본 연구에서는 1차적으로 한국 여성의 질에서 분리된 유산균 30균주 [12]중 세균성 질증의 주요 원인균인 Gardnerella vaginalis KCTC5096 (G. vaginalis)에 대한 항균 효과를 지니는 유산균을 액체배지 희석법을 이용하여 선별하였다. G. vaginalis의 배양은 10% 말 혈청 (Horse serum, Life technologies corp., NY, USA)을 함유한 BHI 배지 (Difco, MI, USA)를 사용하였으며 (이하 mBHI), Anaerocult^® A (Merck, Germany)로 혐기상태를 유지하며 37℃에서 24시간 배양하였다. 유산균주는 MRS 평판배지 (Difco, MI, USA)에 자란 단일 집락을 MRS 액체배지에 접종하여 37℃, 24시간 정치 배양한 뒤 배양액의 흡광도를 OD₆₀₀ 1.0 (10⁸‒10⁹ CFU/mL)으로 조정하여 새로운 MRS 액체배지에 1% 접종하였다. 37℃, 18시간 정치배양한 배양액은 0.20 μm 필터를 이용하여 여과하였으며 여과된 상등액 (cell free supernatant, CFS)을 본 실험에 사용하였다.

G. vaginalis에 대한 항균효과는 유산균주의 CFS 0.5 mL을 4.5 mL mBHI 배지에 첨가한 뒤 G. vaginalis의 배양액을 OD₆₀₀ 0.5로 조정하여 1% 접종하였다. 이후 24시간 혐기배양하여 G. vaginalis의 생균수를 측정하여 유산균주의 항균효과를 확인하였다.

G. vaginalis에 대한 항균효과를 바탕으로 선별된 유산균주는 칸디다성 질염의 주요 원인균인 Candida albicans SC5314 (C. albicans)에 대한 항진균 효과를 확인하였다. 선별된 유산균주는 MRS 액체배지, C. albicans는 YM (0.3% malt extract, 0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 1% glucose) 액체배지로 37℃, 18시간 배양한 뒤, 두 균주를 MRS 액체배지와 YM 액 체배지를 1:1로 섞은 혼합배지 10 mL에 최종 10⁵ CFU/mL 농도가 되도록 접종하여 37℃에서 20시간 정치 배양하였다. 배양 후 erythromycin (0.3 μL/mL)을 도포한 YM 평판배지를 이용하여 C. albicans의 생균수를 측정하였다.

선별된 유산균주는 universal rRNA gene primer (27F, 1492R)를 이용한 16S rRNA gene sequencing을 진행하여 동정하였으며, 각 과정은 Sol-gent (Daejeon, Korea)를 통하여 수행하였다. 분석된 sequence는 National center for biotechnology institute (NCBI)의 Basic local alignment search tool (blast)을 이용하여 genebank database와 비교하여 동정하고, MEGA 7.0 software의 neighborjoining method를 이용하여 계통수를 작성하였다.

선별된 유산균주의 형태적 특성 확인을 위하여 1% glutaraldehyde (Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA) 용액에 4℃, 24시간 고정화 시킨 뒤, 에탄올로 탈수시켜 주사전자현미경 (Field emission scanning electron microscope, S4300, Hitach, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였으며, 생화학적 특성은 API 50 CHL kit (BioMérieux, France)를 이용하여 API test를 진행하였다.

유산균의 장내 생존 가능성을 확인하기 위하여 Maragkoudakis의 방법 [13]을 참고하여 인공위액, 인공담즙액에 대한 생존율 확인 실험을 진행하였다. 선별된 유산균주를 MRS 평판 배지에 획선도말하여 37℃에 24시간 배양한 뒤, 생성된 집락을 MRS 액체배지에 접종하여 배양 (37℃, 24시간)하였다. 이후 새로운 MRS 배지에 2% 계대하여 24시간 배양하였으며, 이후 배양액은 원심분리 (4000 ×g, 4℃, 5분)한 후, phosphate-buffer saline (PBS, pH7.4)를 이용하여 2번 세척하였다. 세척한 균체는 OD₆₀₀ 1.0 (10⁸‒10⁹ CFU/mL)으로 조정하여 각각 인공위액과 인공담즙액에 대한 내성 실험에 사용하였다. 인공위액에 대한 내성을 확인하기 위하여 pepsin (Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA)을 pH 3, 4 PBS에 3 g/L 농도로 녹여 인공위액을 제작하였으며, 유산균 희석액 100 μL를 900 μL 인공위액에 첨가한 후 진탕한 뒤 37℃에서 배양하며 3시간까지 1시간 간격으로 생균수를 측정하였다. 인공담즙액 내성을 확인하기 위하여 pancreatin (Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA)을 pH7, 8에 1 g/L 농도로 녹여 인공담즙액을 제작하고, 유산균 희석액 100 μL를 900 μL 인공담즙액에 첨가한 뒤 진탕하여 37℃에 배양하며 4시간까지 1시간 간격으로 생균수를 확인하였다.

