pISSN 1225-7117
eISSN 2288-8268
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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2019; 34(2): 85-90
Published online June 30, 2019 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.2.85
Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.
Hye Won Kawk1, Gun He Nam1, Kyung Jo Jo1, Ye Seul Park1, Sang Yung Kim2, and Young Min Kim1,*
1Department of Biological Science and Biotechnology, Hannam University, Daejeon 34054, Korea
Correspondence to:*Department of Biological Science and Biotechnology, Hannam University, Daejeon 34054, Korea Tel:
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암은 무작위한 세포의 증식과 전이에 의해 발병하는 질병으로, 흡연, 식습관과 같은 외부적 요인과 돌연변이와 같은 내부적 요인으로 인해 발생한다 [1]. 암은 높은 발병률을 나타내는 질환으로 선진국에서 가장 큰 사망의 원인으로 손꼽힌다 [2]. 그 중 대장암은 전 세계적으로 발병률 높은 악성종양 중 하나로 선진국을 비롯하여 우리나라에서도 매년 증가하고 있다 [3,4]. 대장암의 증상으로 설사와 변비가 교대로 발생하며 대변에서 점액과 혈액이 나타난다. 결장경색증상과 더불어 빈혈이 생기거나 체중이 감소하고 복진상 덩어리가 만져지는 등의 증상이 수반된다 [5]. 대장암은 주로 암을 절제하는 외과적 수술을 비롯한 항암제 또는 방사선치료가 병행되나, 문제점으로 항암제 내성이나 면역력 저하와 같은 부작용이 수반된다 [6]. 이러한 이유로 인체에 무해한 천연물질의 효능을 이용하여 항암효과를 지닌 신규생리활성물질을 개발함으로써 항암치료의 부작용을 줄이고, 항암효과로 다양한 기전을 통해 선택적으로 암세포의 생장과 증식을 억제하고 제거하기위한 선행연구들이 이루어지고 있다 [7]. 양제근은 한방에서 소리쟁이 뿌리를 나타내며, 대변 조결, 황달, 토혈, 기능성자궁출혈 등의 치료제로 이용된다 [8]. 미국에서는 양제근의 침출액을 이용하여 피부암을 치료한 보고가 있으며, 양제근의 다양한 생리활성물질은 항균, 항산화활성, 항염증효과가 나타남을 증명하였다 [9-11]. 증명되어진 항산화효과를 토대로 양제근의 apoptosis에 의한 항암효과를 기대할 수 있으나, 양제근에 의한 대장암세포에서의 apoptosis 효과는 확인된 바가 없다 [12]. 따라서, 천연소재를 이용한 새로운 항암물질 개발이 이루어짐으로써 천연추출물이 apoptosis를 통해 항암효과를 유도하는 연구가 진행되고 있다. Apoptosis는 프로그램 된 세포죽음으로 세포가 제대로 사멸하지 않으면 돌연변이로 인해 암으로 진행될 수 있기 때문에 매우 중요한 과정이다 [13]. Apoptosis는 크게 extrinsic pathway와 intrinsic pathway로 나뉘며, Apoptosis의 intrinsic pathway에는 여러가지 경로와 단백질이 관여한다 [14,15]. 상호조절 단백질 중 하나인 Akt (serine/threonine kinase)는 세포증식이나 분화, 성장에 관여하며 Bax와 Bak 등 proapoptotic 단백질의 발현을 저해하여 미토콘드리아의 막 투과성을 정상적으로 유지함으로써 apoptosis를 억제한다고 알려져 있다 [16]. 또한 Akt는 활성화되는 Mdm2 (Murine Double Minute 2)를 인산화 시켜 p53의 ubiquitination을 유도하여 불필요한 세포사멸을 억제한다 [17]. Mdm2의 영향을 받은 p53은 전사인자 (Transcription factor)로써 세포사멸에 관여하는 유전자 발현을 조절한다 [17,18]. 이와 같이 Akt/mdm2 pathway를 통해 영향을 받아 Caspase cascade를 유발하여 Effector caspase인 casepase-3의 활성을 통해 apoptosis 가 유발된다 [19]. 따라서 본 연구는 양제근 추출물 (RJE)를 처리하여 HCT116대장암세포에서 Cell cycle의 arrest를 확인하여, 나타난 세포독성이 apoptosis에 의함을 확인하고자 하였으며, 본 기작에 이용되는 Akt, Mdm2, p53 등의 신호전달 분자의 경향을 확인하여 apoptosis의 intrinsic pathway를 거치는 것을 증명하고자 하였다.
