1차 코팅은 외부 공기 유입의 차단을 목적으로 하였으며 산소 차단성이 우수하며 식품 및 의약품용도로 사용할 수 있는 기제로하여, 카르복시메틸셀룰로오스 (carboxymethylcellulose,CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스 (hydroxyethylcellulose, HEC), 검 (gum)계열의 폴리머로잔탄검 (xanthan gum, XG), 구아검 (guar gum, GG), 합성 폴리머계열로 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴 (carbopol)의 폴리머 (polymer)들을 1차 박막코팅제 후보군으로 선정하였다. 후보 폴리머들은 L. acidophilus IDCC3302 배양액 100 mL 당 각각 0.2 g 씩 첨가하고, 1차 박막코팅된 프로바이오틱스를 분산매에 현탁시켜, −70℃ deep freezer에 3시간 동안 냉동시켰다. 냉동 1차 박막코팅 프로바이오틱스 샘플을 동결 건조하여 분말화시킨 후, 생존균수를 측정하여 가장 높은 생존율을 보인 실험군을 1차 박막코팅 결합제로 선정하였으며, 선정된 폴리머는 다양한 농도에서의 평가를 통해 최적 농도를 탐색하였다.

2차 코팅은 수분 유지 및 장 점착력을 높일 목적으로 수분활성 조절기능의 천연 고분자물질인 히알루론산이 적용되었다. L. acidophilus IDCC3302의 표면 부착 1차 코팅제를 선정한 후, 2차 코팅제로서 히알루론산의 최적 농도를 산출하기위해 1차 코팅제의 농도에 따른 히알루론산 농도를 조합하여 L. acidophilus IDCC3302의 2차 코팅 원료를 준비하고, 동결 건조하여 분말화시킨 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하여 최종 선정하였다. 구체적으로 상기 L. acidophilus IDCC 3302 배양액 100 mL 당 1차 코팅제 폴리머를 0.1 g 내지 0. 5g 씩 첨가하고, 히알루론산은 0.001 g 내지 0.005 g 을 첨가하였다.

3차 코팅제는 미로구조를 만들어 외부 수분 및 물질의 침투 차단을 하는 다공성 코팅물질로서 알기네이트 (alginate), 말토덱스트린 (maltodextrin, MD), 키토산 (chitosan), 전분 (starch), 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG)을 선정 대상으로 하였다. 2차 코팅된 L. acidophilus IDCC3302 구조체에 상기 3차 코팅제를 균주 배양액 100 mL 당 0.1 g 되게 첨가하여 균일화시킨 후 3차코팅이 되도록 하였다. 3차 코팅된 균체를 분산매에 현탁시켜, −70℃ deep freezer에 3시간 동안 냉동시켰다. 냉동된 3차 코팅 프로바이오틱스 샘플을 동결건조하여 분말화시킨 후, 생존균수를 측정하여 가장 높은 생존율을 보인 실험군을 3차 코팅제로 선정하였다. 선정된 3차 코팅제와 2차 코팅제인 히알루론산과의 가장 최적의 결합효율을 구성하기 위해 히알루론산 농도에 따른 3차코팅제 농도를 조합하여 L. acidophilus IDCC3302의 3차 코팅 원료를 조제한 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하여 최종 선정하였다. 배양액 100 mL 당 히알루론산은 0.001 g 내지 0.005 g 을 첨가하고, 3차 코팅제를 0.1 g 내지 0.5 g을 첨가하였다.

3차 코팅제의 공극을 채울 4차 코팅제 단백질의 후보로 탈지분유, 유청단백, 분리대두단백을 선정하였다. 4차 코팅제 단백질 선정 및 최적농도를 산출하기 위해 L. acidophilus IDCC3302 배양액 100 mL 당 2 g 내지 10 g을 각각 첨가하여 4차 코팅 원료를 조제하고 동결건조하여 분말화시킨 후, 생균수를 MRS agar plate에서 각각 평가하여 4차 코팅제 및 최적농도를 최종 선정하였다.

