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pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

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Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2019; 34(4): 338-345

Published online December 31, 2019 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.4.338

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

전립선 비대증 세포 사멸에 대한 쏘팔메토 열매추출물과 홍경천 추출물의 복합 효과

Complex Effect of Saw palmetto Extract and Rhodiola Sachalinesis Extract on Prostatic Hyperplasia Epithelial Cells (BPH-1)

Mi-Jin Kwon1 and Young Ho Cho2,*

1R&D Center, PSA Co., Ltd, Daejeon 35365, Korea, 2Department of Pharmaceutics & Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365, Korea

Correspondence to:*Department of Pharmaceutics & Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365, Korea Tel: +82-42-600-8503, Fax: +82-42-600-8503 e-mail: micael@konyang.ac.kr

Received: September 25, 2019; Revised: October 29, 2019; Accepted: November 18, 2019

This study was conducted to evaluate whether Rhodiola sachalinesis extract (RS) is effective in reducing Saw palmetto extract (SP)-induced toxicity and improving benign prostatic hyperplasia (BPH). RS powder was extracted with 50% ethanol to prepare an extract. The 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (ABTS) radical scavenging activities for RS extract were 8.7 μg/mL and 2.5 μg/mL, respectively. Toxicity to testicular cells, normal prostate cells and BPH-1 by SP or RS alone treatment and SP-RS combined treatment was tested. As a result, SP showed toxicity in testicular cells and normal prostate cells, whereas RS did not show toxicity in both cells. On the other hand, SP did not show apoptotic effect in BPH-1, but RS-induced apoptosis in BPH-1 in a concentration-dependent manner. In SP-RS complex treatment, the normal intracellular toxicity to SP was weakened, and the cytotoxic effect on BPH-1 was rather increased. These results indicate that RS can be used as a material for BPH improvement because it can induce apoptosis of BPH-1 without toxicity to normal cells, when treated with SP alone or in combination with SP.

Keywords: Rhodiola sachalinesis, Saw palmetto, benign prostatic hyperplasia, toxicity, testicular cells

전립선 비대증 (benign prostatic hyperplasia, BPH)은 그에 대한 임상적 정의가 규정된 후 전 세계적으로 40대 이후의 남성에게서 매우 흔하게 나타나는 질환으로 알려져 왔다 [1]. BPH의 증상으로는 소변 장해인 하부요로증상 (lower urinary tract symptoms, LUTS)가 대표적인데 급뇨 (urgency), 빈뇨 (frequency), 약한 배뇨 (weak stream), 야뇨증 (nocturia)과 불충분한 배뇨로 인한 잔뇨감 (incomplete emptying of urine) 등의 증상이 나타난다 [2,3]. BPH는 요도 주위를 둘러싸고 있는 전립선 상피 세포와 기질 세포의 과다 증식으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다 [4]. 이러한 원인은 나이가 들면서 testosterone이 감소하게 되는데 5α-reductase (5-AR)에 의해 testosterone이 전환되어 생성되는 dihydrotestosterone (DHT)이 전립선 세포를 자극하여 이상 생장하는 것으로 알려져 있다 [5]. BPH로 인한 가장 큰 불편함은 야간에 수면을 충분하게 유지할 수 없어 피로를 해소하기 어렵거나, 야외활동 시 잦은 배뇨증상으로 인해 심한 심리적 스트레스를 받는 것이다 [1].

