본 연구에서는 acid α-glucosidase (GAA)를 생산하는 형질전환 벼 세포를 사용하였으며, 당쇄를 제어하지 않은 벼 세포주 (Oryza sativa L. cv. Donjin, GAA^WT)와 gnt1 유전자를 제거하여 당쇄를 제어하면서 mannose 함량을 증대시킨 변이주 벼 세포주 (Oryza sativa L. cv. Nipponbare, GAA^gnt1)를 사용하였다. GAA 당단백질의 당쇄에 mannose가 많아지면 치료제로 사용할 경우 receptor와의 부착이 효율적이어서 uptake가 증대된다. 두 세포주 모두 RAmy3D 프로모터를 포함하며 당이 고갈된 환경에서 단백질을 발현하였다.

형질전환 벼 세포의 현탁배양을 위한 생장 배지로 N6 배지를 사용하였으며, 탄소원으로 30 g/L sucrose를 첨가하였다. 또 생장 조절제로 2.0 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)와 0.2 mg/L kinetin을 첨가하였고, pH는 5.8로 조절하였다. 배지는 500 mL Erlenmeyer flask에 분주 후 고압증기 멸균 후 사용하였고, 배양 조건은 암조건 하에 120 rpm, 28^oC로 설정하였다. 단백질 생산을 유도하기 위해서는 100 mL Erlenmeyer flask에서 sucrose를 제외한 N6 배지를 사용하였고, 그 외 다른 조건은 동일하게 수행하였다.

세포량을 확인하기 위해서 세포의 건체량(dry cell weight, DCW)을 측정하였다. 배양한 현탁세포를 Buchner funnel에서 Whatman No.1 여과지를 사용하여 감압을 하면서 배지와 분리하였다. 분리된 세포는 증류수로 세척하고 수분을 제거한 후 60^oC로 설정된 건조기에서 48시간 건조하고 DCW를 측정하였다.

세포 생존도는 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 환원법으로 측정하였다. FCW 0.1 g의 세포를 회수하여 eppendorf 튜브에 담아 1.5% TTC 용액 (0.05 M potassium phosphate 용액, pH 9.0) 1.6 mL을 넣어서 20^oC에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TTC 용액을 제거하고 95% 에탄올 1 mL을 첨가하여 60^oC에서 30분 동안 반응시켜 세포 내 red formazan을 추출하였다. 15,000 rpm으로 30분간 원심분리한 후, 상등액만을 회수하여 spectrophotometer를 이용하여 485 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Blank로는 95% 에탄올을 사용하였다.

Acid a-glucosidase (GAA)의 정성 분석을 위해서는 SDS-PAGE를 이용하였다. 회수한 배양액을 8% acrylamide gel로 전기 영동하여 단백질 band를 확인하였고, marker로는 Seeblue Plus2 pre-stained standard (Invitrogen, USA)를 사용하였다.

단백질 정량분석을 위해서는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하였다. Indirect ELISA를 수행하기 위하여 capture antibody로 mouse polyclonal GAA antibody를 사용하였고, detection antibody로는 peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG를 사용하였다. 기질로는 ultra-TMB peroxidase substrate (Thermo)를 이용하였으며, stop solution으로는 2 M sulfuric acid를 사용하였다. 흡광도는 450 nm에서 측정하였으며 표준물질로는 Myozyme을 사용하였다.

탄소원의 정량 분석을 위해서는 high-performance liquid chromatography (HPLC) 방법을 사용하였다. YL9100S HPLC System (Young In Chromass, Korea)을 사용하였으며, Zorbox carbohydrate column (Agilent, USA)을 통하여 분석하였다. 분석은 75% acetonitrile을 이동상으로 하여 0.8 mL/min의 속도로 25^oC 조건에서 수행하였다.

