암은 세계 모든 나라에서 사망의 주요 원인이며, 그 중 대장 암은 발병률과 사망률 모두 높은 암으로 성별에 상관없이 10% 이상의 발병률을 나타내고 있다 [1,2]. 이러한 대장암 치 료의 경우 대개 항암화학요법 또는 방사선치료를 병행하지 만 부작용이 수반되므로 항암화학요법과 방사선치료의 부 작용을 줄일 수 있는 인체에 무해한 천연물의 효능을 이용한 항암치료와 관련된 선행연구가 진행되고 있다 [3,4]. 영릉향 (Lysimachiae foenum-graeci Herba)은 전통적인 한약재로 영 향풀 (Lysimachia foenum-graecum Hance)의 전초를 그늘에 말린 것이며, 항산화, 항비만 및 항균 효과를 가지고 있는 것 으로 알려져 있다. 선행연구를 바탕으로 영릉향의 항암 효 과에 대해 기대할 수 있으나, 영릉향에 의한 대장암세포에 서의 항암 효과는 확인된 바가 없으므로 본 연구에서는 영 릉향 헥산 분액물 (LFH)을 통해 항암효과를 확인하고자 한 다 [5-7]. 대표적인 항암기전으로 알려진 apoptosis (세포사 멸)는 Programmed Cell Death으로 DNA 손상, 바이러스 감염 등 손상된 세포들의 제거를 위한 방어 기전이며, 암으로 진 행될 수 있으므로 매우 중요하다 [8]. Apoptosis에 관여하는 protein들 중 Bcl-2 family proteins은 anti-apoptotic proteins와 pro-apoptotic proteins으로 구성되어있어 apoptosis를 촉진하 거나 억제한다 [9,10]. 또한 Akt (serine/threonine kinase)는 세 포 증식 및 생존과 같은 다양한 세포 과정에서 주요 역할을 하며, Akt에 의해 인산화되는 Mdm2 (Murine Double Minute 2) 는 암 억제 유전자인 p53의 ubiquitination을 유도해 apoptosis 를 억제하게 된다 [11-13]. 따라서 본 연구는 LFH를 처리한 HCT116 대장암세포에서 나타난 세포 독성 및 세포증식억제 효과가 apoptosis에 의한 것인지 확인하고자 하였으며, LFH 에 의한 HCT116 대장암세포의 apoptosis 유도가 Akt/Mdm2 pathway를 통해 일어나는지 확인하고자 하였다.

2.1. 실험 재료

본 실험에 사용된 영릉향은 대전 한약재시장에서 구입하였으며, Um 등 [5]와 Lee 등 [6]의 시험법을 참고하여 영릉향 100 g에 94.5% 에탄올 800 mL를 가하여 72시간 동안 교반기를 이용해 상온에서 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 영릉향을 감압농축기를 이용하여 감압 농축 과정을 거친 후, n-hexane 1000 mL를 가하여 분액하였다. 이를 감압농축기를 이용하여 감압 농축 시킨 뒤 농축된 추출물은 −86°C에서 보관하였다. 농도별 LFH (30~150 μg/ml)을 동일 용량의 DMSO (Dimethyl Sulfoxide)에 녹인 뒤 5분 동안 sonication하여 만들었으며, −4°C에서 냉동 보관하여 사용하였다. LY294002(20 mM)는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 Nutlin-3(20 mM)는 Sigma-Aldrich (MilliporeSigma, USA)에서 구입하였으며, DMSO (Dimethyl Sulfoxide)로 희석시켜 사용하였다.

2.2. Cell culture

HCT116 대장암세포은 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea)에서 분양 받았으며, 10% FBS (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics가 포함된 RPMI media (HyClone Laboratories Inc.)를 사용하여 5% CO₂, 37°C 조건에서 배양하였다. 2일마다 trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 1 × 10⁶ cells/mL로 분주하고 계대배양 하였다. Fibroblast cell은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% FBS와 1% antibiotics가 포함된 DMEM media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA)를 사용하여 5% CO₂, 37°C 조건하에서 배양하였다. 2일마다 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 1 × 106 cells/mL로 분주하고 계대배양 하였다.