BPH 개선을 위해 5-AR 저해제 혹은 α-adrenergic receptor blockers 등이 제약의 형태로 처방되어 왔다 [6]. 몇몇 연구들에서 DHT와 5-AR의 발현을 조절하여 BPH를 예방하거나 치료하기 위해 토마토와 검정 복분자 추출물과 같은 식물 추출물들을 사용하였다 [7,8]. 이 중 쏘팔메토열매추출물 (extract of Saw palmetto berry, SP)이 대표적인 천연물 소재로 전 세계적으로 BPH 개선을 위한 건강보조식품으로 널리 이용되고 있다 [9]. 국내에서도 전립선 건강에 유용한 건강기능식품 고시형 원료로 인정받아 30여개 업체가 관련제품을 생산, 판매하고 있다. SP에 대한 초기의 임상 연구에서 SP가 BPH로 인해 발생하는 LUTS에 효과적이라고 알려져 왔다 [10]. 그러나, Avins와 Bent [4]는 그들의 연구를 통해 SP가 BPH를 개선한다는 어떠한 과학적 근거를 발견하지 못하였다고 보고한 이후, SP의 BPH에 대한 효능과 독성에 대한 문제가 지속적으로 대두되어 왔다 [12,13]. 특히 SP가 널리 사용되고 있는 식이 보충제임에도 불구하고, 잠재적인 독성이나 부작용에 관한 연구가 대부분 1년 미만의 기간 동안 시행됨에 따라 다양한 인구 집단과 연구 기간을 기반으로 한 보다 명확한 독성연구의 필요성이 제기되었다 [14]. 최근 Avins 등 [15]은 SP을 일일 최대 960 mg의 농도로 18개월간 섭취하였을 때에도 심각한 독성은 나타나지 않았다고 보고하였으나, 여전히 처방 의약품이나 다른 식이 보충제 간의 상호작용에 관한 분석뿐만 아니라 무증상이 배제된 SP를 장기간 섭취 시 나타날 수 있는 부작용에 대한 연구가 필요하다고 언급하였다. 국내에서도 2015년 대한배뇨장애요실금학회를 통해 BPH 개선에 관한 SP의 효능에 대한 문제가 제기된 이후, 건강기능식품에 관한 법률에 따라 2017년 식품의약안전처에서 건강기능식품 재평가 계획을 발표하였다. 이와 같이 국내외적으로 SP에 대한 여러 부정적인 연구결과가 보고되고 있음에도 불구하고 SP는 여전히 LUTS 증상을 갖는 남성들을 위한 solution으로서 잘 팔리고 있기 때문에 SP의 세포독성 및 전립선 건강 개선 효과 유무에 대한 과학적인 근거뿐만 아니라, SP외에 안전성이 높은 천연물 유래 고 기능성 전립선 건강 개선 관련 소재를 개발할 필요가 있다.

한편 홍경천 (Rhodiola sachalinesis)은 해발 2,000 m 이상의 고산지대에서 자라는 다년생식물로 그 뿌리를 잘 건조하여 대체의약품의 소재로 사용하고 있다. 홍경천에는 phenylpropanoids, flavonoids, tannins, 배당체들과 유기산들이 풍부하게 함유되어있다 [16]. 홍경천의 주요 성분으로는 salidroside, rosavin과 ρ-tyrosol 등이 있어 우울증, 피로감과 인지기능 장애 개선효과가 있고, 항산화, 항염증, 항암, 심혈관 보호 및 신경 보호 효과가 있다고 알려져 있다 [17]. 현재 홍경천 추출물 (extracts of Rhodiola sachalinesis, RS)은 피로개선에 도움을 줄 수 있는 고시형 원료로 다양한 제품들이 개발되고 있으나, 전립선 건강 개선에 관한 효능은 검증된 바가 없어 제품화 되지 못하고 있는 실정이다. 그러나, 문헌 등에서는 홍경천이 스테미너 증진에 효과가 있고 혈행 개선에 도움을 준다는 보고가 있어 [18], 전립선 건강에도 효과가 있을 것으로 사료된다.

따라서 본 연구에서는 RS의 BPH 개선 효과를 평가하고, RS 단독 혹은 SP와의 병행처리를 통해 세포수준에서 BPH에 대한 개선 효과뿐만 아니라 SP의 세포독성을 약화시킬 수 있는 효과를 확인하여 향후 RS를 이용한 BPH 개선 건강기능식품 개발 등의 산업화를 위한 기초자료를 제공하고자 실시하였다.

2.1. 홍경천 추출물 제조

본 실험에 사용한 홍경천은 중국 티벳 자치구산으로 중국 연변대학교로부터 제공받았다. 잘 건조된 홍경천을 분말로 만든 후 분말 100 g을 50% 에탄올 용액 1 L에서 60분간 침지한 후 초음파 추출기 (SJC-II-50L, GREENAPPLE, Uhan, China)를 사용하여 30oC에서 30분간 2회 반복추출한 후 5,000 rpm에서 20분간 4oC의 조건에서 원심분리하여 그 상등액을 취하여 동결건조하였다. 동결건조한 홍경천추출물 분말을 진공포장하여 냉장보관하면서 하기 실험에 사용하였다.