장내 세포 부착능을 간접적으로 확인하기 위하여 Kassa의 연구 [14]를 변형하여 autoaggregation 실험을 진행하였다. MRS 배지에 18시간 배양한 유산균 배양액을 새로운 10 mL MRS 배지에 2% 접종한 뒤, 18시간 배양하여 실험에 사용하였다. 배양한 유산균은 원심분리 (4,000 ×g, 4℃, 5분)한 후, PBS에 2번 세척하였고, 균체는 OD₆₀₀ 1.0으로 조정하였다. 균주 현탁액 5 mL을 10초간 진탕한 뒤 실험 시작 직후 (A0)와 5시간 방치한 현탁액 (A)의 상등액 0.1 mL을 취해 0.9 mL PBS 와 혼합한 뒤 600 nm에서 흡광도를 측정하였고, 다음 계산식에 따라 autoaggregation 비율을 계산하였다.

장내 세포 부착능력을 간접적으로 확인하기 위한 방법으로 KOS의 microbial adhesion to solvents (MATS)실험 방법 [15]을 변형하여 hydrophobicity 특성을 확인하였다. 선별 균주를 MRS 배지에 배양 (37℃, 24시간)한 후, 원심분리 (4,000 ×g, 4℃, 5분)하여 PBS에 2번 세척하였다. 균체는 PBS를 이용하여 OD₆₀₀ 1.0 (A0)으로 현탁한 뒤 2 mL의 xylene, chloroform, ethylacetate에 현탁액 2 mL을 각각 분주하였다. 각 시험관은 5분간 진탕한 후, 30분간 상온에 방치하였다. 이후 수용액을 회수하여 600 nm에서 흡광도를 측정 (A)하였으며 다음 계산식에 따라 용매 부착능을 계산하였다.

선별된 균주의 항생제 감수성 실험은 clinical and laboratory standard institute (CLSI) guidelines [16]를 따라 BHI (Brain Heart Infusion Agar) 평판배지를 이용하여 수행하였다. 선별 균주는 MRS 배지에 1% 접종한 뒤, 18시간 배양하였으며 배양액은 원심분리 (4,000 ×g, 4℃, 5분)한 후, PBS에 2번 세척하였다. 이후 McFarland turbidity standard 0.5로 균액의 탁도를 맞춘 뒤 멸균된 면봉을 이용하여 BHI 평판배지에 균주를 도말하였다. 배지가 마른 뒤 항생제 디스크를 균액이 도말된 배지 위에 놓고 37℃에서 24시간 배양하였으며, 생성된 억제환의 크기를 mm 단위로 측정하여 표준 지표에 따라 sensitive, intermediate, resistant 3단계로 판정하였다. 확인한 항생제는 ampicillin (AM, 10 μg), cefotaxime (CTX, 30 μg), cefepime (CEP, 30 μg), cefotetan (CTT, 30 μg), cephalothin (CF, 30 μg), gentamicin (GM, 10 μg), kanamycin (K, 30 μg), streptomycin (S, 10 μg), ciprofloxacin (CIP, 5 μg), nalidixic acid (NA, 30 μg), trimethoprim/sulphamethoxazole (SXT, 1.25/23.75 μg), rifampin (RA, 5 μg), tetracycline (TE, 30 μg), erythromycin (E, 15 μg), vancomycin (VA, 30 μg)이다.

