Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)은 중국의 우한에서 최초로 발발하며 전세계로 퍼져 나가고 있다. 2020년 12월 6일인 현재 전세계적인 확진 환자는 66,540,025명에 달하며 사망자도 150만명을 넘어서고 있다. 이는 대한민국에서도 예외가 아니다. 2020년 12월 6일을 기준으로, 대한민국의 확진 환자는 37,546명으로 집계되며 사망자도 5백 명대를 넘어섰다. 일명 ‘코로나 사태’라고도 불리는 현재의 심각한 상황은 완연한 백신이 나오기까지 지속될 것으로 보이며 각국은 COVID-19으로 인한 피해를 최소화하기 위해 방역에 힘쓰고 있다.

이러한 상황에서 COVID-19에 감염된 환자를 제대로 진단해내는 것은 단연코 중요한 문제가 아닐 수 없다. COVID-19을 유발하는 바이러스인 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 검사법은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 분자(핵산) 검출을 기반으로 하는 검사법과 면역을 기반으로 하는 검사법이다. 두 가지 방법 모두 나름의 장단점이 있으나, 현재 우리나라에서 사용하고 있는 것은 분자 (핵산) 검출을 기반으로 하는 검사법이다. 2020년 1월 20일에 국내 첫 확진 환자가 발생한 이후, 한국은 약 2주 뒤인 2월 4일에 COVID-19 진단을 위한 첫 real-time RT-PCR 진단키트를 긴급 승인하였으며 이후에도 여러 키트들이 추가적으로 승인되었다 [1]. 지난 11월 식품의약품안전처에서 공개한 바에 따르면 현재 국내에서 정식으로 사용 허가된 진단키트는 9개 제품에 해당하는데, 이들 중 7개가 핵산검출을 기반으로 하는, 즉 RT-PCR을 이용한 제품이다.

RT-PCR에서 중요한 요소는 여러 가지가 있으나, 민감도와 특이도에 직접적으로 결부되는 것들 중 하나가 바로 primer의 서열이다. 성공적인 PCR 반응은 거의 대부분 이것에 달려 있다 [2]. 좋은 primer일수록 표적 유전자에 정확하게 접근하여 달라붙는데, PCR 반응이 이 primer를 붙이는 것에서부터 시작하니 정확한 결과를 얻어내기 위해선 반드시 필요한 과정이다 (Fig. 1).

Figure 1. COVID-19 Diagnostic Techniques.

현재 SARS-CoV-2에 대한 연구가 매우 활발한 만큼, 공개되어 있는 primer와 probe set의 수도 상당하다. 하지만 이들 모두 표적으로 하고 있는 유전자는 한정적이기에, 본 총설에서는 이들을 중심으로 SARS-CoV-2의 진단에 사용되는 primer의 종류와 신뢰성 및 정확도에 대해 다뤄보고자 한다.

2.1. SARS-CoV-2

코로나 바이러스는 envelope를 가지고 있으며, positive sense의 단일 가닥 RNA를 유전체로 가지는 바이러스이다. 코로나 바이러스 입자는 구형이며 envelope의 표면은 spike (S) protein으로 덮여 있다. 그리고 membrane protein과 envelope protein은 S protein 사이에 위치한다. 유전체인 RNA와 인산화된 nucleocapsid (N) protein은 나선형의 nucleocapsid를 형성하는데, 이는 envelope 안에 있다. 전체적인 유전체의 크기는 대략 30kb에 달하고 이에 속하는 유전자들은 여러 구조 단백질(spike, envelope, membrane, nucleocapsid)과 구조 단백질이 아닌 단백질들을 암호화하고 있다 [3,4].

