본 실험에서 사용된 소나무 담쟁이덩굴의 원산지는 경상남도 산청군이다. 소나무 담쟁이덩굴은 ㈜지리산 한방식품에서 구매하여 분쇄 후 100 g에 95% Ethanol 800 mL을 가하여 72시간 동안 상온에서 환류 추출하였다. 추출된 소나무 담쟁이덩굴은 감압 농축기 (N-1200A, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 감압 농축시키고 농축된 추출물은 실험에 사용하기 전까지 –86°C에서 보관하였다. 이렇게 농축된 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 이용하여 200mg/mL stock으로 만들어 –20°C에 보관하여 사용하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, USA)에서 구입하여 5 mg/mL 농도로 만들어서 사용하였다. 또한, LY294002 (Sigma-Aldrich, USA)와 Compound C (Merck Millipore, USA)는 DMSO에 용해시켜 각각 20 mM과 10 mM로 만들어서 사용하였다.

본 연구에서 사용한 A549 폐암 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받았으며, 10% FBS (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics (HyClone Laboratories Inc.)가 포함된 RPMI 1640 media (HyClone Laboratories Inc.)를 사용하였다. Fibroblast 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS (HyClone Laboratories Inc, Logan, UT, USA)와 1% antibiotics (HyClone Laboratories Inc.)가 포함된 DMEM media (HyClone Laboratories Inc.)를 사용하여 5% CO₂, 37°C 조건으로 배양하였다. 48시간마다 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유 상태로 만든 다음 1×10⁴ cells/mL로 분주하고 계대배양하였다.

A549 세포와 fibroblast 세포를 12 well plate에 1×10⁴ cells/mL로 seeding 한 후 5% CO₂, 37℃ 조건하에 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 PTE를 농도별 (25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)로 처리하고 5% CO₂, 37 조건하에 incubator에 24시간, 48시간 배양한 후, MTT solution을 well에 40 μL씩 처리 후 50분 동안 incubator에 배양하였다. PBS를 well에 1 mL 분주하여 washing 후, DMSO를 well에 150 μL씩 넣어주었다. 96 well plate에 100 μL씩 취해 옮겨준 다음 FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

6 well plate에 A549 세포를 well에 1×10⁴ cells/mL로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 PTE를 농도별 (50, 75, 100 μg/mL)로 처리하였다. 24시간 동안 incubator에서 배양한 후 A549 세포에서 일어난 형태 변화를 Inverted microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.

Apoptosis를 정량적으로 분석하기 위해 Muse^TM Annexin V & Dead Cell Kit (Merck Millipore, USA)를 사용하였다. A549 cell을 6 well plate에 1x10⁵ cells/mL로 seeding 후, 5% CO₂, 37℃ 조건하에 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 PTE를 농도별 (50, 75, 100 μL/mL)로 처리해준 후 5% CO₂, 37℃ 조건하에 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 원심분리하여 모아주었다. 모아준 세포는 PBS를 이용하여 washing 후 Muse^TM Annexin V & Dead Cell Kit (Merck Millipore, USA)를 처리하여 20분 반응시켰다. 반응 후 PB4455ENEU Muse^TM Cell Analyzer (Merck Millipore, USA)를 사용하여 분석하였다.

6 well plate에 A549 세포를 well에 1×10⁴ cells/mL로 분주하여 5% CO₂, 37℃ 조건하에 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 PTE를 농도별 (50, 75, 100 μg/mL)로 처리한 후 5% CO₂, 37℃ 조건하에 incubator에서 24시간 배양하였다. LY294002 (20 mM)과 Compound C (10 mM)는 PTE를 처리하기 1시간 전에 처리하였다. 그 후 세포에 RIPA lysis buffer [25mM Tris-Cl(pH 7.4), 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 well에 150 μL씩 첨가하고 scrapper를 이용하여 단백질을 분리하였다. 그런 다음 14,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 얻어진 상등액은 FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다. 전기영동은 8%, 12% acrylamide gel을 이용하여 실시하였고 nitro-cellulose membrane에 transfer 하였다. 그런 다음 4% Bovine serum albumin (BSA)을 이용하여 상온에서 1시간 30분 동안 blocking 하였다. 1차 항체는 4℃에서 overnight 하여 단백질에 결합시켰다. 다음날 2차 항체를 1-2시간 동안 반응 시킨 다음 Blue X-ray film에 감광하여 실험 결과를 측정하였다.

