본 실험에서 사용한 에센셜 오일 17종은 자몽 (grapefruit), 라벤더 (lavender), 라임 (lime), 레몬 (lemon), 레몬글라스 (lemongrass), 로즈마리 (rosemary), 만다린 (mandarin), 미르 (myrrh), 바질 (basil), 베르가못 (bergamot), 당귤 (sweet orange), 스피어민트 (spearmint), 시나몬 (cinnamon), 제라늄 (geranium), 클로브 (clove), 파인 (pine), 페퍼민트 (peppermint)의 에센셜 오일이었으며, 영국 Kerfoot사 (North Yorkshire, UK)의 제품을 사용하였다. 에센셜 오일 가용화 시 사용한 Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate)과 Tween 80 (polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate)은 Sigma사 (MO, USA)의 제품을 사용하였다. 시료의 희석용 용매로 Sigma사 (MO, USA)의 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 사용하고, 그 밖의 시약은 1급 이상의 것을 사용하였다.

구강 세균에 대한 에센셜 오일의 항균 활성을 확인하기 위하여 한국생물자원센터 (KCTC)에서 5종의 균주 (Streptococcus mutans KCTC 3065, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Lactobacillus casei KCTC 3109, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Escherichia coli KCTC 2441)를 분양받아 사용하였다. 분양받은 동결보존 균주를 액체 배양하여 균을 활성화시켰으며, 2번의 계대배양 후 실험에 사용하였다. Streptococcus mutans와 Lactobacillus casei 배양용 배지로 Brain Heart Infusion과 Lactobacilli MRS Broth (Becton Dickinson, MD, USA)를 각각 사용하였고, 그 외의 균주는 Nurient Broth (Becton Dickinson, MD, USA)를 사용하였으며, 37℃에서 48 hr 동안 균을 배양하였다.

에센셜 오일 100 μL에 Tween 20과 Tween 80을 각각 50 μL씩 첨가하여 혼합하였다. Vortex mixer를 이용하여 vortexing한 후 증류수 800 μL를 주입하여 최종 농도가 100 μL/mL(v/v)가 되도록 제조하였다.

Paper disc method를 이용하여 1차 항균 활성 분석을 하였다. 계대배양한 고체 배지에서 각 균주를 1 백금이씩 취하고 멸균 생리식염수와 혼합시켜 균 현탁액을 제조하였다. 균 현탁액 1 mL씩 페트리 디쉬에 주입한 후 각각의 배지와 한천을 이용하여 배지를 제조하였다. 주입 평판법으로 제조한 배지에 8 mm paper disc를 놓고 마이크로 피펫을 사용하여 에센셜 오일을 20 μL씩 분주하였으며, 37^oC에서 24 hr 동안 배양하여 저해환을 관찰하였다.

Paper disc method를 통해 1차 스크리닝된 소재의 최소저해 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 분석하였다. Syringe filter (0.45 μm × 25 mm)를 이용하여 가용화시킨 에센셜 오일을 여과 멸균한 다음 각각 50 μL씩 96 well plate에 분주하였다. 1 × 10⁵~10⁶ CFU/mL로 균수를 조정한 균 현탁액을 Well 당 50 μL씩 가한 후 150 μL의 액체 배지를 주입하여 24 hr 동안 배양하였다. 3 hr 간격으로 620 nm에서 microplate reader (VERSAmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 최소저해농도는 배양하는 동안 흡광도의 변화가 없는 농도로 결정하였다.

pH에 대한 효능 안정성 평가는 가용화시킨 에센셜 오일을 각각 pH 3, pH 5, pH 7 및 pH 9로 조절하여 3 hr 동안 노출시킨 다음 pH의 변화에 따른 MIC를 측정하여 효능 안정성을 평가하였으며, pH 조절은 1 N HCl과 1 N NaOH 수용액을 사용하였다.