4중 코팅 L. acidophilus IDCC3302의 성상을 조제 공정에 따라 단계적으로 전자현미경촬영을 통해 구조적 분석을 하였다.

4중 코팅 L. acidophilus IDCC3302의 대량 생산시 재현성을 확인하기 위해, 비코팅 L. acidophilus IDCC3302와 생산성을 비교하였다. 생산규모는 1 ton 발효탱크에서 37℃, overnight (16시간) 배양을 하였다. 균체 회수 후, 1차~4차 코팅제를 처리하여 4중 코팅 프로바이오틱스 원료를 조제하였다. 대조군인 비코팅 원료는 통상적인 원료 조제공정에 따라 조제하였다.

4중 코팅에 따른 L. acidophilus IDCC3302의 내산성 평가를 위해 MRS 배지에 10% HCl 를 적하하여 pH를 2.3, 2.5으로 적정한 다음, 멸균하여 사용하였으며, 시료 1 g을 각각의 pH로 보정된 MRS 배지에 넣어 0시간, 1시간, 2시간 동안 반응시킨 후, 생균수 분석을 하였다.

4중 코팅에 따른 L. acidophilus IDCC3302의 담즙산에 노출 시 내담즙산성을 시험관 환경에서 평가하기 위해 담즙산 0.3%가 첨가되지 않은 배지와 첨가된 배지를 멸균하여 사용하여 각각의 배지에 4중 코팅된 프로바이오틱스와 비코팅, 단일, 2중, 3중 코팅 시료 1 g을 각각 접종하고, 5시간 동안 반응시킨 후, 0.9% NaCl 용액을 희석수로 사용하여 생균수 분석을 하였다.

4중 코팅된 L. acidophilus IDCC3302의 동결 및 열 대한 안정성을 검토하기 위해 4중코팅군과 비코팅, 단일, 2중, 3중 코팅 프로바이오틱스군을 –70℃와 50℃에서 3시간 노출시켜 건조시켜 원료를 조제하였다. 이를 위해 균체 회수 후, 1차~4차 코팅제를 처리하여 원료 조제하였다. 대조군인 비코팅 원료는 통상적인 원료 조제공정에 따라 조제하였다. 건조된 각각의 시료 1 g을 채취하여 생균수 분석을 하였다.

4중 코팅된 군과 비코팅, 단일, 2중, 3중 코팅 실험군을 365일 동안 4, 15, 25, 37℃에서 보관 후, 시간 경과에 따라 원료 1 g 당 생균수를 측정하여 온도 별 경시 안정성을 측정하였다.

1차 코팅은 외부 공기 유입의 차단을 목적으로 하였으므로 1차 박막코팅제로는 프로바이오틱스 표면 접합력이 우수하여 코팅시 외부공기의 유입을 차단하고 2차 코팅제인 히알루론산과의 결합력이 우수한 바인더 (binder)를 선정하고자 하였다. L. acidophilus IDCC3302 배양액에서의 생존균수 측정 시험 결과, 의약품 및 식품에서 결합제로 많이 사용되고 있는 폴리비닐피롤리돈이 다른 폴리머보다 상대적으로 높은 생존율을 나타내어 제조공정에서 유입되는 수분, 공기등의 위협인자에 대해 효율이 높은 방어기작을 나타내어 1차 박막코팅제로 선정되었다 (Table 1). 선정된 폴리비닐피롤리돈의 중합도에 따라 폴리비닐피롤리돈 K-25, K-30, K-90으로 구분하여, L. acidophilus IDCC3302 배양액에서의 생존균수를 측정한 결과, 폴리비닐피롤리돈 K-25를 L. acidophilus IDCC3302 균체에 0.1% 농도를 사용하였을 때 상대적으로 가장 높은 생존균수를 나타내었다 (Table 2).

