter (ST-M3-05, Fermentec, Korea)를 활용하였으며, 증류는 lab. scale의 연속식 증류장치 (Alc95-1.5L, Segang, Korea)로 에탄올을 농축하였고, 에탄올 함량은 밀도 비중계 (DMA 4500, Anton Paar, Austria)로 분석하였다.

발효에 사용한 균주는 일산실업㈜ 칠서에탄올공장에서 주정 생산용으로 사용하는 효모 (Saccharomyces cerevisiae IFOM-07)를 사용하였다. 그리고 효모의 배양은 YPD 액체배지[yeast extract (Difco, USA) 5 g/L, peptone (Difco, USA) 10 g/L, glucose (Junsei, Japan) 100 g/L, MgSO₄7H₂O (Junsei, Japan) 1 g/L, FeSO₄7H₂O (Junsei, Japan) 1 mg/L]에 접종한 후 32^oC에서 24시간 배양한 것을 starter로 사용하였고, starter 10 vol%를 폐MDF 당화액에 혼합하여 32^oC에서 96시간 발효하였다.

목질섬유소의 효과적인 전처리를 위해 분쇄한 폐MDF를 증류수에 침지하여 121^oC에서 25분 동안 열수 처리로 합성수지를 제거한 다음 건조한 것을 시료로 하였다. 삼각 플라스크에 시료 300 g과 0.5 M acetic acid buffer 3,000 mL을 넣고 아염소산나트륨 120 g과 아세트산 수용액 24 mL을 첨가 후 전처리를 하였다 [13]. 최적의 전처리 조건을 설정하기 위해 아염소산나트륨 농도, 반응 온도와 시간 등을 비교하여 아염소산나트륨 농도 3.3%, 온도 80^oC 조건에서 5~6시간 반응시켜 전처리를 하였다.

전처리한 폐MDF에 0.1N acetate buffer (pH 5.0)와 증류수를 가한 다음 pH 4.5~5.5로 조절하여 전처리 폐MDF 기질 농도를 4, 8 및 10%로 조제하였다. 당화에는 당화 효소 Cellic CTec3를 사용하였고, 효소 사용량은 기질 농도 대비 10%를 첨가 후 진탕 배양기에서 50^oC, 140 rpm 조건으로 120시간 동안 당화하여 폐MDF 당화액을 제조하였다.

전처리 폐MDF 당화액의 기질 농도 (4, 8, 12%)를 비교한 결과 8%로 제조한 폐MDF 당화액이 적합하였으며, 이를 기질로 발효 실험을 하기 위해 영양원 첨가 유무에 따른 결과를 비교하였다. 영양원을 첨가한 실험은 yeast extract 2 g/L, peptone 5 g/L, MgSO₄7H₂O 1 g/L을 첨가한 다음 autoclave를 이용하여 100^oC에서 60분 동안 살균한 후 32^oC로 냉각하였고, 영양원을 첨가하지 않은 실험은 영양원 첨가 없이 동일한 조건으로 살균 및 냉각하여 실험에 사용하였다. 그리고 발효 실험은 플라스크 실험 결과를 토대로 scale up하여 jar fermenter에서 실험을 병행하였다.

발효가 종료된 폐MDF 발효액을 농축하기 위해 증류장치를 활용하였다. 발효액을 여과 (200 mesh)한 다음 일산실업㈜ 부설기술연구소에 설치된 연속식 에탄올 증류장치를 이용하여 95% 이상의 에탄올로 농축하였다. 폐MDF로 바이오에탄올을 생산하기 위한 전체 공정은 Fig. 1과 같다.

Figure 1. Diagram of bioethanol production process using wMDF.

당화액의 당 농도를 분석하기 위해 syringe filter (0.2 μm)로 여과한 후 HPLC (High Performance Liquid Chromatography, Agilent 1260 series, USA)를 이용하였다. Column은 ZORBAX Carbohydrate Analysis (Agilent Technologies, 4.6×150 mm, 5 μm), 검출기는 RID (Refractive index detector)를 사용하였다. Column 온도는 30^oC, 샘플의 주입량은 10 μL, 이동상의 유속은 0.8 mL/min로 설정하였고, 이동상은 75% acetonitrile 용액을 사용하였다.