SARS-CoV-2의 유전체 크기는 대략 26에서 28 kb 정도인데, 이 바이러스의 유전체 구조는 코로나 바이러스에서 알려진 특징들을 따르고 있다. 간단히 묘사해 보자면 다음과 같다. 유전체의 5’ 방향으로부터 약 2/3 이상이 ORF1ab gene을 포함하고 있으며 이들은 ORF1ab polyprotein을 암호화한다. 또한 3’ 방향으로부터 나머지 1/3가 구조 단백질들을 암호화 하고 있는데, spike, membrane, envelope, nucleocapsid로 위에서 말한 것과 같다. 그리고 이들 사이에 6개의 accessory proteins을 암호화하는 유전자들이 포함된다. 5’ cap과 3’ polyadenylate tail의 구조도 가지고 있다 [5,6]. 이들 중 ORF1ab, E, N gene은 sarbecoviruse에서 매우 잘 보존되어 있으며, RNA dependent RNA polymerase (RdRp)를 암호화 하는 유전자는 ORF1ab 내에 위치하고 RNA 합성에 중요한 역할을 한다 [2]. 잘 보존된 지역들은 보통 primer sets를 디자인하는 데에 타겟으로 선택되는데 물론 이들 외에 다른 유전자들도 선택될 수 있다.

Figure 2. Phenotype of SARS-CoV-2 [4].

Figure 3. SARS-CoV-2 genome [5].

2.2. 핵산 기반 분석법

2.2.1. RT-PCR

이는 현재까지 대부분의 국가에서, SARS-CoV-2를 검출하기 위해 사용하는 보편적 방법에 해당한다.

Polymerase chain reaction (PCR)은 DNA의 증폭과 검출에 있어 매우 민감도가 높고 특이적인 방법이다. 방법 자체도간단하며 소량의 DNA도 검출해낼 수 있기 때문에, 세균이나 곰팡이 등 매우 넓은 범위의 병원체들을 진단하는 것에 쓰여 왔다. 하지만, 코로나 바이러스의 유전체는 DNA가 아닌 RNA이다. 그런고로, RNA는 reverse transcription (RT)-PCR이라는 방법에 의해 검출되어 왔다. 이 방법은 크게 두 단계, 즉 두 효소에 의해 이루어진다. 첫 번째 단계에서는 reverse transcriptase, 다른 말로 RNA-dependent DNA polymerase라는 효소를 사용한다. 이를 통해 바이러스의 RNA를 DNA (cDNA)로 복제한다. 두 번째 단계는 통상적인 PCR로, 보통 Taq polymerase를 사용한다 [7].

RT-PCR에서 단연 중요한 것은 primer의 서열이다. 그 서열이 바이러스의 genomic RNA와 상보적으로 잘 맞아야 하며, 타겟으로 하는 바이러스만을 특이적으로 인식할 수 있어야 한다. 그러므로 이 총설에서는 SARS-CoV-2를 검출할 때 사용되는 여러 primer들을 살펴보고, 이에 대해 논의해보고자 한다.

2.2.2. SARS-CoV-2 진단을 위한 Primers

Primer는 진단을 위한 타겟 부분을 정확히 amplification하기 위한, genome의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA의 작은 조각이다 [4]. 어떤 것이 더 좋은 primer인지를 판단할 수 있는 척도는 민감도와 특이도로, 흔히 두 가지이다. 민감도는 쉽게 말해 양성을 양성이라고 잘 잡아내는 정도이고, 특이도는 음성을 음성이라고 잘 잡아내는 정도이다. 앞으로 언급할 여러 연구들도 이러한 척도를 통해 primer가 잘 기능하는지 판가름하였다.

Primer를 디자인하는 과정은 보통 다음과 같다. 우선 타겟이 되는 유전자를 선택한다. SARS-CoV-2에서 후보가 될 수 있는 유전자로는 ORF1/RdRp, N, E, S gene 등이 있다. 그리고, 각각의 gene들마다 최적의 target sequence를 찾아 그것을 기반으로 하는 primer를 디자인하는 것이다. 이 때 선택되는 지역은 돌연변이가 잘 일어나지 않는, 매우 잘 보존되는 지역이어야 한다. 특히, RNA 바이러스의 경우 돌연변이율이 높기에 더욱 그렇다. 이후에는 선택된 primer가 in silico 상에서 기능을 하는지 판단하고, dimerization 등의 반응이 일어나는지를 확인한 후, 그 primer sets를 실험실 내에서 실험적으로 확립하며 그 과정 상에서 나타나는 여러 문제들을 파악하고 최적화한다 [2,8].