탄소원은 in vitro 배양에서 세포 생장에 영향을 미치는 에너지원 중 하나이며, 당과 관련된 유전자를 발현하거나 유전자 발현을 억제하는데 영향을 주기 때문에 중요한 인자이다. 일반적으로 식물체는 autotroph이기 때문에 별도로 탄소원을 첨가해주지 않아도 스스로 생장을 할 수 있다. 하지만 식물체와 달리 배양 중인 식물세포는 heterotroph와 유사하기 때문에 필수적인 영양분을 외부에서 보충해주어야 하며, 그 중 탄소원은 에너지를 생성하는데 중요한 요소이다 [16].

형질전환 벼 세포배양에서 RAmy3D 프로모터를 통해 단백질을 생산하고자 할 때는 당이 존재할 경우 발현을 억제하게 되므로 생산에 부정적인 영향을 최소화 할 수 있는 탄소원을 선정하고자 하였다. 단백질 발현에 부정적인 영향을 주지 않아야 하는 생산 단계 조건을 기준으로 sucrose, fructose, mannitol, sorbitol을 첨가하여 비교 실험을 수행하였다. 각각 80 mM 농도로 첨가하였으며, 탄소원의 소비 경향과 세포의 생존도, 단백질 발현 등을 확인하여 비교하였다. 각각의 탄소원을 80 mM 농도로 첨가하여 세포를 배양한 후, 3일마다 소비 경향을 확인하였다. 그 결과 sucrose와 fructose는 처음 3일까지 급격하게 소모되었으며, 6일차에 완전히 소모되는 것을 확인하였다. Mannitol의 경우에는 두 세포주 모두에서 소비되지 않았고, 오히려 증가하는 결과를 나타냈다. Sorbitol은 sucrose와 fructose 보다 천천히 사용되었고, wild-type 세포주 (GAA^WT)의 경우 21일차에 완전히 소모되었다. 반면에 당쇄 변이 세포주 (GAA^gnt1)에서는 GAA^WT 세포주와 다르게 15일만에 모두 소비되었으며, 세포주에 따라 다른 양상을 보였다 (Fig. 1). 이를 좀 더 구체적으로 확인하기 위해서 sorbitol을 40, 80, 120 mM로 다르게 처리하여 소비 경향을 확인한 결과 앞에서와 마찬가지로 GAA^WT 세포주에서 느리게 사용되었으며, 세포주와 상관없이 농도가 높을수록 천천히 감소하였다. 또한 그래프의 기울기를 보아 같은 속도로 sorbitol을 소비함을 알 수 있었다 (Fig. 2).

Figure 1. Sugar uptake profiles with various carbon sources in cell cultures using GAA^WT (wild-type cell line, A) and GAA^gnt1 (glycoengineered cell line, B): ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Figure 2. Time course profiles of sorbitol uptake in cell cultures using GAA^WT (A) and GAA^gnt1 (B): ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

형질전환 벼 세포 배양에서 각각의 탄소원을 80 mM로 첨가하였을 경우 세포 생존도에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 3일부터 27일차까지 3일 간격으로 당이 없는 조건을 기준으로 비교하였다. 세포 건체량 (dry cell weight)은 GAA^WT와 GAA^gnt1 세포주 모두에서 sucrose를 첨가한 조건에서 가장 크게 증가하였으며, 그 후 급격하게 감소하였다. Fructose 첨가시 sucrose를 첨가한 조건보다는 낮았지만 역시 급격하게 증가 후 감소하는 경향을 보였다. Mannitol의 경우 당이 없는 조건보다 약간 높은 세포량을 보였지만 대체적으로 비슷하였다. Sorbitol의 경우 천천히 소비되면서 세포량이 눈에 띄게 증가하지는 않았고 생존도를 유지할 수 있는 탄소원으로 사용할 수 있음을 확인하였다 (Fig. 3).