실험에 사용된 양제근의 원산지는 대한민국 경상북도 영천이며, 한약재종합쇼핑몰 한약재시장에서 구입하였다. 양제근 100 g에 95% 에탄올 800 mL를 가하여 72시간 동안 상온에서 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 양제근을 감압 농축기를 이용하여 감압 농축시킨 뒤 농축된 추출물은 −86°C에서 보관하였다. 농도별 RJE을 상기 추출물을 동일 용량의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 만들었으며 -4°C에서 냉동 보관하여 사용하였다. LY294002 (20 mM)와 Nutlin-3 (20 mM)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, DMSO로 희석시켜 사용하였다.
HCT116 대장암세포는 American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 RPMI media (HyClone Laboratris Inc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였다. CCD841 대장세포는 American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 DMEM media (HyClone Laboratris Inc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였다. 2일마다 trypsin-EDTA (HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 1×106 cells/mL로 분주하고 계대배양 하였다.
세포배양용 12 well plate에 HCT116 대장암세포를 3.8×105 cells/mL로 분주하고 24시간 배양하였다. 그리고 CCD841 대장세포를 3.8×105 cells/mL로 분주하고 24시간 동안 배양시킨 후 RJE를 처리하였다. LY294002와 Nutlin-3 처리시에는 LY294002와 Nutlin-3을 먼저 처리한 후 RJE를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. MTT용액을 40 μL씩 첨가하여 1시간 동안 5% CO2, 37°C 조건에서 배양한 후, MTT 시약이 들어있는 배지를 제거 후에 DMSO 150 μL를 넣어 well에 생성된 formazan을 모두 녹여 96 well plate에 100 μL씩 분주하여 FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용해 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Cell cycle은 Cell Analyzer (Muse™ Cell Analyzer, Merck Millipore Co.)를 사용하여 측정하였다. HCT116 대장암세포를 6 well plate에 1×106 cells/mL로 분주하여 24시간 배양 후, RJE를 24시간 동안 농도별로 처리하였다. HCT116 대장암세포는 PBS를 이용하여 1×105 cells/mL로 부유시키고, 200 μL의 70% Ethanol을 이용하여 최소 3시간 이상 –20℃에서 고정시켰다. The MuseTM Cell Cycle Assay uses a premixed reagent를 혼합하여 5% CO2, 37°C 조건에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 Cell Analyzer (MuseTM Cell Analyzer, Merck Millipore Co.)를 이용하여 분석하였다.
Apoptosis를 정량적으로 분석하기 위해 MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit (Merck Millipore Co., Billerica, MA, USA)을 사용하였다. HCT116대장암세포는 RPMI media 100 μL를 이용하여 1×105 cells/mL로 부유시키고, MuseTM Annexin V & Dead Cell Reagent 100 μL를 혼합하여 5% CO2, 37°C 조건에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 Cell Analyzer (MuseTM Cell Analyzer, Merck Millipore Co.)를 이용하여 분석하였다.