Nalla et al.이 7개의 서로 다른 primer들을 가지고 SARS-CoV-2의 검출을 시행한 결과, The University of Washington (UW)의 RdRp primer sets, Corman et al.의 N gene, RdRp, E gene primer sets, The Centers for Disease Control and Prevention (CDC)의 N1, N2, N3 primers sets 이중 Corman et al.의 E gene을 이용한 primer가 가장 민감도와 특이도가 높았다. 하지만 이들 모두, 적어도 이 연구에서는 false positive 없이 100% 특이적이었으므로 신뢰도가 높다고 볼 수 있다. 하지만 같은 RdRp를 타겟으로 한다고 해도 UW보다 Corman et al. 쪽이 더욱 민감도가 높았고, Corman et al.의 primer 중에서도 E gene을 타겟으로 하는 primer sets가 민감도가 높았다 [9]. 그러니 타겟으로 더욱 유용한 유전자가 있다고도 볼 수 있고 같은 유전자를 타겟으로 한다 해도 어떤 서열을 타겟으로 하는가에 따라 다르다는 것을 알 수 있다. 반면, Corman et al.의 protocol에 조금 다른 견해를 표현한 연구도 있었다. Corman et al.이 그 primer를 만든 것은 virus isolates의 서열정보가 공개되기 전이었다. 즉, 그것은 완전히 SARS-CoV-2에만 특이적인 primer는 아니었다는 것이다. 그러니 E gene을 타겟으로 한 진단에서 양성을 보이는 샘플을, 코로나 바이러스의 RdRp에 붙는 primer sets로 재검사를 해야 했다. 그연구에서는 SARS-CoV-2에만 특이성을 나타내는 primersets를 새롭게 디자인했는데, 결과적으로 M gene을 타겟으로 하는 primer sets가 가장 민감도, 특이도가 좋았다. 여기서, primer sets를 디자인할 때 고려해야 할 새로운 관점이 나오는데, 발현되는 양이다. N, S, M gene의 경우 매우 풍부하게 발현되므로, RdRp와 E gene에 비하여 진단에 매우 민감한 타겟으로 쓰일 수 있다 [10]. N gene과 ORF1 gene을 타겟으로 하는 서로 다른 10개의 primer sets를 비교한 논문도 있었는데, 그 논문의 경우 결과적으로 큰 차이 없이 비슷했고, 다만 몇몇 primer가 더욱 민감도가 높긴 하였으나 다들 잘 기능했다고 보고했다 [11].

E gene을 타겟으로 하는 primer는 논문에 따라 차이가 있었다. 몇몇 샘플에서 아예 특이적이지 못하다고 하는 연구도 있었고 [12], 민감도가 아주 높으며 결과가 좋았다고 하는 연구도 있었다 [9,13]. Mollaei et al.의 연구에서는 SARS-CoV-2의 5개 유전자에 대해서 각각의 primer sets를 비교했다. 그 결과 N gene이 양성을 가장 잘 잡아냈으며 높은 민감도를 보였고, E gene이 가장 뒤떨어졌다. 이는, SARS-CoV-2 내에서 그 유전자가 얼마나 풍부하게 존재하는가에 따라 달라지는 것으로 추정된다. E gene은 그리 높은 비중을 차지하지 않고, N gene은 그에 비해 풍부하게 존재하는 편이다 [12]. 하지만 앞에서도 언급했듯이, 더욱 이른 시기에 행해졌던 Corman et al.의 연구에서는 정확히 반대였다. RdRp gene과 E gene, N gene을 타겟으로 하는 primer sets을 만들었을 때, RdRp gene과 E gene의 결과가 더 좋았으며 N gene의 경우는 민감도가 더 떨어졌다고 보고했었다 [13]. 물론 이 연구는 SARS-CoV-2의 isolates가 없던 시기에, SARS-related sequence를 토대로 primer sets를 디자인하긴 했다. 하지만 앞서 말했듯이 Nalla et al.의 연구에서 Corman et al.의 E gene을 타겟으로 하는 primer sets가 가장 결과가 좋았다고 하는 것을 보면, 비록 SARS-CoV-2만을 타겟으로 한 것은 아니지만 충분히 잘 기능하고 있는 것처럼 보인다.