Figure 3. Effects of various carbon sources on cell mass in cell cultures with GAA^WT (A) and GAA^gnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Sorbitol을 40, 80, 120 mM 농도로 첨가한 결과 40 mM에서는 세포량이 바로 감소하기 시작하였지만 당이 없는 조건에 비하여 천천히 감소하였다. 반면 80, 120 mM에서는 세포량이 약간 증가하였다가 서서히 감소하는 경향을 보였다. GAA^WT와 GAA^gnt1 세포주 모두 유사한 양상을 보였지만, GAA^WT에서 더 천천히 감소하였다 (Fig. 4). Fig. 5에서 볼 수 있는 것과 같이 세포 생존도는 sucrose와 fructose를 첨가한 조건에서 급격하게 증가하였다가 빠르게 감소하였다. 반면에 mannitol의 경우 당이 없는 조건과 유사하였다. Sorbitol의 경우 오랫동안 생존도가 유지되었으며, 40 mM에서는 당이 없는 조건보다는 높은 생존도를 보였다. 80, 120 mM에서는 생존도가 증가하였다가 감소하는 경향을 보였으며, 농도가 높을수록 더 좋은 생존도를 보였다. 두 세포주를 비교하였을 경우, GAA^WT에서 생존도가 더 오래 유지 되었고, sorbitol이 천천히 사용됨에 따라 생존도 역시 길게 유지되는 것으로 생각된다 (Fig. 6).

Figure 4. Effects of sorbitol concentration on cell mass in cell cultures with GAA^WT (A) and GAA^gnt1 (B):◇, sugar-free condition; ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

Figure 5. Effects of various carbons sources on relative cell viability in cell cultures with GAA^WT (A) and GAA^gnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Figure 6. Effects of sorbitol concentration on relative cell viability in cell cultures with GAA^WT (A) and GAA^gnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

서로 다른 탄소원의 첨가가 단백질 발현에 미치는 영향을 SDS-PAGE로 확인하였고 그 결과는 Fig. 7에 제시하였다. GAA^WT 세포주에서는 3일차에 당이 없는 조건에서 희미하게 GAA가 발현되었지만 나머지 조건에서는 잘 나타나지 않았다. 15일차에는 80, 120 mM의 sorbitol을 처리한 조건에서만 GAA 밴드가 보이지 않았으며 나머지 조건에서는 비슷한 결과를 보였다. 27일차에는 모든 조건에서 GAA가 발현되지만 상대적으로 80, 120 mM의 sorbitol을 처리한 경우 희미하게 관찰되었다. GAA^gnt1 세포주에서는 3일차에 모든 조건에서 GAA가 발현되었으며, sucrose와 fructose를 첨가한 조건에서는 다른 조건에 비하여 낮은 발현을 보였다. 15일차에서 sorbitol 80, 120 mM에서 발현 정도가 가장 낮았다. 27일차에 sorbitol을 80, 120 mM를 처리한 경우 다른 조건보다 높은 발현 결과를 보였다 (Fig. 8). 하지만 이 경우 단백질 발현에는 더 긴 시간이 걸렸다. Sorbitol 40 mM 처리시 세포량의 증가가 거의 없었음에도 불구하고 sucrose나 fructose를 첨가하여 세포량이 증가한 조건과 비슷한 단백질 발현을 보였다. 이는 세포당 단백질 발현량은 증가하였음을 의미한다. GAA^WT 세포주에서는 sorbitol의 첨가가 세포의 생존도에는 긍정적인 영향을 미쳤으나 단백질 발현에는 뚜렷한 효과를 보이지 않았다. 반면에 GAA^gnt1 세포주에서 sorbitol은 생존도뿐만 아니라 단백질 발현에도 긍정적인 영향을 미쳤다. 이를 통하여 두 세포주 간의 차이를 확인하였으며, GAA^gnt1에서 sorbitol의 대체 탄소원으로서의 사용 가능성을 알 수 있었다.

Figure 7. SDS-PAGE analysis of GAA produced in cell cultures with GAA^WT at day 3 (A) day 15 (B), and day 27 (C): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, control; 3, 80 mM sucrose; 4, 80 mM fructose; 5, 80 mM mannitol; 6, 40 mM sorbitol; 7, 80 mM sorbitol, 8, 120 mM sorbitol.

Figure 8. SDS-PAGE analysis of GAA produced in cell cultures with GAA^gnt1 at day 3 (A) day 15 (B), and day 27 (C): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, control; 3, 80 mM sucrose; 4, 80mM fructose; 5, 80 mM mannitol; 6, 40 mM sorbitol; 7, 80 mM sorbitol; 8, 120 mM sorbitol.