세균성 질증은 질염의 약 40-50%를 차지하는 가장 흔한 질병으로 질내 Gardnerella vaginalis, Prevotella spp.와 같은 혐기성 세균 비율이 증가하게 되어 휘발성 아민화합물이 증가하며 악취를 유발한다 [17]. 이에 본 연구에서는 질 내 환경 개선을 위한 유산균주 발굴을 위하여 세균성 질증의 주요 원인균인 G. vaginalis에 대한 항균력을 확인하였으며 각 유산균주 배양 상등액의 항균 효과는 Fig. 1과 같다. 실험 결과 G. vaginalis에 항균 효과를 나타내는 유산균은 총 19균주였으며 이중 MG4272와 MG4288 균주는 대조군 대비 각각 61.36%, 79.60%의 저해효과를 보여 다른 분리 균주와 비교하여 높은 항균 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

Figure 1. Antimicrobial activity of vaginal lactic acid bacteria against Gardnerella vaginalis. Viable cell counts of G. vaginalis were determined after 24 h co-cultured with cell free supernatants of lactic acid bacteria. The data are expressed as the mean ± standard deviation of two experiments.

칸디다성 질염은 세균성 질증에 이어 두번째로 흔한 질염의 종류로 원인균의 70~90%는 Candida albicans이며, 짙은 흰 분비물과 가려움증을 특징으로 한다. 여성의 70~75%는 살면서 한번 이상의 감염을 겪게 되고 40~50%의 여성은 1년에 2회 이상의 재발을 겪는다 알려져 있다 [7]. G. vaginalis에 항균력이 우수한 MG4272, MG4288의 C. albicans에 대한 항진균 효과를 보면, Fig. 2와 같이 억제효과를 확인할 수 있었다. 또한 C. albicans와 선별 균주의 혼합배양 시에는 각각 91.4%, 97.3%의 항진균 효과를 보였으며, 선별 균주의 상등액과 혼합 배양 시에는 각각 97.4%, 97.6%의 항진균 효과를 나타내었다.

Figure 2. The anti-candidal activity of selected strains. (a) Viable cell counts of Candida albicans were determined after 20 h co-cultured with selected strains. (b) Viable cell counts of C. albicans were determined after 20 h co-cultured with cell free supernatants of selected strains. The data are expressed as the mean ± standard deviation of two experiments.

G. vaginalis, C. albicans에 대한 항균력이 우수한 두 균주는 16S rRNA sequencing 결과 Lactobacillus paracasei MG4272와 Lactobacillus rhamnosus MG4288로 동정되었으며 (Fig. 3), 균주의 세포 형태는 주사전자현미경을 통하여 간균임을 확인하였다 (Fig. 4). API 50CHL은 Lactobacillus 속의 49가지 탄수화물의 발효 여부를 연구하는데 사용되는 방법으로 이를 이용하여 확인한 선별 균주의 탄수화물 발효특성은 Table 1과 같다. 실험 결과 두 균주 모두 D-ribose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-mannitol, D-sorbitol, N-acethyl-glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D-cellobiose, D-melezitose, gentiobiose, D-tagatose, gluconate를 사용할 수 있었으며 glycerol, erythritol, Larabinose, xylose, D-adonitol, Methyl-β D-xylopyranoside, Lrhamnose, Methyl-α D-Mannoside, Methyl-α D-glucoside, D-lactose, D-melibiose, D-raffinose, starch, glycogen, xylitol, D-lyxose, D-fucose, D-arabitol, 2-keto-gluconate, 5-ketogluconate를 사용할 수 없었다. 또한 apiweb^TM (version 5.2)을 이용한 동정 결과 MG4272는 98.3% L. paracasei로 동정되었다. 하지만 MG4288은 L. paracasei 또는 L. rhamnosus로 동정되어 일반적인 L. rhamnosus에 비하여 L-rhamnose와 Dlactose를 이용하지 못하는 상반되는 특성을 나타내었다.

Figure 3. Phylogenetic analysis of selected strains compared to other lactic acid bacteria.

Figure 4. SEM images of selected strains. (a) Lactobacillus paracasei MG4272; (b) Lactobacillus rhamnosus MG4288.

Table 1 . Biochemical characteristics of Lactobacillus paracasei MG4272 and Lactobacillus rhamnosus MG4288 using API 50 CHL analysis.