반면, N gene의 경우는 대부분 평이 좋았다 [2,11,12]. Corman et al.의 논문에서도 E gene이 더 좋다고 할 뿐이지 N gene 자체가 primer target으로 뒤떨어진다고 하지는 않았다. 사실, E gene의 경우도 위에서 언급한 Mollaei et al.의 논문을 제외하면, 적어도 내가 참고한 문헌에서는 특별히 부정적인 평가는 없었다. M gene의 경우는 ORF1/RdRp, E, N, S gene에 비해 SARS-CoV-2 진단을 위한 타겟으로 빈번하게 사용되는 유전자가 아니며 [14], 이 총설의 2.2.3. 항목에서 다룬 상업적인 키트에서는 단 한 번도 타겟 유전자에 포함된 경우가 없었으나, 이 역시 이것이 가장 좋은 결과를 냈다고 하는 논문도 있었다 [10,11]. 물론, 이들 모두 사용한 서열은 달랐기에 거기에서 오는 차이였을 것이라 생각된다. 하지만 거의 대부분이 primer 제조의 타겟으로 한 모든 유전자에서 결과가 좋았다. 단지 연구들마다 민감도와 특이도 등에서 서로 조금씩 차이를 보였을 뿐이다.

본 결과, 각각의 연구마다 민감도가 높은 유전자가 다르다. 각기 target으로 하는 유전자가 같아도, 정확한 region은 다르기에 만드는 주체에 따라 차이가 있는 듯하다. 그러니 민감도를 더 확실히 높이기 위해서는, 하나의 target만을 설정하기 보다 여러 개의 target을 설정하여 진행하는 게 나을 것이다. 그리고 시중에 판매중인 COVID-19 진단키트들은 실제로 그렇게 했다. 다수의 region을 타겟으로 설정해야 하는 데에는 다른 이유도 더 있다. SASR-CoV-2는 단일 가닥의 RNA를 유전체로 가지는 바이러스이다. 그러므로 복제에 RNA dependent RNA polymerase (RdRp)를 사용하는데, 이 효소는 일부 예외를 제외하고는 거의 proofreading 기능이 결여되어 있어 돌연변이율이 높다. SARS-CoV-2도 역시 그러하다. 물론 앞서 말했듯이 primer의 서열은 최대한 잘 보존되어 있는 구간으로 선정하지만, 그렇다 해서 돌연변이로부터 완전히 안전한 것은 아니다. 즉, 앞으로 발생할 수 있는 SARS-CoV-2의 새로운 유전적인 변이가 RT-PCR 진단기법의 민감도와 특이도를 떨어뜨릴지도 모른다. 특히, 자연적인 돌연변이뿐만 아니라 viral recombination 또한 primer의 annealing 효율을 낮출 수 있으며 그 결과 민감도에 영향을 주거나, 양성을 잘 잡아내지 못하는 등 여러 문제를 야기할 수 있다 [3].

또한 첨언하자면, 실험에 사용한 RNA extraction 방법의 영향도 간과할 수 없는데 Nalla et al.의 경우 MagNA Pure LC 2.0과 MagNA Pure 96 (Roche Life sciences) 두 개의 system을 사용하였으며, Corman et al.의 경우 MagNA Pure 96만을 사용하였고, 위에 언급한 N gene과 ORF1 gene을 타겟으로 하는 서로 다른 10개의 primer sets를 비교한 논문 [11]에서는 QIAamp viral RNA extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하는 등 차이가 있었다. 논문 간의 비교에는 이러한 tool의 영향도 있었을 수 있다.