Table 1 . The first thin film coating agent selection

	None	CMC	HEC	XG	GG	PVPK-30	Carbopol
Viability (%)	33.4	51.4	48.9	45.7	48.6	72.5	62.5

CMC, Carboxymethyl cellulose; HEC, Hydroxyethylcellulose; XG, Xanthan gum; GG, Guar gum; PVPK-30, Polyvinylpyrroridone K-30

Table 2 . Optimum concentration of the first thin film coating agent selection

	Viable count
	PVPK-25 (×108 CFU/g)	PVPK-30 (×108 CFU/g)	PVPK-90 (×108 CFU/g)
None	200	210	225
0.1 w/v (%)	680	560	310
0.2 w/v (%)	520	420	205
0.3 w/v (%)	460	350	140
0.4 w/v (%)	310	110	60
0.5 w/v (%)	250	80	35

PVPK-25, Polyvinylpyrroridone K-25; PVPK-30, Polyvinylpyrroridone K-30; PVPK-90, Polyvinylpyrroridone K-90

2차 코팅은 수분 유지 및 장 점착력을 높일 목적으로 설계되었다. 따라서 2차 코팅제는 수분활성 조절기능있고 장 점착력이 있는 천연 고분자물질인 히알루론산으로 선정하였으며 최적 농도를 산출하기 위해 1차 코팅제인 폴리비닐피롤리돈 K-25의 농도에 따른 히알루론산 농도를 조합하여 L. acidophilus IDCC3302 배양액에서의 생존균수 측정 시험 결과, 폴리비닐피롤리돈 K-25 0.1 w/v (%)와 히알루론산 0.001 w/v (%)를 사용하여 2차 코팅한 L. acidophilus IDCC3302의 발현균수가 상대적으로 가장 높게 평가되어 최적 농도로서 도출되었다 (Table 3).

Table 3 . Optimum concentration combination of polyvinylpyrroridone K-30& hyaluronic acid selection

PVPK-25 dose w/v(%)	Viable count
	Hyaluronic acid dose w/v(%) (×108 CFU of L. acidophilus IDCC 3302/g)
	None	0.001	0.002	0.003	0.004	0.005
None	200	350	335	280	270	150
0.1	680	760	715	695	630	570
0.2	520	630	570	550	490	455
0.3	460	515	520	480	475	430
0.4	310	430	420	350	330	280
0.5	250	380	370	310	260	180

2차 코팅된 균체에 다공성 입자성을 가진 기제의 코팅을 통해 미로구조를 만들어 외부 수분 및 이물질의 유입을 차단시키고자 하였으며 이를 위한 최적의 3차 코팅제를 선정하였다. L. acidophilus IDCC3302 배양액에서의 생존균수 측정 시험 결과, 3차 코팅제의 마이크로캡슐화 효과가 상대적으로 가장 높은 기제로 말토덱스트린이 선정되었다 (Table 4). 선정된 3차 코팅제인 말토덱스트린과 2차 코팅제인 히알루론산과의 가장 최적의 결합을 구성하기 위해 히알루론산 농도에 따른 말토덱스트린 농도를 조합하여, L. acidophilus IDCC 3302 배양액에서의 생존균수 측정 시험 결과, 히알루론산 0.001 w/v (%)와 말토덱스트린 0.4 w/v (%)를 사용하여 3차 코팅한 L.acidophilus IDCC3302의 발현균수가 상대적으로 가장 높게 평가되었다 (Table 5).