당화액의 당이 에탄올로 전환되는 것은 주정 산업에서 주로 활용하는 경시적 발효 패턴 분석법을 활용하였다. 발효액이 들어있는 삼각플라스크의 무게를 시간별로 측정하여 이론적으로 당이 에탄올로 전환될 때 함께 발생된 CO₂의 무게를 계산하여 간접적으로 생성된 에탄올 함량을 측정하는 방법이다.

그리고 최종적으로 발효가 끝난 발효액과 jar fermenter 실험의 발효액은 단식 증류방법 (국세청 주류분석규정)으로 증류한 다음 이를 밀도 비중계로 에탄올 농도를 측정하였으며, 95% 이상으로 증류한 증류액은 밀도 비중계로 직접 측정하였다.

기질 농도 증가에 따른 점도 변화를 분석하기 위해 점도계 (DV2T, Brookfield, USA)로 측정하였으며, pH를 측정하기 위해 pH meter (Orion 3 star, Thermo, Singapore)를 사용하였다. 그리고 발효액의 효모 개체수는 특정 슬라이드 (Heamacytometer, Marienfeld, Germany)를 사용하여 일정량의 시료를 주입한 다음 현미경 (BX40, Olympus, Japan)으로 조류나 효모와 같은 개체수를 직접 계수하는 heamacytometer로 측정하였다.

모든 분석 결과는 5회 반복 측정한 분석치를 평균값으로 계산하여 나타내었다.

폐MDF 당화액의 적합한 기질 농도를 확인하기 위해 4, 8 및 10% 농도로 각각 제조한 다음 효소 당화를 실시하였다. 이들 당화액의 당 조성, 점도 및 pH 등을 분석하여 발효 기질로의 특성을 비교하였으며, 결과는 Table 1과 같다.

먼저, 당 분석결과 효모가 이용 가능한 glucose가 가장 높은 함량을 보였으며, 그리고 xylose가 검출되었다. 그 외 rhamnose, arabinose, galactose 및 cellobiose는 흔적 이하였다. 그리고 기질 농도 증가에 따라 glucose와 xylose 함량은 증가하였으나 기질 농도대비 분해된 당 함량은 점차 감소하였다. 또한, 기질 농도 증가에 따라 점도가 급격히 증가하였고, 특히 10% 기질 농도에서는 점도가 13.2 cP로 높았다. 그리고 효모의 생육 및 증식에 적합한 pH는 통상적으로 pH 4.0~5.5이며, 당화액 pH가 4.2~4.5이기 때문에 pH 조절은 불필요한 것으로 확인되었다. 분석결과 당화율, 점도 등 발효하기에 적합한 기질 농도는 8%로 확인되어 이를 사용하여 발효 실험을 진행하였다.

Table 1 . Analysis results of enzymatic saccharification liquid using wMDF

DS1)	Sugar (mg/L)						Viscosity (cP/19oC)	pH
	Glucose	Xylose	Rhamnose	Arabinose	Galactose	Cellobiose
4%	27,530	5,554	ND2)	ND	ND	ND	2.1	4.45
8%	55,368	8,063	ND	ND	ND	ND	6.2	4.40
10%	68,089	10,594	ND	ND	ND	ND	13.2	4.25

¹⁾Dry substance.

²⁾Not detected.

폐MDF 당화액에 별도의 영양원 첨가 없이 살균 및 냉각을 한 다음 배양해 둔 효모 (Saccharomyces cerevisiae IFO-M-07)를 접종하여 96시간 동안 발효를 하면서 경시적인 분석을 하였다.