2.2.3. 현재 나와있는 진단키트

이 항목에서, 각 진단키트의 신뢰성에 대한 정량적인 비교분석은 현실적으로 어렵다. 각 진단키트마다 민감도와 특이도, CT값 등의 지표를 제공하고 있긴 하지만, 그걸 토대로 각 키트들을 비교하기엔 서로 측정을 진행한 환경이 다르기 때문이다. 한 예로, 2020년 9월에 FDA에서 COVID-19 진단키트들에 대하여 검출한계를 지표로 순위를 매긴 바 있는데, 그 때 FDA에서 제공한 검출한계의 값과 기존에 진단키트 제조회사에서 제공했던 검출한계의 값에는 차이가 있는 경우가 많았다. 이는 서로 다른 환경조건에서 기인한 것이라 생각한다. 하여튼 그러한 이유로, 이 총설에서는 유명한 COVID-19 진단키트 몇 가지를 소개하고, 몇 개의 진단키트를 비교분석한 논문들을 간단히 종합하여 설명하는 것으로 마무리하고자 한다.

우선, PerkinElmer New Coronavirus Nucleic acid detection kit가 있다. 제조회사에서 제공하는 정보에 따르면 (https://perkinelmer-appliedgenomics.com), 이 키트의 경우 타겟으로 하는 유전자는 SARS-CoV-2의 ORF1ab, N gene이었으며 검출한계인 LoD(Limit of Detection)는 7.14 - 27.24 copies/ml였다. 특히, 이 키트는 앞서 언급했던 FDA에서 발표한 바에 따르면 조사대상인 키트 중 가장 검출한계가 좋았던 키트였다. 하지만 FDA 조사에 응하지 않은 키트들은 순위에 포함되지 않았으니 그것도 고려해야 할 것이다.

Biocore 2019-nCoV Real Time PCR Kit는 U-TOP COVID-19 Detection Kit와 더불어, 앞서 말한 FDA의 발표에서 한국의 진단키트 중 가장 높은 순위(3위)를 기록했던 키트이다. 제조회사인 Biocore에서 제공하는 정보에 따르면 (http://www.bio-core.com), 이 진단키트에서 타겟으로 하는 것은 RdRp gene과 N gene이었다.

QIAstat-Dx Respiratory SARS-CoV-2 Panel은 SARS-CoV-2 진단에 있어 처음으로 나온, 약 한 시간 만에 결과를 도출하는 신속한 multiplex PCR 검사이다. Visseaux et al.은 이 진단키트에 대하여 여러 평가를 진행했는데, WHO에서 권고하는 검사법과 상응할 만한 결과를 냈으며 전반적으로 민감도가 좋고 정확하다는 결론을 내릴 수 있었다 [15].

여러 개의 진단키트들을 비교한 논문들도 꽤 있었다 [1,4,5,10,16,20]. 그 중 Wijsman et al의 논문은 여러 나라의 진단키트 7개를 한 번에 비교했는데, 타겟 유전자로는 ORF1ab/RdRp gene, E gene, N gene, S gene 내에서 각 키트마다 1 -3개 정도가 쓰였다. 비교 결과 이들 모두 95% 이상의 높은 PCR efficiency를 보였으며 95% 신뢰수준에서의 검출한계를 보았을 때는 Altona Diagnostics의 RdRp 유전자를 타겟으로 하는 게 3.8 copies/mL로 가장 낮았다. 가장 높은 LoD를 보였던 것은 PrimerDesign kit의 RdRp가 23 copies/mL로 가장 높았다. 동일한 키트 내에서도 타겟 유전자에 따라 값이 다르기도 했는데, SeeGene의 경우 E gene이 4.8 copies/mL, RdRp가 18 copies/mL였다. 여기까지 살피면 RdRp가 별로 좋지 않은 타겟처럼 보이기도 하는데, KH Medical에서는 RdRp를 타겟으로 하는 것이 4.8 copies/mL의 값을 나타낸 것으로 보아, 역시 각각의 sequence마다 다른 것으로 생각된다. 하여튼, 이 연구에서 포함되었던 모든 키트들이 진단에 적합한 민감도는 가지고 있었다 [16].