온도에 대한 안정성 평가는 가용화시킨 클로브 오일을 4^oC, 25^oC, 50^oC 및 75^oC에서 30 min 동안 노출시킨 다음 MIC를 측정하여 효능 안정성을 평가하였다. 자외선에 대한 안정성 평가는 가용화시킨 자외선 조사환경에서 클로브 오일을 3일간 노출시키고 24 hr 간격으로 샘플링하여 MIC를 측정해 자외선 조사에 따른 효능 안정성을 평가하였다. UV lamp (119.9 × 2.6 cm, 253.7 nm, 36 W, Philips, Netherlands)를 자외선 광원으로 사용하였고, 시료는 광원으로부터 60 cm 정도 떨어진 상태로 자외선을 조사하여 노출시켰다. 24 hr 간격으로 채취한 시료는 알루미늄 호일을 이용하여 감싸서 보관하였다.

17종 에센셜 오일의 항균 활성을 확인하기 위하여 4종의 구강 세균 (Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis 및 Klebsiella pneumoniae)과 E. coli를 사용하였고 paper disc method를 이용하여 실험하였다. S. mutans, L. casei와 S. epidermidis는 그람 양성균이며, K. pneumoniae와 E. coli는 그람 음성균이다. 8 mm paper disc를 미리 제조한 평판 배지 위에 놓고 에센셜 오일을 20 μL씩 분주하여 37^oC에서 24 hr 동안 배양한 후 저해환의 크기를 측정한 결과는 Table 1과 같다.

Table 1 . Antibacterial activities of essential oils against oral bacteria and E. coli using paper disc method

Essential oil	Scientific name	Used part	Zone of inhibition (mm)
			S. mutans	L. casei	S. epidermidis	K. pneumoniae	E. coli
Grapefruit	Citrus grandis	Peel	12	10	21	-	15
Lavender	Lavandula angustifolia P. Miller	Flower	11	-	22	11	12
Lime	Citrus aurantifolia	Peel	-	-	13	-	-
Lemon	Citrus limonum (L.) Burm.	Peel	-	-	13	-	-
Lemongrass	Cymbopogon citrates	Leaf	20	17	25	13	12
Rosemary	Rosmarinus officinalis L.	Leaf	-	-	12	-	-
Mandarin	Citrus nobilis	Peel	-	-	16	12	-
Myrrh	Commiphora myrrha	Resin	-	-	-	13	-
Basil	Ocimum basilicum	Leaf	-	14	21	15	12
Bergamot	Citrus aurantium bergamia	Peel	17	17	20	11	13
Sweet orange	Citrus sinensis	Peel	11	-	19	-	12
Spearmint	Mentha viridis	Leaf	14	10	20	18	12
Cinnamon	Cinnamomum zeylanicum	Bark	15	22	23	15	17
Geranium	Pelargonium graveolens	Flower	-	-	16	-	10
Clove	Syzygium aromaticum	Bud	20	23	28	15	17
Pine	Pinus sylvestris L.	Leaf	11	13	21	14	16
Peppermint	Mentha piperitat	Leaf	11	-	18	11	10

그람 양성균인 S. mutans를 접종한 평판 배지에 클로브 (clove), 레몬글라스 (lemongrass) 오일을 첨가한 경우 저해환의 크기가 각각 20 mm로 가장 큰 저해 활성을 보였으며, 베르가못 (bergamot) 과 시나몬 (cinnamon) 오일의 경우 저해환의 크기가 각각 17 mm와 15 mm으로 나타났다. 그람 양성균인 L. casei의 경우 클로브 오일과 시나몬 오일의 경우는 각각 23 mm와 22 mm의 저해환을 나타냈다. 지의류 추출물이 S. mutans와 L. casei에 대하여 균 증식 억제력이 각각 15 mm에서 29 mm 사이의 값을 나타냈다고 보고된 바 있으며 [13], 본 연구에서의 결과와 유사한 결과라고 판단된다.