실험결과는 Fig. 2와 같이 발효시간이 지속될수록 에탄올 함량과 발효비율이 증가하는 것으로 나타났으며, 최종 발효비율은 약 83~84%인 것으로 확인되었다. 영양원을 첨가하지 않았기 때문에 발효의 진행이 다소 늦었으나 폐MDF 당화액의 glucose는 대부분 에탄올로 전환되는 것으로 분석되며, 약 56시간 경에 발효가 종료되는 것이 확인되었다.

에탄올 발효가 다소 지연되는 것은 폐MDF 당화액에는 효모의 생장에 필요한 질소원, 무기물 등의 영양원이 부족하기 때문인 것으로 분석된다. 따라서 속성 발효를 유도하고 발효수율을 최적화하기 위해서는 영양원을 보충하여 효모의 생장 조건을 개선할 필요성이 있을 것으로 판단된다.

폐MDF 당화액에는 효모의 생장에 필요한 영양원이 부족하기 때문에 영양원 (yeast extract 2 g/L, peptone 5 g/L, MgSO₄7H₂O 1 g/L)을 첨가하고 살균 및 냉각을 하였다. 여기에 배양해 둔 효모를 접종한 다음 발효를 하면서 경시적으로 분석하였다.

실험결과는 Fig. 3과 같이 발효시간이 지속될수록 에탄올 함량과 발효비율이 급격히 증가하였으며, 최종 발효비율은 약 85~86%에 이르는 것으로 확인되었다. 영양원을 첨가하지 않은 것과 비교하면 발효의 진행속도가 월등히 빨랐으며, 약 24시간 경에 발효가 종료되는 것으로 나타났다.

최종 실험결과는 Table 2와 같으며, 영양원을 첨가한 것이 영양원을 첨가하지 않은 것보다 발효비율은 약 1% 높았으며, 효모 개체수는 영양원을 첨가한 실험에서 약 2배 이상으로 많았다. 발효속도는 영양원을 첨가한 실험에서 월등히 빨랐으나 최종 발효비율의 차이가 작은 것은 초기 발효 기질 농도가 낮기 때문인 것으로 판단된다. 그러나 기질 농도를 8%보다 높일 경우 급격한 점도 상승으로 오히려 당화율이 감소하였으므로 이후 실험에서 기질 농도를 8%로 유지하였다.

플라스크 발효실험 결과를 바탕으로 scale up하여 jar fermenter를 이용하여 발효실험을 하였다. 당화액에 효모의 생장에 필요한 영양원 (yeast extract 2 g/L, peptone 5 g/L, MgSO₄7H₂O 1 g/L)을 첨가하고 살균 및 냉각을 실시하여 효모를 접종한 다음 발효를 하였다. 발효는 96시간 동안 진행하면서 glucose 함량, 에탄올 함량, 효모 개체수 및 pH 등을 분석하였다.

Jar fermenter에서 실험한 결과는 Table 3과 같이 최종 에탄올 함량은 25.40 g/L, 발효비율은 86.64%, 총 잔존환원당 (residual total sugar, RTS)은 0.2 g/L로 분석되어 대부분의 glucose가 에탄올로 전환된 것이 확인되었다. 이는 주정산업에서 주로 사용하는 전분질원료 (타피오카 및 쌀, 발효비율: 85~86%)와 비교하더라도 발효비율이 떨어지지 않는 것으로 나타났다.

Figure 2. Results of fermentation profiles when the nutrients were not added.

Figure 3. Results of fermentation profiles when the nutrients were added.

Table 2 . Results of fermentation experiments using wMDF

Strain	TS1) (g/L)	RTS2) (g/L)	Alcohol (g/L)	FR3) (%)	YN4) (cells/mL)	pH
Not added nutrients	59.90	0.6	26.30	85.82	20×106	3.85
Added nutrients	59.90	0.8	26.54	86.60	45×106	4.10

¹⁾Total sugar (glucose content before fermentation).

²⁾Residual total sugar (glucose content after fermentation).

³⁾Fermentation ratio = [alcohol (g/L)÷TS (g/L)÷0.6439 (factor)÷0.7947 (density)]×100.