또 다른 연구에서는 ORF1ab와 N gene 두 개를 동시에 타겟으로 하는 두 진단키트를 비교했는데, Sansure PCR kit와 BioGerm PCR kit가 그것들이었다. 이 연구에서는 COVID-19에 감염된 환자 18명과 COVID-19에 감염되지 않은 환자 100명의 샘플을 이용하여 둘의 비교를 진행하였는데, 둘의 특이도는 같았지만 (둘 다 거짓 양성은 없었음), 그 외 민감도나 negative predictive value (NPV), kappa value 등의 수치를 비교하였을 때, 결과적으로 BioGerm PCR kit가 Sansure PCR kit보다 진단 효율이 좋다고 할 수 있었다. 하지만 이는 적은 수의 샘플을 이용한 연구였기에 이 결과만으로 확언할 수는 없기도 하다 [20].

여러 진단키트들을 비교한 논문에서, Powerchek 2019-nCoV Real-time PCR kit는 비교 집단에 종종 포함되었는데 [18,19,21], 이 키트는 대한민국에서 가장 먼저 COVID-19 진단을 위해 긴급승인이 되었던 키트이기도 하다. 그럼에도 진단에 유용하게 쓰일 수 있을 정도의 신뢰성을 보이는 한편 [18,19,21], 다만 MERS coronavirus와의 cross reaction도 존재한다. 하지만 이는 문제가 되지 않는 게, 현재 한국 내에서 MERS는 널리 발발하고 있지 않은 질병이기 때문이다 [18].

한편, 무려 13개의 상업적인 RT-PCR 진단 키트를 비교한 논문도 있었다 [19]. 이 논문에서 다루었던 모든 진단키트들은 단 하나가 80%를 나타낸 것을 제외하면 모두 90% 이상의 우수한 PCR efficiency를 보였다. 여기서는 앞서 언급했던 Corman et al.의 E gene, RdRp gene을 타겟으로 하는 primer sets를 참고용으로 사용했는데, 이와 비교하여 각 키트의 유전자별 민감도를 측정했다. 그 결과, 많은 검사들이 Corman at al.에서 가장 민감도가 높다고 알려진 E gene을 이용한 검사에 준하는 민감도를 보였으며, 동일 키트 내에서 적어도 하나의 타겟은 좋은 민감도를 보였다 [19].

타겟 유전자의 빈도를 살피자면, 바로 앞에서 다뤘던 논문의 비교 집단인 13개의 진단키트 중에서 N gene을 타겟 유전자에 포함시켰던 키트는 무려 11개에 해당했으며, ORF1ab, E gene의 경우는 각각 9개에 해당했다. 그 외에 RdRp gene도 5개의 키트가 타겟 유전자에 포함하고 있었으며, S gene의 경우는 단 2개로 다른 유전자들에 비하면 타겟으로 활용되는 빈도가 낮았다 [19]. 이러한 추세는 다른 상업적인 진단키트에서도 비슷했다. S gene에 비해 RdRp, N, E gene을 타겟으로 하는 경우가 더 많았다 [18,19,21]. 결론적으로, ORF1ab/RdRp, E, N, S gene이 타겟으로 쓰인다.