통계 프로그램인 SPSS (Statistical Package for the Social Science) 22.0 프로그램을 사용하였고 실험 설계에 대한 분산 분석은 독립 표본 t-test(Independent sample t-test)를 통하여 검정하였다. 각 자료는 최소 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

Apoptosis는 생명체의 정상적인 발달과 분화에 관여하며 DNA의 손상이나 산화적, 대사적 스트레스로 인해 세포가 더 이상 생존할 수 없을 때 비정상적인 세포들을 제거하는 프로그램된 세포의 죽음이다 [5,14]. 또한 정상 세포는 핵이나 세포질의 형태가 일정하고 세포의 이동과 관련된 lamellipoia와 filopodia가 잘 관찰되지만, 세포사멸 시에는 세포 골격 단백질의 변화로 인하여 세포질이 응축되고 핵이 분절되면서, lamellipodia와 filopodia의 소실과 같은 특이적인 형태학적 변화가 관찰된다 [15]. 본 연구에서는 PTE가 A549 폐암 세포에 특이적으로 세포독성을 나타내는지 확인하기 위해 PTE를 농도별 (25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)로 처리하여 MTT assay를 통해 세포독성을 측정하였다. 그 결과 정상세포인 Fibroblast 세포에서는 control 대비 모든 농도 군에서 생존율이 90% 이상으로 유지되며 유의하지 않은 것으로 보아 PTE가 정상세포에서 독성이 없음을 확인했다 (Fig. 1(a)). 반면 A549 폐암 세포주에 PTE를 처리했을 때에는 control 대비 농도와 시간 의존적으로 세포의 증식이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 1(b), 1(c)). 또한 A549 세포에 PTE를 농도별(50, 75, 100 μg/mL)로 처리하였을 때 밀도가 높고 균일하며 부착이 잘 되어있는 정상적인 A549 세포의 형태를 보이는 control 군에 비해 농도 의존적으로 세포의 밀도가 현저히 감소하며 세포사멸에 있어 세포의 응축 같은 형태학적인 변화가 일어난 것을 확인하였다 (Fig. 1(d)). 결과적으로 PTE는 정상 섬유아세포인 Fibroblast의 증식에는 영향을 미치지 않으며 A549 폐암 세포주에 있어 농도와 시간 의존적으로 세포의 증식을 특이적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 세포증식 억제효과가 Apoptosis에 의한 것이지 연구하기 위해 위 결과를 기반으로 주요 농도를 50, 75, 100 μg/mL로 결정하여 실험에 활용하였다.

Figure 1. Anti-proliferation and morphological change effects of PTE in A549 cells. (a) Fibroblast cells were treated with variable concentrations of PTE (25~150 μg/mL) for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. (b) A549 cells were treated with variable concentrations of PTE (25~150 μg/mL) for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. (c) A549 cells were treated with variable concentrations of PTE (25~150 μg/mL) for 48 h. Cell viability was measured by MTT assay. (d) The morphology of A549 cells, Cells were treated with PTE (50, 75, 100μg/mL) for 24 h. Original magnification x200.Each figure is representative of an experiment that was repeated at least three times. The statistical analysis of the data was carried out by use of an independent sample t-test.*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001, NS is not significant (each experiment, n=3).

프로그램된 세포의 죽음인 apoptosis는 인지질 이중층 안쪽에 존재하던 phosphatidylserine(ps)이 표면으로 노출되는 원형질막 구조의 변화가 동반되며 시간적 진행에 따라 phospatidylserine의 translocation이 발생은 하지만 세포막의 손상은 일어나지 않은 early apoptosis와 phospatidylserine의 translocation과 함께 세포막의 손상이 함께 일어나는 late apoptosis로 나누어진다 [16,17]. 앞서 PTE 처리에 의한 A549 세포의 증식 억제 효과에 대해 알아보았는데, 이러한 증식억제 효과가 necrosis에 의한 것인지 apoptosis 유도에 의한 것인지를 확인하기 위해 Muse^TM Annexin V & Dead Cell Kit로 염색 후 flow cytometry을 실시하였다. 그 결과 PTE를 농도별(50, 75, 100 μg/mL)로 처리한 후 24시간 동안 반응시켰을 때 control군의 Apoptosis 유발 빈도는 약 9.6%로 매우 낮았으나 소나무담쟁이 덩굴 추출물을 농도별 (50, 75, 100 μg/mL)로 처리한 군의 경우 각각 Apoptosis 유발 빈도가 46.65%, 59.2%, 74.8%로 소나무담쟁이 덩굴 추출물의 농도가 증가할수록 apoptosis가 많이 유도된 것을 확인했다 (Fig. 2). 이러한 결과는 PTE 처리로 인한 A549 폐암 세포 특이적인 생존율 및 증식 억제는 necrosis에 의한 것이 아니라 apoptosis에 기인한 결과였음을 시사한다.