그람 양성균인 S. epidermidis의 경우 미르 (myrrh) 오일을 제외한 모든 에센셜 오일에서 저해 활성을 나타났으며, 이중 클로브 오일과 레몬글라스 오일의 경우 저해환의 크기가 각각 28 mm과 25 mm로 저해 활성이 비교적 큰 것으로 보였다. 이와 같은 결과는 구강 세균인 S. epidermidis로 정향 (클로브)의 열수추출물의 항균성을 확인하였을 때 14 mm의 저해환이 나타났다는 보고 [14]에 비해 높은 항균 활성을 보인 결과이다.

그람 음성균인 K. pneumoniae 평판의 경우 스피어민트 (spearmint) 오일의 저해환의 크기가 18 mm로서 가장 큰 저해 활성을 보였으며, 클로브 오일 등 다양한 오일에서 저해환의 크기가 11-18 mm의 값을 보였다. 민트류 정유는 K. pneumoniae에 대해 낮은 농도에서도 높은 항균 활성이 나타났다는 보고와 유사한 결과이다 [15].

E. coli의 경우 클로브와 시나몬 오일의 저해환 크기는 각각 17 mm로서 가장 높은 저해 활성을 보였으며, 이 외의 오일들은 10-16 mm의 생육 저해환을 보였다. Kim 등 [16]의 연구에 따르면 5% 미르 (myrrh) 정유에서 28 mm의 저해환을 나타냈다고 보고된 바 있다.

위의 결과를 종합해 보면 4종의 구강 세균과 위생 지표균에 대한 항균 활성을 측정한 결과 17종 에센셜 오일 중 클로브, 레몬글라스, 시나몬, 베르가못, 스피어민트, 파인 오일이 모든 균에서 높은 항균 활성을 보였고 이를 구강 관련 항균 소재로 1차 스크리닝하였다. 에센셜 오일은 그람 음성보다 양성에 대해 효과가 큰 것으로 알려져 왔는데 이것은 에센셜 오일은 소수성인 반면 그람 음성균의 외막에 있는 다당체가 대부분 친수성이기 때문인 것으로 알려져 있다 [17]. 본 실험에서 사용한 그람 양성균 3종 (S. mutans, L. casei 및 S. epidermidis)과 그람 음성균 (K. pneumoniae와 E. coli)에 대한 저해환을 비교하면 클로브, 레몬글라스, 시나몬, 베르가 못의 경우 그람 양성균에서 그람 음성균보다 더 높은 항균활성을 나타냈다.

앞서 스크리닝한 에센셜 오일 6종 (클로브, 레몬글라스, 시나몬, 베르가못, 스피어민트, 파인)의 구강 세균 4종 (S. mutans, S. epidermidis, L. casei 및 K. pneumoniae)과 E. coli에 대한 정량적인 항균 능력을 측정하기 위하여 최소저해농도를 측정하였고, 균 현탁액을 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하는 방법으로 분석하였다. 그 결과는 Table 2와 같다.

Table 2 . Minimum inhibitory concentration (MIC) of selected essential oils against oral bacteria and E. coli

Essential oil	Inhibitory concentration (%(v/w))
	S. mutans	L. casei	S. epidermidis	K. pneumoniae	E. coli
Lemongrass	0.0025	0.0025	0.00031	0.00125	0.00125
Bergamot	0.02	0.01	0.00063	0.0025	0.0025
Spearmint	0.01	0.01	0.00063	0.0025	0.005
Cinnamon	0.00125	0.00125	0.00031	0.00125	0.00063
Clove	0.00125	0.00125	0.00031	0.00063	0.00063
Pine	0.02	0.01	0.00063	0.005	0.005

S. mutans에 대한 앞서 스크리닝한 에센셜 오일 6종의 MIC를 측정한 결과 시나몬과 클로브 오일에서 미생물 성장이 억제되는 MIC는 0.00125%(v/w)로 확인할 수 있었으며, 레몬글라스, 스피어민트 오일은 각각 0.0025%(v/w)과 0.01%(v/w)의 MIC 값을 나타냈다. 이와 같은 결과는 S. mutans 등 구강 세균 9종에 대한 정향 (클로브) 오일의 항균 활성을 측정한 결과 0.1~0.8 mg/mL (0.01~0.08%)의 MIC를 확인한 Moon 등 [18]의 결과에 비하여 높은 값이었다.