COVID-19이 워낙 급속히 발발하여 널리 퍼져, 제조회사들은 단기간에 진단키트를 개발하여 허가를 얻었어야 했기 때문에 모든 키트들이 완벽할 수 있다고는 생각하지 않는다. 하지만 결론적으로, 여러 논문에서 대부분의 키트가 진단에 적합한 민감도와 특이도를 가지고 있었고, PCR efficiency도 우수했다. 진단 키트에서의 정확도는 primer에 따라 달라질 것으로 생각되는데, 만약 이 primer가 타겟으로 하고 있는 SARS-CoV-2의 sequence에 돌연변이가 일어난다면 진단의 정확도에 심각한 영향을 줄 수 있을 것이다. 하지만 앞서 언급했듯이, 다행히도 보통 진단에 사용되는 상업적인 키트들은 두 개 이상의 유전자를 동시에 타겟으로 하므로, 설령 한쪽에 치명적인 돌연변이가 일어난다 하더라도 다른 primer assay가 참고될 수 있을 것이다. 실제로, 이 총설의 참고논문에서 다루었던 상업적인 키트들도 거의 두 개 이상의 유전자를 타겟으로 했다. 예를 들어, Iglói et al.의 연구에서는 단 한개의 경우만 제외하고 비교에 사용한 각각의 키트들은 모두 하나 이상의 유전자들을 타겟으로 했다. 그리고 그 한 개의 타겟만 사용하는 키트는 진단에 사용되는 것이 아니라, 오직 연구 목적으로만 사용할 수 있는 키트였다 [19].

COVID-19은 최초 발발 이후 지금까지도 우리의 삶에 지대한 영향을 끼치고 있다. 이러한 상황은 온전한 백신이 개발되어 승인을 받기 이전까지 지속될 것으로 보이는데, 그렇다면 정확하고 신속한 COVID-19 진단은 더더욱 중요해질 수밖에 없다.

이 총설에서는, COVID-19의 핵산 기반 진단법에 대하여 primer에 중점을 두어 알아보았다. RT-PCR의 민감도와 특이도에 영향을 주는 요인 중 가장 주요한 것이 바로 primer인데, 이것이 target으로 하는 부분에 얼마나 잘 달라붙는지가 진단의 신뢰성에 많은 영향을 끼친다. 그러한 primer의 타겟으로 쓰이는 유전자에는 ORF1ab/RdRp gene, N gene, E gene, S gene 등이 있었으며 이들을 타겟으로 하는 primer는 대부분의 논문에서 잘 작용하고 있었다. 다만, 각각의 primer마다 같은 유전자를 타겟으로 하더라도 그 유전자 내의 어떤 구역을 타겟으로 하는지가 다르기에 저마다 민감도와 특이도 등의 지표에서 차이를 보였다. 또한, 각각의 연구마다 준비했던 sample들과 RNA extraction에 사용한 tool 등 기타 환경적인 요인들도 그 차이에 일조한 바가 있었을 수 있다.

물론, 이러한 primer들은 완벽하지 않을 수 있다. COVID-19이 워낙 급속히 발발하여 개발기간이 짧기도 했고, 제조사에서 완벽한 primer를 만들어낸다 하더라도 SARS-CoV-2는 단일 가닥의 RNA 바이러스이기에 돌연변이가 더욱 빈번하게 일어날 수 있다. 그리하여, 실제 진단에 사용되는 상업적인 진단키트들은 하나의 구역만을 타겟으로 하지 않으며 한 번에 두 개 이상의 유전자 혹은 구역을 타겟으로 한다. 즉, 한 키트 구성물 내에 두 종류 이상의 primer가 포함되는 것이다.

실제 상업적인 키트들의 primer 구성과 신뢰도를 알아본 결과, 대부분이 진단에 필요한 민감도를 확보하고 있었으며 PCR efficiency도 좋았다. Primer 구성은 앞서 언급했던 ORF1ab/RdRp, E, N, S gene을 타겟으로 하는데, S gene은 나머지 다른 타겟 유전자들에 비해 덜 사용되는 경향을 보였다. 나머지는 우열을 가리기 어려울 정도로 모두 자주 사용되었고, 각자 키트에 따라, 즉 primer 서열에 따라 민감도가 상이했기에 타겟 유전자 간의 민감도 비교는 어려워 보인다.

결론적으로, 대부분이 잘 작용했고 진단에 쓰일 수 있을 정도의 신뢰도는 가졌으나, SARS-CoV-2가 RNA 바이러스이고 변이가 나타날 수 있는 확률이 있는 만큼 지속적인 관찰과 개선은 필요할 것이다.