Figure 2. PTE treatment induces apoptotic effect in A549 cells. (a) A549 Cells were treated with PTE (50, 75, 100 μg/mL) for 24 h. apoptotic effect was measured by flow cytometry. (b) The graph of cells ratio at each groups.

Akt는 암세포의 대사와 성장, 그리고 생존에 중요한 역할을하고, mammalian target of rapamycin (mTOR)나 종양 억제인자인 p53과 같은 중요 신호 분자들을 조절한다 [12,18]. 또한 AMPK의 활성화는 mTOR의 발현을 억제시키며 이러한 AMPK의 활성화와 mTOR의 하향조절은 종양 억제 단백질인 p53을 활성화하여 내인성 경로를 통한 apoptosis를 유도한다 [13]. 이러한 상위 단백질들의 조절은 미토콘드리아에서 세포질로 cytochrome c가 방출되어 이루어지는 intrinsic pathway에서 중요한 Bcl-2 family 단백질들을 조절한다 [19]. Bcl-2 family 단백질은 기능적으로 구분되는데 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2, Bcl-XL 등과 pro-apoptotic 단백질인 Bax가 heterodimer를 형성하거나 미토콘드리아의 기능을 조절한다 [20,21]. 또한 Bax, Bak, Bad 같은 pro-apoptotic 단백질들은 미토콘드리아로 이동되어 cytochrome c를 방출 할 수 있는 pore를 형성한다 [22]. 이렇게 미토콘드리아에서 apoptosis 과정이 활성화됨에 따라 caspase-3가 활성화되면서 DNA repair나 유전자 안정성을 유지시키는 PARP 단백질을 절단하여 PARP 단백질이 역할을 할 수 없는 cleaved-PARP가 생성되고 그 결과 특징적인 apoptosis의 형태를 생성한다 [23]. 앞서 소나무 담쟁이덩굴 추출물이 apoptosis 룰 유도하는 것을 확인하였고, 이러한 apoptosis가 intrinsic pathway 관련 단백질을 어떻게 조절하여 유도되는지 알아보기 위해 상위 조절 단백질인 Akt, AMPK, mTOR, p53 단백질뿐만 아니라 이들로 인해 영향을 받는 하위 조절단백질의 발현 정도를 확인하기 위해 A549 폐암 세포주에 소나무 담쟁이덩굴 추출물을 농도별 (50, 75, 100 μg/mL)로 처리한 후 24시간 반응시킨 후 western blotting을 실시하였다. 그 결과 암세포의 증식에 관여하는 단백질들인 p-Akt, p-mTOR의 감소를 확인할 수 있으며 p-AMPK는 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한 p-AMPK의 증가는 종양 억제 단백질인 p53의 증가로 나타났다. 이러한 상위 단백질들의 조절을 받아 Bcl-2 family 단백질 중 anti-apoptotic 단백질인 bcl-2단백질은 감소하고 pro-apoptotic 단백질인 Bax는 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한 pro-caspase3의 감소를 볼 수 있었으며 cleaved-caspase3의 증가를 볼 수 있었다. 이러한 경향은 PARP 단백질의 절단을 이끌어내어 cleaved-PARP의 증가로 나타났다 (Fig. 3). 이러한 결과를 바탕으로 PTE가 A549 폐암 세포에서 apoptosis 관련 단백질들의 발현을 조절하여 intrinsic pathway를 통해 apoptosis를 유도하는 것을 확인했다.

Figure 3. PTE treatment regulates the expression of intrinsic pathway–related apoptosis proteins in A549 cells. PTE effects on (p)mTOR, (p)Akt, (p)AMPK, p53, pro caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, cleaved-PARP, Bax and β-actin. Cells were treated with PTE (50, 75, 100 μg/mL) for 24 h. Protein levels were determined by Western blotting. The β-actin probe served as protein -loading control. Each protein is representative of an experiment that was repeated at least three times