2.3. MTT assay

세포 배양용 12 well plate에 HCT116 대장암세포를 2 × 10⁵ cells/mL로 분주하고 24시간 배양하였으며, 동시에 Fibroblast 섬유아세포를 2 × 10⁵ cells/mL로 분주하고 24시간 동안 배양시킨 후 LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 처리하였다. LY294002와 Nutlin-3 처리시에는 LY294002와 Nutlin-3을 먼저 처리한 후 LFH를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. MTT solution을 40 μL씩 첨가하여 1시간 동안 5% CO₂, 37°C 조건에서 배양하였으며, MTT solution이 들어있는 배지를 제거하였다. 이후 DMSO 150 μL를 넣어 각 well에 생성된 formazan을 모두 녹여 96 well plate에 100 μL씩 분주하였으며, FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용해 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.4. Annexin V & Dead Cell assay

Apoptosis를 정량적으로 분석하기 위해 Muse^TM Annexin V & Dead Cell Kit (MCH100105, Merck Millipore Co., Billerica,MA, USA)을 사용하였다. HCT116 대장암세포에 LFH를 농도별(30, 90, 150 μg/ml)로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 RPMI media 100 μL를 이용하여 1 × 10⁵ cells/mL로 부유시키고, MuseTM Annexin V & Dead Cell Reagent 100 μL를 혼합하여 5% CO₂, 37°C 조건에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 Cell Analyzer (PB4455ENEU, Muse^TM Cell Analyzer, Merck Millipore Co.)를 이용하여 분석하였다.

2.5. Hoechst 33342 assay

Polypropylene 96 well flat-bottom microplate (Greiner Bio-One GmbH, Austria)에 HCT116 대장암세포를 3×10⁵ cells/mL 분주하여 24시간 배양 후, LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 95% 에탄올과 5% acetic acid를 혼합하여 각 well 당 150 μL를 처리한 뒤, 상온에서 10분 동안 고정시켰다. 이후 Hoechst 33342 staining solution(Sigma-Aldrich, USA)을 well당 50 μg/ml의 농도로 처리하여 1시간 동안 5% CO₂, 37°C 조건에서 배양하였으며, FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany)를 이용해 355 nm 및 460 nm에서 fluorescence를 측정하였다.

2.6. Western blotting에 의한 단백질 발현의 분석

6 well plate에 HCT116 대장암세포를 well당 5 × 10⁵ cells/mL 로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 처리하였다. LY294002 (20 μM)와 Nutlin-3 (20 μM)와 병행처리시에는 inhibitor를 먼저 처리하였으며, 모든 물질을 최종 처리한 후 24시간 동안 5% CO₂, 37°C 조건에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 RIPA lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1% NP40, 0.5% sodiumdeoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 각 well에 150 μL씩 첨가하여 단백질을 분리한 후 14,000 rpm, 4°C에서 20분동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 추출한 단백질은 FLUOstar Omega(BMG labtech, Germany)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 그 다음, 8%, 12% acrylamide gel을 이용하여 전기 영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 2% Bovine serum albumin (BSA)을 이용해 blocking하고, 1차 항체를 4°C에서 overnight 처리한 후 2차 항체를 결합시켜 2시간 동안 반응시켰다. 이후, enhanced chemiluminescence (ECL) solution (Termo, USA)을 사용해 UVITEC Gel-imaging System (Philekorea, Korea)과 X-ray film을 이용해 관찰하였다.

2.7. 통계처리

통계 프로그램인 SPSS (Statistical Package for the Social Science) 22.0 프로그램을 사용하였고 실험 설계에 대한 분산 분석은 t-test를 실시하여 유의성을 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검정하였고 p < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

3.1. LFH가 HCT116 대장암세포에 미치는 세포증식억제효과 확인

LFH가 HCT116 대장암세포에 미치는 세포 증식률 변화를 확인하기 위해 MTT assay를 통해 세포 독성과 세포증식억제 효과를 각각 확인하였다. Park 등 [14]과 Abedian 등 [15]을 참고하여 인간 정상세포로 사용되는 Fibroblast 섬유아세포를 암세포인 HCT116 대장암세포의 대조군으로 설정하여 실험을 진행하였다. 정상 세포인 Fibroblast 섬유아세포에 LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 24, 48, 72시간 동안 처리하였을 때 섬유아세포의 세포 증식률이 모든 농도에서 90% 이상으로 유지되는 것으로 보아 LFH의 독성이 없음을 확인하였다 (Fig. 1(a)). 또한 HCT116 대장암세포에 LFH를 동일한 농도로 처리한 후 24, 48, 72시간 동안 반응시켰을 때, 농도 및 시간 의존적으로 세포 증식이 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 1(b)). 따라서 LFH는 정상 세포인 Fibroblast 섬유아세포에서는 세포 독성이 나타나지 않았으며, HCT116 대장암세포의 세포증식억제에 효과적인 것으로 확인하였다.