L. casei에 대한 에센셜 오일의 MIC를 측정한 결과 시나몬과 클로브 오일이 각각 0.00125%(v/w)의 MIC를 보였으며, 레몬글라스 오일이 0.0025%(v/w)의 농도에서 미생물의 성장을 억제하였다. 그 외 오일은 0.01%(v/w)의 MIC 값을 나타내 비교적 높은 값이 측정되었다.

S. epidermidis에 대한 레몬글라스, 시나몬, 클로브 오일의 MIC를 측정한 결과 0.00031%(v/w)의 낮은 농도에서 생육 저해가 일어나는 것으로 나타났으며, 스피어민트, 베르가못, 파인 오일은 비교적 높은 0.00063%(v/w)농도에서 미생물의 성장이 억제되었다. Jeong 등 [14]은 구강에서 분리된 S. epidermidis에 대한 클로브 (정향)의 열수추출물의 MIC 값이 1,000 μg/ml(0.1%)라고 하였다. 이 결과는 본 연구의 결과에 비하여 높은 농도에서 S. epidermidis의 성장을 억제하는 것으로 판단된다. 그 이유는 클로브 오일이 클로브의 열수추출물보다 플라보노이드 및 페놀 등의 성분이 다량 함유되어 있어 낮은 농도에서도 미생물의 성장이 저해되기 때문인 것으로 사료된다.

K. pneumoniae에 대한 에센셜 오일의 MIC를 측정한 결과 클로브 오일의 MIC가 0.00063%(v/w)로 측정되었으며, 그 외의 에센셜 오일은 각각 0.00125-0.005%(v/w) 사이의 MIC가 측정되었다. Lee 등 [19]이 K. pneumoniae에 대하여 5.0%의 MIC 값을 갖는 것으로 보고 한 탱자즙에 비하여 클로브 오일은 더 낮은 농도에서 저해활성을 보였다고 판단된다.

E. coli에 대한 에센셜 오일의 MIC를 측정한 결과 시나몬과 클로브 오일이 0.00063%(v/w)의 MIC 값을 나타냈다. Ahn 등 [20]의 연구에서 편백 정유의 E. coli에 대한 MIC를 측정한 결과 0.1 ± 0.05%의 농도에서 MIC가 측정되었는 바, 클로브와 시나몬 오일의 항균 활성이 더 우수하다고 사료된다.

본 실험에서 에센셜 오일 6종 (클로브, 레몬글라스, 시나몬, 베르가못, 스피어민트, 파인)의 구강 세균 4종 (S. mutans, S. epidermidis, L. casei, K. pneumoniae)과 E. coli에 대한 최소저해농도 (MIC)를 측정한 결과 그람 음성균과 그람 양성균 모두에서 클로브 오일이 낮은 MIC 값을 보여주어 구강 세균 관련 항균 소재로 적합한 것으로 판단되었다.

클로브 (clove)는 향신료의 한 종류이며 도금양과 (Myrtaceae)의 상록 소교목의 꽃으로, 인도네시아, 스리랑카, 탄자니아, 브라질 등 여러 지역에서 재배되고 있다 [21]. 정향 (丁香, Syzygium aromaticum)이라고도 하며, 식품, 화장품 및 의약외품 등으로 사용되거나 치통 완화의 효과가 있어서 치과용 진통제 등으로 이용되고 있다. 클로브 오일의 주요 성분으로는 eugenol이 75% 이상 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 그 외에 eugenyl acetate, 2-heptanone, β-caryophyllene 등의 성분을 포함하고 있다 [22].