Substrate	MG4272	MG4288	Substrate	MG4272	MG4288
Control (Negative)	−	−	Esculin	+	+
Glycerol	−	−	Salicin	+	+
Erythritol	−	−	D-cellobiose	+	+
D-arabinose	−	+	D-maltose	+	−
L-arabinose	−	−	D-lactose	−	−
D-ribose	+	+	D-melibiose	−	−
D-xylose	−	−	D-sucrose	+	−
L-xylose	−	−	D-trehalose	−	+
D-adonitol	−	−	Inulin	+	−
Methyl-β D-xylopyranoside	−	−	D-melezitose	+	+
D-galactose	+	+	D-raffinose	−	−
D-glucose	+	+	Starch	−	−
D-fructose	+	+	Glycogen	−	−
D-mannose	+	+	Xylitol	−	−
L-sorbose	+	−	Gentiobiose	+	+
L-rhamnose	−	−	D-turanose	+	−
Dulcitol	−	+	D-lyxose	−	−
Inositol	−	+	D-tagatose	+	+
D-mannitol	+	+	D-fucose	−	−
D-sorbitol	+	+	L-fucose	−	+
Methyl-α D-Mannoside	−	−	D-arabitol	−	−
Methyl-α D-glucoside	−	−	L-arabirol	+	−
N-acethyl-glucosamine	+	+	Gluconate	+	+
Amygdalin	+	+	2-keto-gluconate	−	−
Arbutin	+	+	5-keto-gluconate	−	−

+: Positive reaction, −: Negative reaction.

최근 여성의 질 건강에 대한 관심이 증가하고 관련 연구가 많이 진행되고 있으나, 국내는 관련 연구가 매우 미비한 실정이다. 여성의 질 내 세균총은 나라별, 개인별로 다르다 보고 [18,19] 되어 있으며, 이에 국내 여성의 질 내 유산균에 대한 균주 분리 및 확보를 통한 다양한 연구가 필요하다 [20]. 본 연구에서 선별한 두 균주는 모두 식품의약품안전처 건강기능식품의 기준 및 규격에 등재되어 안정성이 확보된 균주이다.

구강을 통해 섭취되는 유산균은 산도가 낮은 위와 소화효소가 많은 장을 통과하게 되며, 위산의 낮은 pH와 펩신, 장내 답즙염과 소화효소에 노출되게 된다. 이에 미생물을 프로바이오틱스로 활용하기 위해서는 낮은 pH와 효소에서 살아남기 위한 위액 내성과, 장내 극한 환경에서 생존하기 위한 담즙액 내성이 필수적이다. 본 연구는 G. vaginalis와 C. albicans에 대한 억제효과가 우수한 두 균주의 인공위액과 인공담즙액에 대한 내성을 확인하였다 (Fig. 5). 체내 위액의 pH는 대략 3.0으로 유지되며 음식물이 위를 통과하는 시간은 3시간 정도로 알려져 있어 일반적으로 pH 3에서 3시간 이상 생균수를 유지할 경우 산성에 높은 내성을 보이는 것으로 판단한다 [21]. MG4272, MG4288 두 균주는 모두 pH 3에서 3시간 후 10⁸ CFU/mL 이상의 생균수를 유지하는 것을 확인하여 내산성이 우수함을 확인하였으며, 인공담즙액 내성 실험에서도 10⁸ CFU/mL 이상의 생균수를 유지하여 매우 우수한 내성을 지니는 것을 확인하였다.

Figure 5. The survival results of selected strains are shown the viable cell counts (log CFU/mL). (a) Lactobacillus paracasei MG4272 in simulated gastric fluid pH 3, pH 4. (b) Lactobacillus paracasei MG4272 in simulated intestinal fluid pH 7, pH 8. (c) Lactobacillus rhamnosus MG4288 in simulated gastric fluid pH 3, pH 4. (d) Lactobacillus rhamnosus MG4288 in simulated intestinal fluid pH 7, pH 8. The data are expressed as the mean ± standard deviation in triplicate.

Autoaggregation과 hydrophobicity는미생물의 상피 세포 부착능을 간접적으로 확인할 수 있는 방법으로, Kos의 연구 [15]에 의하면, autoaggregation능력과 세포 표면 소수성이 높은 균주가 실제 세포 부착능력 또한 높다고 알려져 있다. 질내 유산균주의 세포 부착능이 떨어질 경우 월경, 출산 등의 원인으로 유산균이 질에 정착하지 못하고 쓸려나가기 때문에 질내 환경개선 효능을 가지는 유산균주의 경우 세포 정착능이 매우 중요하다 [1]. 이에 선별된 L. paracasei MG4272, L. rhamnosus MG4288 균주의 세포 부착능을 간접적으로 확인하기 위하여 autoaggregation, MATS 실험을 진행하였다 (Fig. 6, Fig. 7).