2.2. 홍경천 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성

Blois의 방법 [19]을 준용하여 RS의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 즉, 95% ethanol에 용해시킨 0.1 mM DPPH (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 800 μL과 각 실험군 200 μL를 시험관에 넣고 3 분간 혼합하여 암실에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 남아있는 radical의 농도를 UV/Vis spectrophotometer (BioTec Ex800, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로는 ascorbic acid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였고, 농도범위는 0.5 mg/mL~0.025 mg/mL이었다. RS의 DPPH에 대한 소거능 (SC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.

Scavenging activity (%) = (1-A1/A0) × 100

A1 :시료 처리군의 흡광도

A0 :시료 무처리군의 흡광도

2.3. 홍경천 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성

ABTS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) radical 소거능은 Re 등의 방법 [20]을 변형하여 측정하였다. 증류수에 용해한 7 mM의 ABTS와 2.45mM potassium persulfate (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 1 : 1로 넣어 흡광도 값이 0.70 ± 0.02가 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하였다. 12-16시간 동안 암소에 방치하고 Radical stock solution은 희석된 용액 800 μL에 농도별로 제조된 시료 용액 200 μL를 각각 첨가하여 15분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 Trolox (Sigma St. Louis, MO, USA))를 사용하였고, 농도범위는 0.5 mg/mL~0.025 mg/mL로 측정하였다. ES의 ABTS에 대한 소거능 (IC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다. 항산화능은 시료첨가구와 무첨가군의 흡광도를 구하여 아래와 같이 백분율로 표시하였다.

Scavenging activity (%) = (1-A1/A0) × 100

A1 : 시료 처리군의 흡광도

A0 : 시료 무처리군의 흡광도

2.4. 세포배양

본 실험에 사용된 전립선 정상세포 (human prostate cell line, RWPE)와 전립선비대증 세포 (BPH-1)는 한양대학교 의과대학으로부터 분양받았으며, TM3 정소세포는 한국세포주은 행 (KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다.

RWPE 세포는 Defined Keratinocyte-SFM (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) 내에서 유지하였고, BPH-1 세포는 RPMI1640 배지 (WelGENE Inc., Daegu, Korea)내에서 배양하였다. TM3 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle’s 배지 (WelGENE Inc.)내에서 배양하였다. 모든 배지는 10% 우태아 혈청 (WelGENE Inc.) 및 100 unit/mL의 penicillin, 100 μg/mL의 streptomycin을 첨가하여 사용하고, 95%의 습도가 유지되는 37oC, 5% CO2 incubator (MCO-170AIC-PK, Panasonic, Sakata, Japan)에서 배양하였다. 세포가 바닥 면적의 90% 정도까지 자란 상태에서 계대 배양을 실시하였다.

2.5. MTT 분석

각 세포주에서 RS와 SP에 대한 세포생존율을 확인하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol)-2, 5-diphenyltetrasolium bromide, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 분석을 실시하였다. 각 세포주를 96-well plate에 1×105 cells/mL의 농도로 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, 시료를 각각 6.25~100 μg/mL의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 각 well에 5 μg/mL로 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 10 μL씩 첨가하여 다시 1시간 동안 반응시켰다. Formazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전히 제거하고, well 바닥에 형성된 formazan을 녹이기 위해 100 μL의 DMSO (Sigma St. Louis, MO, USA)를 첨가한 후, ELISA reader (SPECTRA MAX 190, Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 각 추출물들을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 세포생존율을 나타내었다.

2.6. Lactate dehydrogenase (LDH) 활성 분석

LDH 측정은 CytoTox detection kit (Takara, Shuzo Co., Ltd, Otsu, Japan)를 사용하여 측정하였다. 양성대조군은 시료를 처리 하지 않은 군으로, 음성대조군은 세포와 시료를 모두 처리하지 않은 것으로 정의하여 상대적인 LDH 생성 정도를 측정하였다.