⁴⁾Yeast number.

Table 3 . Results of jar fermenter fermentation experiments using wMDF

Strain	TS1) (g/L)	RTS2) (g/L)	Alcohol (g/L)	FR3) (%)	MPD4) (g/Lh)	OPD5) (g/Lh)	YN6) (cells/mL)	pH
Fermenter	57.29	0.2	25.40	86.64	1.78	1.05	30×106	4.01

¹⁾Total sugar (glucose content before fermentation).

²⁾Residual total sugar (glucose content after fermentation).

³⁾Fermentation ratio = [alcohol (g/L)÷TS (g/L)÷0.6439 (factor)÷0.7947 (density)]×100.

⁴⁾Maximum ethanol productivity (ethanol 21.38 g/L, 12 h).

⁵⁾Overall ethanol productivity (ethanol 25.27 g/L, 24 h)

⁶⁾Yeast number.

그리고 발효액 중의 효모 개체수는 30×10⁶ cells/mL로 분석되어 일반적인 주정산업에서 회분식 발효공정의 대수증식기와 비교하면 50% 정도인 것으로 나타났다 [14]. 그러나 효모 개체수가 적어도 발효비율에 영향이 없는 것은 초기 발효기질의 발효성 당 함량이 낮기 때문인 것으로 사료된다.

Fig. 4와 같이 영양원 첨가로 속성 발효가 이뤄져 24시간경에 발효가 종료되는 것으로 확인되었다. 최적 발효조건에서 최대 에탄올 생산성은 1.78 g/Lh (에탄올 함량 21.38 g/L, 12 h) 이었으며, 전체 에탄올 생산성은 1.05 g/Lh (에탄올 함량 25.27 g/L, 24 h)로 분석되었다. 일반적으로 주정산업에서 사용하는 전분질 원료의 에탄올 생산성은 현미 0.68 g/Lh, 쌀보리 1.03 g/Lh, 타피오카 1.28 g/Lh로 보고되고 있으며, 그리고 통상적으로는 0.58~0.64 g/Lh로 알려져 있다 [14,15]. 실험결과에서 보듯이 전분질 원료를 사용한 에탄올 생산성과 비교하더라도 폐MDF 당화액의 발효 생산성이 뒤지지 않는 것이 확인되었다. 그리고 이후 96시간 동안 발효를 진행하였으나 에탄올 증가량은 미미하였으므로 24시간 내에 발효를 완료할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 폐MDF 당화액을 이용한 최적 발효조건은 교반속도 100~150 rpm, pH 4.0~5.0 그리고 발효시간 24시간 발효하면 충분하다는 것이 확인되었다.

따라서 폐MDF를 활용하여 회분식 발효공정으로 scale up 실험 (pilot plant, demo scale)을 위해서는 경제적인 발효조용량을 결정하여야 한다. 상기 결과로 에탄올 발효가 완료된 24시간을 기준으로 생산성을 평가하여 발효조를 설계한다면 기존의 회분식 주정발효와 비교하여 1.6 (1.05/0.64)배의 생산성이 향상되어 실질적으로 약 40%의 발효조 용량을 줄일 가능성을 확인하였다 [14].

폐MDF 발효액에는 약 3~4%의 에탄올이 함유되어 있어 바이오에탄올로 사용하기 위해서는 농축하는 공정이 필요하다. 이는 일산실업㈜ 부설기술연구소에 설치된 증류장치를 이용하여 Table 4와 같이 에탄올 함량 95.37%의 바이오에탄올로 농축하였으며, 이때 증류 폐액의 에탄올 함량은 0.03%로 분석되어 정상적인 증류가 진행된 것을 확인하였다.

Figure 4. Results of fermentation profiles in jar fermenter when the nutrients were added.

Table 4 . Ethanol contents after distillation

Strain	Ethanol contents (%)	Remarks
Bioethanol	95.37
Distiller stillage	0.03