Figure 6. Autoaggregation rate of Lactobacillus paracasei MG4247 and Lactobacillus rhamnosus MG4288 for 5h. The data are expressed as the mean ± standard deviation in triplicate.

Figure 7. Adhesion rate to xylene, chloroform and etylacetate of Lactobacillus paracasei MG4247 and Lactobacillus rhamnosus MG4288. The data are expressed as the mean ± standard deviation in triplicate.

선별된 두 균주의 autoaggregation 능력은 각각 57.99%, 65.65%였다. Malik의 연구 [22]에 따르면, L. plantarum CMPG5300의 in vitro상의 autoaggregation이 약 67%일 때 질 상피세포에서의 부착능은 50% 이상임을 확인하였으며, autoaggregation능력이 높은 균주는 세포 표면에 biofilm을 형성하는 능력이 우수하다 보고되었다. 위 연구에서 L. plantarum CMPG5300을 제외한 다른 8개 균주의 autoaggregation 능력이 20% 이하임을 감안하면 본 연구에서 선별한 두 균주의 autoaggregation 능력이 우수한 것임을 확인할 수 있었다.

MATS 실험 결과, 세포의 소수성을 알 수 있는 xylene 부착능은 MG4272 균주가 71.20%, MG4288 균주가 83.56%로 높은 소수성을 나타내었다. 세포 표면 소수성은 세포 표면에 단백질이 존재하는 것을, 친수성 특징을 나타낼 경우 다당류가 많은 것을 의미하며 단백질이 많아질수록 autoaggregation 능력과 세포 부착능이 뛰어나게 된다. 본 실험에서도 MG4288 균주가 MG4272 균주보다 더 높은 autoaggregation 능력을 보인 것과 비례하여 xylene 부착능도 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 세포부착능이 뛰어난 균주는 세포에 자리를 잡아 병원균의 세포 부착을 막아 감염을 막는 특성 [2]을 가진다. 선별된 두 균주는 높은 autoaggregation능력과 xylene 부착능을 통해 질 내 상피세포부착능 역시 우수할 것이라 사료된다.

세포 표면 특성을 확인하기 위하여 진행한 chloroform과 ethylacetate 부착능 확인 결과, 산성 용매인 chloroform (전자수용체)에 더 높은 부착능을 나타내었다. 이를 통해 두 균주는 세포 표면에 전자공여체를 수용하고 있음을 알 수 있었다.

본 연구에서 선별된 균주의 항생제 내성 특성은 Table 2와 같다. MG4272, MG4288 두 균주 모두 CTX, CTT, K, S, NA, SXT, VA에는 내성을 나타내는 것을 확인하였으며, AM, CIP, TE, E, RA에는 저해되는 것을 확인하였다. Charteris의 연구 [23]에 따르면 실험에 이용된 모든 유산균이 K, S, NA, SXT에 내성을 가지고 있었으며 TE, E, RA에 저해된다 보고되었으며, Zhou의 연구 [24]에서도 사용한 모든 유산균주 10종이 GM, K, S, NA에 내성을 지니고 AM, CF, S, TE, E, RA에 저해된다 보고되었다. 이는 본 실험의 결과와 유사하며 특히 K, S, NA의 내성과 TE, E, RA에 대한 감수성은 세 연구에서 공통적으로 나타나 유산균주가 가지는 특징으로 사료된다.

Table 2 . Antimicrobial susceptibility test of selected strains.

Antibiotics (μg/disc)	Selected strains
	Lactobacillus paracasei MG4272	Lactobacillus rhamnosus MG4288
Ampicillin (AM, 10)	S1	S
Cefotaxime (CTX, 30)	R2	R
Cefepime (CEP, 30)	S	R
Cefotetan (CTT, 30)	R	R
Cephalothin (CF, 30)	S	R
Gentamicin (GM, 10)	S	R
Kanamycin (K, 30)	R	R
Streptomycin (S, 10)	R	R
Ciprofloxacin (CIP, 5)	S	S
Nalidixic acid (NA, 30)	R	R
Trimethorim/Sulphamethoxazole (SXT, 1.25/23.75)	R	R
Tetracyclin (TE, 30)	S	S
Erythromycin (E, 15)	S	S
Vancomycin (VA, 30)	R	R
Rifampin (RA, 5)	S	S

¹Sensitive

²Resistant