6 well plate에 HCT116 대장암세포를 well당 1×10 cells/mL로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 RJE를 농도별로 처리하였다. LY294002 (20 μM)와 Nutlin-3 (20 μM)를 병행처리시에는 inhibitor를 먼저 처리하였으며, 모든 물질을 최종 처리한 후 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 RIPA lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1% NP40, 0.5% sodiumdeoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 각 well에 150 μL씩 첨가하여 단백질을 분리한 후, 14,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 추출한 단백질은 FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 그 다음에 8%, 12% acrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 2% Bovine serum albumin (BSA)을 이용해 blocking하고, 1차 항체를 4℃에서 16시간 처리한 다음 2차 항체를 결합시켜 2시간 동안 반응시킨 후 Blue X-ray film에 감광하여 실험 결과를 측정하였다
통계 프로그램인 SPSS (Statistical Package for the Social Science) 22.0 프로그램을 사용하였고 실험 설계에 대한 분산 분석은
RJE가 HCT116 대장암세포에 미치는 세포증식률 변화를 확인하기 위해 HCT116 대장암세포에 RJE를 농도별 (30, 60, 90, 120, 150 μg/mL)로 처리 후 MTT assay를 이용하여 세포 증식률을 확인하였다. 그 결과 RJE를 24시간 처리하였을 때 30 μg/mL에서 78.7%, 60 μg/mL에서 67.9%, 90 μg/mL에서 45.9%, 120 μg/mL에서 40.0%, 150 μg/mL에선 31.9%의 세포 증식률을 나타냈고, RJE에 포함된 0.1% DMSO가 HCT116 대장암세포에서 나타내는 독성 여부를 확인하기 위해 PBS로 1/1000 희석시킨 DMSO를 HCT116 대장암세포에 24시간 처리 후 세포증식률을 확인하였으며, 104.5%의 세포증식률을 보였다. 또한 RJE의 정상세포에 대한 세포독성을 확인하기위해 동일한 조건으로 RJE를 CCD841 정상대장세포에 처리한 결과, 모든 농도에서 80% 이상의 세포증식률을 확인하였다. 따라서 RJE의 세포독성에 의해 HCT116 대장암세포에서 농도의존적으로 세포증식률이 억제되었으며, 정상세포에서는 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다 (Fig. 1(a), 1(b)).
Figure 1. The effect of RJE가 Cell cycle에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 HCT116 대장암세포에 RJE를 도별 (30, 90, 150 μg/mL)로 24시간 처리하여 유세포분석기를 통해 cell cycle을 확인하였 다. 그 결과, G1기의 비율이 Non군에서 47.7%, 30 μg/mL에서 53.8%, 90 μg/mL에서 62.4%, 150 μg/mL에서 69%로 농도의존적으로 증가함을 확인하였다. 따라서 RJE로 인한 HCT116 대장암세포에서의 cell cycle arrest가 G1 checkpoint arrest에 의하여 농도의존적으로 증가함을 확인하였다 (Fig. 2(a)). Cell cycle이 arrest된 상태가 지속되면서 apoptosis로 유도됨을 확인하기위해 RJE를 농도별 (30, 90, 150 μg/mL)로 HCT116 대장암세포에 24시간 처리하였을 때 apoptosis에서 세포내 발현되는 phosphatidylserine (PS)을 annexin V로 염색하고, 유세포분석기를 통해 RJE의 각 농도에서 PS의 염색 비율을 확인하였다. 그 결과 Non군에서 5.2%, 30 μg/mL에서 24.7%, 90 μg/mL에서 36.4%, 150 μg/mL에서 40.2%로 apoptosis가 유도됨을 관찰하였다. 따라서 RJE에 의한 HCT116 대장암세포에서의 cell cycle arrest가 회복되지 않고, 농도의존적으로 apoptosis가 유도됨을 확인하였다 (Fig. 2(b)).
Figure 2. (a) Apoptosis intrinsic pathway에서 미토콘드리아는 매우 중요한 역할을 하며, 미토콘드리아의 막전위를 정상상태로 유지하는 anti-apoptosis 단백질인 Bcl-2가 존재한다. Apoptosis를 유도하는 손상이 가해졌을 때, 암 억제 유전자인 p53에 의해 Bcl-2가 감소하고 pro-apoptosis 단백질인 Bax와 Bak이 미토콘드리아의 막으로 이동하여 막전위의 변화로 인해 막 투과성이 증가한다. 미토콘드리아에서 cytochrome C가 방출되면 caspase 3가 활성화 되어 DNA를 수선하는 PARP를 분절시켜 불활성화 되면서 최종적으로 apoptosis가 일어난다. 본 실험에서는 RJE를 농도별 (30, 90, 150 μg/mL)로 HCT116 대장암 세포에 24시간 처리하였을 때 apoptosis를 유도하는 관련신호전달 단백질의 경향을 Western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, RJE의 농도가 증가됨에 따라 세포의 생장과 증식에 직접적인 영향을 미치는 Akt가 불활성화 되면서 활성화 상태인 p-Akt가 감소경향을 나타내고, p53를 억제시키는 p-Mdm2가 감소함을 확인하였다. 또한 pro-apoptosis 단백질인 p53, Bak, Bax, cleaved-caspase 3에서 농도의존적인 증가 경향을 나타냈으며, anti-apoptosis 단백질인 Bcl-2, pro-caspase 3는 농도의존적인 감소 경향을 확인하였다. 따라서 RJE에 의한 HCT116 대장암세포에서의 apoptosis는 관련신호전달 단백질들의 농도의존적인 경향에 따라 증가함을 확인하였다 (Fig. 3).