클로브 오일에 대한 연구현황을 살펴보면 사카자키균 및 칸디다균에 대한 항균효과 등에 대해 보고가 되어 있으며, 클로브 내 eugenol 성분이 플루코나졸 내성 균주에 대해 항균 활성을 보였으며, 곰팡이에 대한 항진균 활성이 있다고 보고되었다 [23]. 또한 Devi 등 [24]은 클로브 오일의 eugenol 성분이 Salmonella typhi의 세포막을 파괴하여 항균 효과를 가지고 있다고 발표하였다. 그리고 클로브 오일의 항산화 및 항염증 효과에 대하여 보고되었다 [25]. An 등 [26]은 식물 정유 중 제초제로서의 클로브 오일의 사용 가능성을 확인하였으며, 광 조건에서도 항균 효과가 있다고 보고한 바 있다.

에센셜 오일은 의약외품 등에 적용할 경우 원료 배합 등으로 인해 pH의 변화가 발생할 수 있다. 본 연구에서 클로브 오일이 pH의 변화에 항균 활성이 영향을 받는지 확인하기 위해 pH 3, 5, 7, 9에 각각 3 hr 동안 노출시킨 후 기존의 pH로 조정하여 MIC를 측정하였다.

pH의 변화에 따른 클로브 오일의 MIC를 측정한 결과는 다음과 같다. S. mutans, S. epidermidis, K. pneumoniae 및 E. coli의 경우 pH 3, pH 5, pH 7 및 pH 9에서 모두 동일한 MIC 값 (0.00063%(v/w))이 측정되었다. L. casei의 경우 모든 pH 조건에서 0.00031%(v/w)의 MIC 값이 측정되었다. 이는 Yoon 등 [27]의 연구에서 8 mg/mL의 농도에서 모자반 ethanol 추출물의 pH를 2에서 10으로 조절하여 24 hr 동안 방치한 다음 항균 활성을 측정한 결과 모든 pH 범위에서 항균 활성이 안정된 것을 확인한 결과와 유사하다. 결과적으로 클로브 오일은 pH 3에서 pH 9 범위까지 항균 활성이 안정적인 것으로 나타났으며, 이는 구강 제품뿐만 아니라 화장품과 식품 보존료 등으로의 적용 가능성을 높이는 결과로 판단된다.

클로브 오일의 항균 활성이 온도의 변화에 영향을 받는지 확인하기 위해 4, 25, 50, 75^oC에서 각각 30 min 동안 노출시킨 다음 방냉 후 MIC를 측정하였다. 온도의 변화에 따른 클로브 오일의 MIC를 측정한 결과 S. mutans, S. epidermidis, K. pneumoniae 및 E. coli의 경우 열처리를 하지 않은 대조군 (control)과 함께 모든 실험군 (4^oC, 25^oC, 50^oC, 75^oC)에서 동일한 값의 MIC (0.00063%(v/w))가 측정되었다. 마찬가지로 L. casei의 경우 모든 온도에서 0.00031%(v/w)의 동일한 MIC 값을 나타내어, 클로브 오일이 구강 세균과 위생 지표균에 대한 항균 활성이 온도에 민감하지 않은 것으로 확인되었다.

에센셜 오일은 그 유용 성분이 빛에 의해 파괴되는 것을 방지하거나 산화를 방지하기 위하여 일반 유리병이 아닌 갈색 유리병에 보관한다. 클로브 오일의 항균 능력이 자외선 노출에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해 자외선을 0 hr, 24 hr, 48 hr, 72 hr 동안 조사한 뒤 MIC를 측정하였다. 클로브 오일을 자외선에 노출시킨 후 MIC를 측정한 결과, S. mutans, K. pneumoniae 및 E. coli의 경우 자외선을 노출시키지 않은 대조군과 시간대별로 자외선을 노출시킨 모든 실험군에서 0.00063%(v/w)의 동일한 MIC가 측정되었다. L. casei의 경우 자외선을 노출시킨 클로브 오일의 MIC 값과 자외선을 노출시키지 않은 클로브 오일의 MIC 값이 각각 0.00031%(v/w)로 같은 수치를 나타냈다. 이상으로 클로브 오일의 항균 활성이 자외선의 영향에 민감하게 영향을 받지 않고 안정적인 것으로 판단되었다.