2.7. DNA fragmentation 분석

Apoptotic-specific DNA fragmentation 정도를 정량하기 위해 Cell death detection ELISA plus kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 사용하였다. SP 및 RS을 각각 세포에 처리한 다음, lysate 상등액을 회수하였다. 상등액 20 μL를 streptavidin-coated plate에 옮긴 후, immune-reagent 80 μL를 각 microwell에 첨가하여 2시간동안 실온에서 반응시켰다. Incubation buffer로 각 well을 세척하고, substrate solution을 첨가하여 20~30분간 반응시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.8. 세포 내 testosterone 농도 측정

세포 내 testosterone 농도는 ELISA kit (Enzo, Farmingdale, NY, USA)를 사용하여 측정하였다. 배양이 끝난 후, 배지 100 μL를 goat anti-mouse IgG microtiter plate에 옮긴 다음, testosterone 항체를 첨가 후 1시간 배양하였다. 세척 후 stop solution을 첨가한 후 반응을 중지하고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.9. Western blot 분석

각 세포를 6-well plate에 세포수가 4×105 cells/well 이 되도록 분주하고 80% confluence로 배양한 후, SP와 RS를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 well을 pH 7.4인 PBS로 2회 세척한 후 세포를 채취하였다. Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 M DTT)를 사용하여 cell lysate를 준비하였고, 4oC의 조건에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 얻은 상등액을 총단백질 추출액으로 사용하였다. Bio-Rad protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 단백질을 정량하였으며, 단백질 100 μg과 sample buffer (60 mM Tris-HCl; pH 6.8, 2% SDS, 25% glycerol, 14.4 mM 2-mercaptaethanol, 0.1% bromphenol blue)를 혼합하여 100oC에서 10분간 끓인 후 냉각하여 전기영동하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 이전시킨 후, 5% skim milk를 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 1시간 정도 배양하여 비특이 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 PBS-T로 15분 정도 세척하였다. 준비된 membrane에 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4oC에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp, Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 특정 단백질의 발현 양을 확인하였다 (Amersham Imager 680, GE Healthcare BioScience, Uppsala, Sweden). 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology 사 (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science 사에서 구입하였다.

2.10. 통계처리

각 실험에서 얻어진 결과들은 평균±표준편차 (standard deviation, SD)로 나타내었고, 데이터 간 유의차는 Student’s t-test와 one-way analysis of variance(ANOVA)인 Duncan’s multiple range test를 이용하여 p < 0.05 수준에서 검증하였다.

3.1. 홍경천 추출물의 항산화 활성

RS의 DPPH 라디칼 소거활성과 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였을 때, 비타민 C는 2.4 μg/mL 농도에서 50%의 DPPH 라디칼 소거율을 나타낸 반면, RS은 8.7 μg/mL에서 50%의 DPPH 라디칼 소거율을 보였다 (Table 1). ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과, Table 2에서 보는 바와 같이 BHA는 IC50 값이 2.5 μg/mL 농도에서 50% 이상의 소거율을 보였으며, 5 μg/mL 농도에서 99% 이상의 소거율을 보인 후더 이상 증가하지 않고 그대로 유지하고 있는 것을 알 수 있었다. RS 또한 2.68 μg/mL 농도에서 50% 이상의 소거율의 높은 항산화능을 보였다. Cui 등 [21]과 Bae [22]의 결과에 나타난 바와 같이 70% 에탄올을 사용하여 50oC에서 8시간씩 3회 추출한 후 항산화 활성을 측정한 결과, 14.3~27.9 μg/mL 농도에서 50%의 라디컬 소거율이 확인되었다. 이에 비해 본 연구에서 초음파 추출법으로 추출한 RS는 보다 높은 항산화 활성을 나타내었으며, RS의 ABTS 라디칼 소거능은 DPPH 라디칼 소거능에 비하여 더 높게 나타났다. 이는 RS가 gallic acid, (-)-epigallocatechin-3-O-gallate, kaempferol 7-O-α-L-rhamnopyranoside, herbacetin 7-O-L-rhamnopyranoside, rhodiolin 등의 페놀 성분의 특성이나 함량의 차이 [23], 혹은 ABTS 라디칼 소거능 측정은 친수성 및 소수성에 모두 적용가능하기 때문에 DPPH 라디칼 소거활성 보다 더 높게 나타난 것으로 사료된다. 또한 RS에 주요하게 함유되어 있는 salidroside, tyrosol과 hydroxy tyrosol과 같은 phenylethanoids에 의한 것으로도 판단된다 [24,25].