당알코올은 일반적으로 식물세포배양에서 대사되지 않는 물질로 알려져 왔고, 그렇기 때문에 배양 중 탄소원으로 사용되기 보다는 삼투압 조절제로 많이 사용되었다. 하지만 일부 식물조직에서 mannitol을 사용하는 것이 발견되었고 [17], 당근세포나 담배세포의 현탁배양 중 mannitol이 천천히 대사됨도 확인된 바 있다 [18]. Sorbitol의 경우에는 다양한 종에서 흡수되어 대사가 이루어지는데, 일부 종에서는 sucrose 보다 더 좋은 생장을 보였다고 보고되었다 [13].

Sorbitol의 첨가로 세포 생존도 및 단백질 발현량을 증가시킬 수 있었지만 당을 첨가하지 않은 조건보다는 배양기간이 길어지는 결과를 보였다. 따라서 이를 보완하기 위하여 hexokinase 저해제로 N-acetyl glucosamine을 첨가하여 상승효과를 조사하고자 하였다.

일반적으로 hexokinase가 당을 인지하게 되면 당 고갈 신호가 전달되지 않으며, α-amylase를 발현하지 않는다. 반면에 당이 고갈된 조건에서는 hexokinase가 당을 인지하지 못하게 되며, calcineurin B-like protein (CBL) 과 Ca²⁺이 복합체를 형성하게 되고, 당이나 산소의 부족으로 발현되는 CIPK15로 신호를 전달하게 된다 [19]. CIPK15가 발현되면 다시 SnRK1A로 신호가 전달되며, sugar starvation inducible transcrip-tion factor 인 MYBS1를 활성화 시키고, 활성화된 MYBS1와 α-amylase mRNA의 상호작용으로 인하여 RAmy3D 프로모터를 통해 α-amylase와 코딩된 목적단백질을 발현하게 된다 [20].

Sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 동시에 첨가하면 대체 탄소원으로 sorbitol의 첨가는 세포의 생존도를 더 오랫동안 유지시켜 주고, 단백질의 발현이 늦어지는 문제는 N-acetyl glucosamine을 처리하여 해결할 수 있으므로 이들의 조합을 통해 최적인 조건을 찾고자 하였다. 조합실험은 sorbitol 40 mM과 N-acetyl glucosamine 5 mM를 기준으로 하여 Table 1에 정리된 조건으로 수행하였다.

Table 1 . Central composition design for combination of sorbitol and N-acetyl glucosamine

Run#	Pattern	Sorbitol	Hexokinase inhibitor
1	+-	40	0
2	00(CP)	20	2.5
3	0-	20	0
4	++	40	5
5	-+	0	5
6	0+	20	5
7	--	0	0
8	00(CP)	20	2.5
9	-0	0	2.5
10	00(CP)	20	2.5
11	+0	40	2.5

먼저 N-acetyl glucosamine이 sorbitol을 소비하는데 미치는 영향을 확인하였다. 20mM sorbitol과 함께 N-acetyl glucosamine을 첨가하면 소비가 느려지기는 하지만 큰 영향은 없었으며 40 mM의 sorbitol 첨가시 N-acetyl glucosamine이 sorbitol 소비에 큰 영향을 주지는 않았다. 따라서 N-acetyl glucosamine이 sorbitol 소비에는 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다 (Fig. 9). Sorbitol과 N-acetyl glucosamine의 단일 첨가 및 동시 첨가가 미치는 영향을 확인한 결과 Fig. 10에 제시된 결과와 같이 N-acetyl glucosamine만을 처리하면 세포량과 생존도에 모두 부정적이었다. Sorbitol을 20 mM 첨가하면 세포량은 거의 일정했으며, 생존도는 더 오랫동안 유지되었다. N-acetyl glucosamine을 같이 첨가하였을 경우, 세포량과 생존도 모두 감소하였다. Sorbitol 40 mM에서는 20 mM과 비슷한 경향을 보였다. Sorbitol만 첨가하였을 경우 세포량이 약간 증가하지만 전체적으로 큰 변화 없이 일정하였고, 생존도는 높게 유지되었다.