Figure 3. The Akt와 Mdm2가 RJE에 의한 HCT116 대장암세포의 apoptosis에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 HCT116대장암세 포에 20 μM의 Akt inhibhitor와 20 μM의 Mdm2 inhibitor (LY294002와 Nutlin-3)를 단독 또는 RJE (90 μg/mL)와 병행하여 24시간 처리 후, MTT assay를 실행하였다. 그 결과, RJE를 단독으로 처리했을 때 44.6%, LY294002를 단독으로 처리했을 때 64.7%, Nutlin-3을 단독으로 처리했을 때 52.1%, RJE와 LY294002를 병행 처리했을 때 14%, RJE와 Nutlin-3를 병행 처리했을 때 24.7%의 증식률을 나타냈다. 이는 Akt와 Mdm2가 HCT116 대장암세포의 생장 및 증식에 영향을 미치는 것을 알 수 있으며, RJE 또한 inhibitor와 비슷한 증식억제효과를 나타냄을 확인하였다 (Fig. 4(a)). 또한 Akt와 Mdm2를 억제함으로써 Akt/mdm2 pathway에 관여하는 단백질들의 경향을 확인하기 위해 위 실험과 동일한 조건으로 HCT116 대장암세포에 RJE, LY294002, Nutlin-3을 처리하여 Western blotting를 실행하였다. 그 결과, Akt와 Mdm2를 억제하였을 때, apoptosis를 유도하는 pro-apoptosis 단백질인 p53, Bak, Bax와 cleaved-caspase 3는 증가하였고, apoptosis 유도를 억제하는 anti-apoptosis 단백질인 p-Akt, p-Mdm2, Bcl-2, pro-caspase 3는 감소하는 경향을 보였다. 이러한 각 단백질에서의 경향은 RJE, LY294002 또는 Nutlin-3를 단독으로 처리했을 때보다 병행 처리하였을 때 더욱 효과적으로 나타났다. 따라서 RJE에 의한 HCT116 대장암세포에서의 apoptosis는 Akt/mdm2 pathway에 의해 유도됨을 확인하였다 (Fig. 4(b)).
Figure 4. The effects on cell proliferation and the control of the signal protein via inhibition of Akt/mdm2. HCT116 Cells were treated with 20 μM LY294002, 20 μM Nutlin-3 and 90 μg/mL 본 연구에서는 HCT116 대장암세포에서 RJE에 의한 Cell cycle arrest와 apoptosis 유도효과를 확인하였다. MTT assay를 통하여 HCT116 대장암세포에서 RJE의 농도의존적인 세포 증식률 감소를 나타냈으며, 같은 조건에서 정상대장세포인 CCD841에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 또한 G1 checkpoint arrest에 의해 RJE의 농도의존적으로 증가하는 Cell cycle arrest효과를 확인하였으며, annexin V를 이용하여 cell cycle이 복구되지 않고 apoptosis로 이어짐을 확인하였다. Western blotting을 통해 HCT116 대장암세포에서 apoptosis 연관 신호전달 단백질들의 RJE농도의존적인 조절에 따라 apoptosis가 증가함을 확인하였다. LY294002와 Nutlin-3를 이용하여 Akt와 Mdm2를 억제 시켰을 때, MTT assay를 통한 세포증식률 억제와 Western blotting를 이용하여 Akt/mdm2 pathway를 통한 신호전달에 의해 apoptosis가 유도됨을 확인하였다. 따라서 본 연구는 HCT116 대장암세포에서 RJE의 농도에 의존하여 G1기에 의한 Cell cycle arrest 증가를 확인하였으며, Akt/mdm2 pathway를 통하여 Bcl-2의 감소되면서 미토콘드리아 막전위 이상으로 apoptosis가 유도됨을 확인하였다.
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