Table 1 . DPPH radical scavenging activity of RS

RSVitamin C
Conc. (μg/mL)Activity (%)Conc. (μg/mL)Activity (%)
6.2537.33 ± 1.10.62512.52 ± 0.6
12.568.82 ± 0.21.2525.56 ± 0.1
2596.64 ± 0.92.552.0 ± 0.6
5097.90 ± 0.3599.69 ± 0.1
10098.01 ± 0.31099.5 ± 0.2
SC50 (μg/mL)8.77SC50 (μg/mL)2.4

Values were expressed as the mean ± SD (n=3)

As a standard, Vitamin C used


Table 2 . ABTS radical scavenging activity of RS

Conc. (μg/mL)Scavenging of ABTS (%)
RSBHA
0.62512.95 ± 0.4811.78 ± 0.36
1.2524.73 ± 1.1125.82 ± 1.38
2.546.52 ± 0.5651.56 ± 0.68
581.50 ± 0.2799.48 ± 0.16
1099.58 ± 0.1399.23 ± 0.63
SC50 (μg/mL)2.682.41

Values were expressed as the mean ± SD (n=3)

As a standard, BHA used


3.2. 쏘팔메토 열매추출물과 홍경천 추출물의 정소세포에 대한 세포독성

SP의 TM3 세포에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 SP를 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리 한 후 MTT assay를 실시하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, SP가 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL 농도에서 각각 91, 82, 74, 68, 61%의 세포생존율을 나타내어 농도 의존적으로 세포생존율이 감소함을 확인할 수 있었다 (Fig. 1(A)). 뿐만 아니라, SP 처리에 따른 세포 손상 증가에 따라 LDH 활성 증가가 확인되었다 (Fig. 1(B)). 그러나, RS을 처리하였을 때는 TM3 세포의 세포 생존율과 LDH 활성에 영향을 미치지 않았으므로 SP 단독처리와는 달리 세포독성이 없음을 확인하였다. Cui 등 [21]은 인간의 정상세포 293에 대한 홍경천 에탄올 추출물의 독성을 평가한 연구에서 비교적 낮은 수준의 독성을 나타냈다고 보고하여 본 결과에서와 같이 RS가 정상세포에 대한 독성은 매우 낮은 것으로 판단된다. 또한 Gao [26] 등의 동물실험 결과에서도 독성이 없는 것으로 나타났다. LDH는 세 포손상시 방출되는 효소로, 세포손상정도는 LDH 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다. 즉, RS와는 달리 SP는 농도의 존적으로 TM3 세포의 세포막 손상을 유도함으로써 LDH 방출을 증가시킨 것으로 사료된다.

Figure 1. Cytotoxicity of SP and RS in TM3 cells. A) Cells were treated with SP or RS for 24h at the indicated concentration and the relative cell viability was assessed using the MTT assay. B) Cytotoxicity of SP or RS measured with LDH toxicity assay kit. Results were expressed as the mean ± SEM of three independent experiments. *p<0.05 and **p<001 compared with the vehicle control.
3.3. 쏘팔메토 열매추출물과 홍경천 추출물이 전립선세포에 미치는 영향

상기와 동일한 방법으로 SP와과 RS의 RWPE 세포에 대한 세포독성 유무를 확인하였다. SP는 TM3 세포에서 나타난 결과와 마찬가지로 농도 의존적으로 RWPE 세포 생존율이 감소하여 50 μg/mL과 100 μg/mL 농도에서는 각각 74%, 61%의 세포생존율을 나타내었다. 세포손상 증가에 따라 LDH 활성 또한 대조군에 비해 50 μg/mL과 100 μg/mL 농도에서 각각 유의적으로 1.37에서 1.5배 증가하였다 (Fig. 2(A)). 그러나 SP를 BPH-1 세포에 처리하였을 때는 6.25 μg/mL에서 50 μg/mL 농도에 이르기까지 아무런 변화를 나타나지 않았으며, 100 μg/mL 농도에서는 약 41%의 세포생존율이 확인되었다. 그러나 100 μg/mL 농도에서 LDH 활성 또한 대조군에 비해 약 0.5배 감소한 것으로 보아, 이는 SP에 의한 독성이 아니라 세포생존율 감소에 따라 LDH 활성 또한 감소된 것으로 생각된다. 이와는 달리, RS는 RWPE 세포에서는 세포독성 없이 BPH-1 세포의 생존율이 농도 의존적으로 감소하였는데, 이는 전립선비대증 치료제로 사용중인 finasteride와 동일한 결과로 나타났다 [27].