Table 4 . The third coating agent selection

	Alginate	Maltodextrin	Chitosan	Starch	PEG
Viability(%)	74	85	71	65	68

PEG, polyethyleneglycol

Table 5 . Optimum concentration combination of hyaluronic acid & maltodextrin selection

Hyaluronic acid dose w/v(%)	Viable count
	Maltodextrin dose w/v(%) (×108 CFU of L. acidophilus IDCC 3302/g)
	None	0.001	0.002	0.003	0.004	0.005
None	200	350	335	280	270	150
0.1	680	760	715	695	630	570
0.2	520	630	570	550	490	455
0.3	460	515	520	480	475	430
0.4	310	430	420	350	330	280
0.5	250	380	370	310	260	180

3차 코팅제로 말토덱스트린 0.4%를 최적 농도로 선정한 후, 다공성 입자구조를 가진 말토덱스트린의 공극을 채워 위산과 담즙산으로부터 유산균을 보호할 목적으로 단백질의 종류를 선발하였다. 최적농도를 산출하기 위해 1~3차 코팅된 IDCC3302 균체와 후보 단백질 농도를 조합하여, L. acidophilus IDCC3302 배양액에서의 생존균수 측정 시험 결과, 유청단백을 6 w/v (%) 사용하였을 때 4차 코팅한 L. acidophilus IDCC3302의 발현균수가 상대적으로 가장 높게 평가되었다 (Table 6).

Table 6 . Selection of quaternary coating proteins and optimum concentration calculation

w/v (%)
	Viable count
	Powdered skim milk (×108 CFU/g)	Milk serum protein (×108 CFU/g)	Soy protein isolate (×108 CFU/g)
None	200	200	200
2	210	280	250
4	225	325	265
6	290	380	260
8	310	310	275
10	250	305	280

조제한 4중 코팅 L. acidophilus IDCC3302의 성상을 조제 공정에 따라 단계적으로 전자현미경 촬영을 통해 구조적 분석을 한 결과, 유산균에 폴리비닐피롤리돈 K-25를 혼합하는 경우에, 유산균체 표면을 폴리비닐피롤리돈 K-25가 필름과 같은 박막을 형성하면서 코팅된 것을 관찰 할 수 있었다 (Fig. 1 (b)). 또한 폴리비닐피롤리돈 K-25와 히알루론산이 혼합되면서 구조적으로 히알루론산 구조가 더욱 조밀해지는 현상을 관찰할 수 있었으며 (Fig. 1 (c)), 다공성 입자구조인 말토덱스트린을 첨가하여 외부 수분과 온도가 쉽게 균체에 전달되지 않게 하고 (Fig. 1 (d)), 마지막으로 유청단백으로 코팅을 진행하면서 균체가 외부로 노출되지 않게되었다 (Fig. 1 (e)).

Figure 1. Field emission scanning electron microscope (FE-SEM) structure analysis according to coating step. (a):Control (b): 1^st coating, (c): 2^nd coating, (d): 3^rd coating, (e): 4^th coating.

소화관 중 위 (stomach)에 프로바이오틱스 제제가 통과할 때 위산 (gastric acid)에 노출되게 되는데 이러한 환경을 시험관 조건에서 구현하여 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅, 3중 코팅 프로바이오틱스군과 4중 코팅 프로바이오틱스군의 내산성을 비교하였다. 그 결과, pH 2.3과 2.5로 2시간 노출시켰을 때, 비코팅 L. acidophilus IDCC3302에 비해 4중 코팅된 군이 약 40%이상의 높은 내산성을 나타내었다 (Fig. 2).

Figure 2. Acid resistance evaluation result of non-coated, single, double, triple, and quadruple coating IDCC3302. (a): pH 2.3, (b): pH 2.5.

담즙산 (bile acid)은 간 (liver)에서 만들어져 담도로 빠져나와 소장 (small intestine)으로 흘러나오고 소장 말단의 회장 (ileum)에서 다시 95%흡수되어 다시 간으로 들어가는 장관 순환을 한다. 이 과정에서 소장에 정착한 프로바이오틱스에 영향을 미친다. 이러한 환경을 시험관 조건에서 구현하여 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅, 3중 코팅 프로바이오틱스군과 4중 코팅 프로바이오틱스군의 내담즙산성을 비교하였다. 그 결과, 4중 코팅된 실험구가 비코팅, 단일, 2중, 3중코팅 실험군에 비교하여 상대적으로 높은 내담즙산성을 나타내었다 (Fig. 3).