Figure 9. Effects of N-acetyl glucosamine on sorbitol uptake with 20 mM sorbitol (A) and 40 mM sorbitol (B): ◇, 20 mM sorbitol; △, 20 mM sorbitol with 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ◆, 20 mM sorbitol with 5 mM N-acetyl glucosamine ; ▽, 40 mM sorbitol; ○, 40 mM sorbitol with 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ●, 40 mM sorbitol with 5 mM N-acetyl glucosamine.

Figure 10. Effects of N-acetyl glucosamine on dry cell weight (A) and relative cell viability (B); ◆, without sorbitol; ○, 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ●, 5 mM N-acetyl glucosamine.

Sorbitol과 hexokinase 저해제의 동시 첨가가 단백질 발현에 미치는 영향은 SDS-PAGE와 ELISA를 통하여 정성 및 정량 분석하여 보았다. SDS-PAGE는 3일부터 12일차까지 3일 간격으로 수행하였다. 3일차에서는 아무것도 첨가하지 않은 조건에서 가장 높은 단백질 발현을 보였다. N-acetyl glucosamine을 처리하였을 경우 단백질 발현은 낮아졌다. 반면 sorbitol을 20 mM 첨가하면 약간의 발현을 보였으며, N-acetyl glucosamine을 같이 처리하면 더 발현 정도가 높아짐을 확인할 수 있었다. Sorbitol 40 mM에서는 발현이 거의 관찰되지 않았다 (Fig. 11(A)). 6일차에 아무것도 첨가하지 않은 경우 3일차와 비슷한 경향을 보였으며, sorbitol 20 mM에서도 3일차와 비슷한 경향을 보였다. Sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 동시에 첨가하였을 경우, N-acetyl glucosamine의 농도가 높을 때 좀 더 많은 단백질을 확인할 수 있었다. Sorbitol 40mM에서는 역시 sorbitol을 단독으로 처리하는 경우보다 N-acetyl glucosamine을 같이 처리하였을 때 더 좋은 결과를 보였다 (Fig. 11(B)). 9일과 12일차에서는 모든 조건이 비슷한 경향을 보였으며, 9일차부터는 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 같이 처리할 때 단백질 발현이 높았다 (Fig. 11(C), Fig. 11(D)).

Figure 11. SDS-PAGE of GAA produced with various concentrations of sorbitol and N-acetyl glucosamine at day 3 (A) and day 6 (B), day 9 (C), and day 12 (D): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, W/O sorbitol; 3, 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 4, 5 mM N-acetyl glucosamine; 5, 20 mM sorbitol; 6~8, 20 mM sorbitol and 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 9, 20 mM sorbitol and 5 mM N-acetyl glucosamine, 10, 40 mM sorbitol; 11, 40 mM sorbitol and 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 12, 40 mM sorbitol and 5 mM N-acetyl glucosamine.

좀 더 정확한 단백질 발현 확인을 위해서 ELISA를 사용하여 비교한 결과 SDS-PAGE에서와 유사하게 9일 이후에 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 같이 첨가한 조건에서 높은 단백질 발현을 나타내었다. 9일차에 sorbitol 20 mM과 N-acetyl glucosamine 5 mM을 동시 첨가한 경우 가장 단백질 발현이 높았으며 12일차를 기준으로 sorbitol 40 mM에 N-acetyl glucosamine 5 mM을 동시 첨가한 경우 가장 좋은 효과를 보였다 (Fig. 12). 따라서 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 함께 첨가하면 단백질 발현에는 긍정적인 효과를 보임을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 최적 조합의 sorbitol과 N-acetyl glucosamine 동시 첨가를 통하여 60% 향상된 GAA 단백질을 얻을 수 있었다.

Figure 12. Effects of combined supplementation of sorbitol and N-acetyl glucosamine on GAA production at day 3, 6, 9, and 12.