Figure 2. Cytotoxicity of SP and RS in prostatic cells. A) RWPE prostate normal Cells were treated with SP or RS for 24h at the indicated concentration. B) BPH-1 prostatic hyperplasia cells were treated with SP or RS for 24h at the indicated concentration. The relative cell viability was assessed using the MTT assay. Cytotoxicity of SP or RS measured with LDH toxicity assay kit. Results were expressed as the mean ± SEM of three independent experiments. *p<0.05 and **p<001 compared with the vehicle control.
3.4. 홍경천추출물의 쏘팔메토 열매추출물에 대한 정소세포 독성 저해 효과

정소세포는 남성호르몬인 테스토스테론을 생산하여 남성의 전반적인 건강에 매우 중요한데, 전립선비대증과 같은 노령인구의 성호르몬 관련 질환 발생률이 높아짐에 따라 국민 건강의 삶의 질이 떨어지고 있다 [1,5]. 상기 SP 단독 처리가 TM3 세포에서 농도 의존적인 세포독성이 유도됨을 확인함에 따라 RS과 SP를 함께 처리하여 RS의 세포독성 저해효과를 확인하였다. 그리고 TM3 세포는 정자형성을 촉진하는 테스토스테론의 주요 근원지 이므로, RS와 SP 병용처리에 따른 세포 내 테스토스테론 농도를 확인하였다. Fig. 3(A)3(B)에서 나타난 바와 같이, SP를 단독으로 처리했을 때보다 RS와 병용 처리했을 때에 세포생존율이 유의적으로 증가하였고, 세포생존율 증가에 의해 LDH 활성은 감소하였다. 뿐만 아니라, 세포 내 테스토스테론 농도는 SP 50 μg/mL과 100 μg/mL에서 농도 의존적으로 감소하여 각각 2.4, 1.2 pg/mL로 나타난 반면, RS와 병용 처리하였을 때에는 점차적으로 증가하여 100 μg/mL 농도에서는 대조군에 비해서도 높게 나타났다 (Fig. 3(C)). 즉, SP 단독 처리군에 비해 RS와 병용처리하였을 때에 세포사멸을 억제시킴으로써 테스토스테론의 함량을 증가시키는 것으로 사료된다.

Figure 3. Inhibitory effect of RS on SP-induced cytotoxic TM3 cells. A) Cells were treated with SP and/or RS for 24h at the indicated concentration. The relative cell viability was assessed using the MTT assay. Cytotoxicity of SP or RS measured with LDH toxicity assay kit. B) Changes in the concentration of testosterone were measured from the treating TM3 cells. Results were expressed as the mean ± SEM of three independent experiments. *p<0.05 and **p<001 compared with the vehicle control.
3.5. 홍경천추출물의 쏘팔메토 열매추출물에 대한 전립선 비대증 세포사멸 상승효과