본 실험에서는 PTE를 농도별 (50, 75, 100 μg/mL)로 처리한후 실시한 western blot의 결과를 기반으로 소나무 담쟁이덩굴 추출물이 Akt와 AMPK를 경유하는 signaling pathway를 통해 apoptosis를 유도한다는 가설을 세우게 되었다. apoptosis가 일어나는 일련의 신호 경로를 확인하기 위해 각각 상위 단백질인 Akt와 AMPK의 활성을 억제하는 ly294002와 CompoundC를 A549 세포에 처리하여 MTT assy와 western blotting을 시행하였다. 그 결과 MTT assay에서는 control 군과 비교했을 때 PTE (75 μg/mL) 단독 처리 군의 경우 72.8% 정도의 생존율을 보였으며 ly294002를 단독처리한 군은 세포 생장과 증식에 관여하는 Akt의 활성이 억제되어 74.3% 정도의 생존율을 보였다. 또한 PTE와 ly294002를 병행 처리한 군의 경우 PTE나 ly294002를 단독 처리한 군보다 더 적은 59.4%의 생존율을 보였다. 또한 control 군과 비교하여 AMPK 저해제인 Compound C를 처리한 군의 경우 96.1%의 생존율을 보여 control군과 유의한 차이가 없었으며, PTE와 Compound C를 병행 처리한 군의 경우 PTE만을 단독 처리한 군보다 높은 84%의 생존율을 보였다 (Fig. 4). 이 결과는 AKT의 저해가 A549 폐암 세포의 증식 억제에 있어 중요한 역할을 하며 AMPK의 저해가 A549 폐암 세포의 사멸을 억제하는 것을 나타낸다. 다음으로 Akt, AMPK 저해제와 PTE(75 μg/mL) 처리에 따른 apoptosis 단백질의 발현을 보면 p-Akt와 p-mTOR는 control 군 대비 PTE나 Akt 저해제를 단독처리한 군의 경우 발현이 감소함을 볼 수 있었으며 병행 처리하였을때 더 많은 감소를 보였다. 또한 AMPK 저해제를 단독처리한 군의 경우 control 군과 비슷한 발현을 보였으며 AMPK 저해제와 물질을 병행 처리하였을 때에는 약간의 감소 경향을 보였다. p-AMPK와 p53의 경우에는 control 군 대비 PTE나 Akt 저해제를 단독처리한 군의 경우 발현이 증가함을 볼 수 있었으며 Akt 저해제와 물질을 병행 처리하였을 때에는 더 많은 증가를 보였다. AMPK 저해제를 단독으로 처리한 군에서는 control 군과 비슷한 경향을 보였고 AMPK 저해제와 물질을 병행 처리 하였을 때에는 조금 증가하는 경향을 확인했다. 이러한 상위 단백질들의 영향을 받아 하위 단백질인 Bax, cleaved-caspase3, cleaved-PARP는 control 군 대비 PTE나 Akt 저해제를 단독으로 처리한 군의 경우 발현이 증가하는 것을 볼 수 있었으며 병행 처리하였을 때 단독처리군들에 비해 더 많이 발현이 증가하는 것을 볼 수 있었다. AMPK 저해제를 단독으로 처리하였을 때에는 control 군과 유사한 단백질의 발현을 보였고 PTE와 AMPK 저해제를 병행 처리하였을 때에는 발현이 약간 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또한 Bcl-2와 pro-caspase3의 경우에는 control 군 대비 PTE나 Akt 저해제를 단독으로 처리한 군의 경우 발현이 감소하는 것을 볼 수 있었으며 병행 처리하였을 때에는 단독 처리했을 때 보다 더 많은 발현의 감소를 볼 수 있었다. 또한 AMPK 저해제를 단독으로 처리하였을 때에는 control 군과 비슷한 발현을 보였고 AMPK 저해제와 물질을 병행 처리하였을 때에는 발현이 약간 감소하는 것을 확인했다 (Fig. 5). 이와 같은 결과를 기반으로 PTE는 Akt를 억제하고 AMPK를 활성화시켜서 이를 경유하는 signaling pathway를 통해 apoptosis를 유도한다는 가설을 증명하였다.

Figure 4. PTE, LY294002, and compound C affect the proliferation of A549 cells. A549 Cells were pre-treated with 20μM LY294002 or 10μM compound C for 30 min and co-treated with 75μg/mL PTE for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. This figure is representative of an experiment that was repeated at least three times. The statistical analysis of the data was carried out by use of an independent sample t-test.

*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001, NS is not significant (each experiment, n=3).

Figure 5. PTE induces apoptosis through the Akt- and AMPK-dependent pathway. PTE, LY294002 and compound C effects on (p)mTOR, (p)Akt, (p)AMPK, p53, procaspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, cleaved-PARP, Bax and β-actin. A549 Cells were pretreated with 20 μM LY294002 or 10 μM compound C for 30 min and co-treated with 75 μg/mL PTE for 24 h. Protein levels were determined by Western blotting. The β-actin probe served as protein-loading control. Each protein is representative of an experiment that was repeated at least three times.