Figure 3. Bile tolerance evaluation result of non-coated, single, double, triple, and quadruple coating IDCC3302.

프로바이오틱스의 원료 조제방식 중 균일한 입자 모양을 만들거나, 분무건조를 하기 위해서는 액상으로 캐리어 (carrier)에 분무후 50℃ 정도에서 공기 중에서 건조하게 된다. 이때 프로바이오틱스는 대부분 열에 약하거나 공기에 취약하기 때문에 장시간 노출시 사멸하게 된다. 비코팅, 단일 코팅, 2중 코팅, 3중 코팅 프로바이오틱스군과 4중코팅된 프로바이오틱스의 열에 대한 안정성을 평가한 결과, 동결 시 4중 코팅된 군의 생존율이 비코팅 군의 생존율 보다 46% 증가하였고, 50℃ 열풍건조 동안 4중 코팅된 군의 생존율이 비코팅 군의 생존율 보다 43% 증가된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).

Figure 4. Viability test results of non-coated, single, double, triple, and quadruple coating IDCC3302 on 50℃ hot air drying and on -70℃ freeze-drying

4, 15, 25, 37℃ 보관을 365일간 지속한 후, 4중코팅된 군과 비코팅 군 원료의 생존균수를 분석한 결과, 4중코팅된 군이 비코팅 군에 비하여 각 온도 별로 약 28, 34, 28, 29% 생존율이 높았다. (Fig. 5).

Figure 5. Viability of non-coated, single coating, double coating, triple coating, and quadruple coating during 12 months storage period at (a): 4, (b): 15, (c): 25, and (d): 37℃.

본 연구에서 개발한 4중 코팅 기술을 Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantrum, Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium 에 대하여 적용한 결과, 본 연구의 L. acidophilus IDCC3302에 대한 연구 결과와 유사하게, 4중 코팅을 한 경우가 비코팅한 경우 대비 내산성, 내담즙산성, 동결 및 열풍 건조 시 생존율, 온도별 안정성이 개선됨을 확인하였다 [24].

프로바이오틱스는 섭취하여 장까지 살아서 도달한 후 정착, 생장을 통해 최대의 건강 이득 (health benefit)을 제공할 수 있다. 위와 십이지장을 거치면서 여러 가지 생물학적 소화반응을 견뎌 내고 회장과 같은 소장의 말단이나 대장에 도달하는 것이 중요하다. 제조 공정은 배양, 회수, 동결건조의 과정으로 이루어지는데, 배양 후 공정에서 산소노출을 최소화하는 것이 균의 품질을 유지하는 것이다. 더불어 공기 중의 수분, 온도 조건 등은 균의 저장과 안정성 및 2차 프로바이오틱스의 제조 과정에서 가공 안정성에 많은 영향을 미친다. 따라서 고품질의 균주가 되기 위해서는 섭취 시 내산성 및 내담즙성이 (체내 안정성) 강화되어야 하며, 높은 가공 및 유통 안정성을 위한 보호장치가 요구된다 [2].

본 연구에서 제시한 프로바이오틱스의 4중 코팅 기술은 프로바이오틱스의 내산성 및 내담즙성 (체내 안정성)을 강화하여, 저온 또는 고온으로 인한 사멸을 막을 수 있음이 확인되었다. 따라서 이 기술을 산업 현장에서 프로바이오틱스 건강기능식품 등 제품 생산에 활용할 경우, 프로바이오틱스 균주의 높은 장내 정착률과 유통과정에서의 안정성 유지를 통해 프로바이오틱스의 기능성과 품질을 보장하여 제품 경쟁 력을 높이는 데 기여할 것으로 기대된다.