Fig. 4는 RWPE 세포에서 RS가 SP에 의해 유도되는 세포독성을 저해하는 효과를 나타낸 것이다. TM3 세포에서 나타난 저해 효과와 동일하게 RWPE 세포에서도 RS가 SP에 의한 세포독성을 저해하여 농도 의존적으로 세포생존율을 증가시키고, LDH 활성은 유의적으로 감소하였다. Fig. 1Fig. 2에서 본 바와 같이, RS는 SP와는 달리 TM3 세포와 RWPE 세포에서 독성을 나타내지 않고 BPH-1의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 SP와 RS를 병용처리함에 있어서, RS 농도를 달리하여 상승적 BPH-1 세포사멸 효과를 확인하였다. 먼저, BPH-1 세포에 SP 50 μg/mL을 동일하게 처리하면서, RS를 25, 50, 100 μg/mL로 각각 처리한 후 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, Fig. 5에서 나타난 바와 같이 SP 단독처리에 비해 RS와 함께 병용 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포생존율이 감소하였으며, SP와 RS를 1 : 2의 비율로 병용처리 하였을 때 세포생존율이 약 57%로 가장 크게 감소하는 것을 확인하였다. 그리고, 동일한 조건에서 세포사멸의 전형적인 현상인 DNA fragmentation 농도 또한 유의적으로 증가하였다. 세포사멸과 관련된 단백질의 발현을 살펴본 결과, RS가 농도 의존적으로 Bax 단백질의 발현을 증가시키고, Bcl2 단백질의 발현을 감소시켜 세포사멸 marker 단백질인 PCNA 단백질의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Finasteride를 BPH-1 세포에 처리하였을 때와 Finasteride를 6개월간 복용한 전립선 비대증환자의 조직염색 결과에서 TUNEL assay로 측정한 apoptotic index가 대조군에 비해 약 2배 가량 증가한 결과와 동일하게 나타났다 [27].

Figure 4. Inhibitory effect of RS on SP-induced cytotoxic RWPE prostate normal cells. Results were expressed as the mean ± SEM of three independent experiments. #p<0.05 compared with the SP-treated cells.
Figure 5. Synergistic effect of RS on the growth of BPH-1 cells. A) BPH-1 cells were treated with SP and/or RS for 24h at the indicated concentration. The relative cell viability was assessed using the MTT assay. B) Effects of different concentrations of RS on apoptosis in SP-treated BPH-1 cells after 24h exposure measured with Cell Death Detection ELISA kits. C) The assessment of protein expression levels were performed via western blot analysis. Results were expressed as the mean ± SEM of three independent experiments.#p<0.05 and ##p<0.01 compared with the SP-treated cells.

결론적으로 이 연구를 통해 RS는 SP와 병용 처리하였을 경우, TM3 혹은 RWPE와 같은 정상세포내 독성을 완화시킬뿐만 아니라 RS 단독 혹은 SP와 병용 처리하였을 때에도 BPH-1의 사멸을 유도하는 것을 확인함에 따라, RS가 전립선비대증 개선을 위한 유용한 천연물 소재로 활용될 수 있는 과학적 자료로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구는 RS가 SP 유래 독성을 감소시키고 BPH을 개선하는 효과가 있는지를 평가하기 위해서 수행하였다. 홍경천 분말을 50% 에탄올에서 초음파 추출하여 추출물을 제조하였다. SP는 고시원료를 구입하여 사용하였다. RS의 항산화능을 평가하였고 SP나 RS 단독처리와 SP-RS 복합 처리에 의한 TM3 세포, RWPE 세포, BPH-1 세포에 대한 독성을 시험하였다. 시험 결과 SP는 TM3 세포와 RWPE 세포에서 독성을 나타낸 반면, RS는 두 정상세포에서 독성을 나타내지 않았다. 반면에 SP는 BPH-1에서 세포 사멸 효과를 나타내지 않았으나, RS는 농도 의존적으로 BPH-1에 대한 세포 사멸효과를 나타냈다. SP-RS 복합 처리시 정상세포인 TM3 혹은 RWPE 세포에 대한 독성은 약화되었고, BPH-1세포에 대한 사멸 효과는 상승되었다. 이 결과들은 RS가 SP와 복합 처리하였을 경우에서 뿐만 아니라 단독으로 처리하였을 때에도 BPH-1의 사멸을 유도하여 BPH 개선을 위한 소재로 활용될 수 있음을 나타내었다. 또한, SP 100 μg/ml 농도는 RWPE 세포에서 유의적인 세포손상에 따른 LDH 활성 증가를 보였기 때문에, BPH-1에서 나타난 세포 생존율 감소로 전립선비대증 개선 효과가 있다 할지라도 SP 사용에 대한 보다 과학적인 자료가 필요할 것으로 사료된다.

This research was supported by the Regional Industry Nurturing Program (P0006400) of the Korean Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korean government.
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