Figure 1. The effect of Lysimachiae foenum-graeci Herba (LFH) on the cell viability of HCT116 cells and Fibroblast cells. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. ^*,#,op < 0.05, ^**,##,oop < 0.01 and ^***,###,ooop < 0.001 compared to control. (a) The Fibroblast cells were pretreated with LFH for 24 h, 48h, 72h. (b) HCT116 cells were pretreated with LFH for 24 h, 48 h, 72 h. N.S.; not significant (each experiment, n = 3).

3.2. LFH에 의한 HCT116 대장암세포의 apoptosis 유도효과 확인

세포에서 apoptosis가 유도되면 세포막 내부에 존재하던 phosphatidylserine (PS)가 세포막 표면에 노출되게 되는데, 이를 통해 apoptosis가 유도되었는지를 확인할 수 있다 [16]. 본 연구에서는 LFH에 의한 HCT116 대장암세포의 세포증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 확인하기 위해 다음 실험을 진행하였다. HCT116 대장암세포에 LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 24시간 동안 처리하였다. 그 후, apoptosis로 인해 세포 내에서 발현되는 PS을 Muse® Annexin V & Dead cell staining으로 시행하여 LFH의 각 농도에서 PS의 염색 비율을 확인하였다. 그 결과 N군의 apoptosis 유발빈도는 약 12.1%로 낮았으나 LFH 처리 농도가 증가할수록 빈도가 증가하여 150 μg/ml를 처리한 군에서는 약 55.8%에 해당하는 세포에서 apoptosis가 유도되는 것을 관찰하였다(Fig. 2(a)). 또한 apoptosis로 인해 발생하는 염색체 응축 현상인 apoptotic body 형성과 apoptosis 진행에 따른 fluorescence 변화를 확인하기 위해 Hoechst 33342 assay를 실시하였다. HCT116 대장암세포에 LFH를 동일한 농도로 24시간 동안 처리하였을 때 apoptosis가 유도됨에 따라 농도 의존적으로 fluorescence 값이 감소함을 확인하였다 (Fig. 2(b)). 따라서 LFH 처리에 의한 HCT116 대장암세포의 세포증식억제 효과는 necrosis에 의한 현상이 아닌 apoptosis 유도에 의한 현상임을 확인하였다.

Figure 2. The effect of LFH on the apoptosis inducing of HCT116 cells. (a) The apoptotic effects of different concentrations of LFH were evaluated by the Muse^® Annexin V assay. The HCT116 cells were treated with LFH at different concentrations (30, 90, 150 μg/ml) for 24 h. (b) The Fluorescence due to the apoptotic bodies formed of different concentrations of LFH were evaluated by the Hoechst 33342 assay. The HCT116 cells were treated with LFH at different concentrations (30, 90, 150 μg/ml) for 24 h. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 compared to control (each experiment, n=3).

3.3. LFH에 의한 HCT116 대장암세포의 apoptosis 관련 신호전달 단백질 발현에 미치는 영향

Apoptosis를 유도하는 자극이나 손상이 가해지게 되면 암 억제 유전자인 p53이 활성화되어 downstream인 Bcl-2의 활성이 억제되며, 이로 인해 Bax와 Bak가 활성화된다. 활성화된 Bax와 Bak는 cytochrome C의 방출을 유도하며, 이로 인해 활성화된 caspase 3가 apoptosis를 유도하게 된다 [9,10]. 본 연구에서는 HCT116 대장암세포에 LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 24시간 동안 처리하였을 때의 apoptosis 관련 신호전달 단백질의 발현 영향을 알아보기 위해 Western blotting을 진행하였다. 그 결과, LFH의 농도가 증가됨에 따라 세포 증식에 관여하는 protein인 p-Akt와 p-Mdm2가 감소하는 것을 확인하였다. 또한 pro-apoptotic protein인 p-AMPK와 암 억제유전자인 p53의 활성화로 anti-apoptotic protein인 Bcl-2의 발현이 억제되면서 pro-apoptotic protein인 Bax와 Bak의 발현이 활성화되어 증가하였다. 이에 대해 LFH의 농도가 증가할수록 Pro-caspase 3의 발현이 감소하며 Cleaved-caspase 3의 발현이 증가하였다 (Fig. 3). 따라서 LFH를 처리한 HCT116 대장암세포에서 나타난 pro-apoptotic proteins의 농도 의존적인 증가 경향과 anti-apoptotic proteins의 농도 의존적인 감소 경향을 통해 apoptosis가 유도되었다는 것을 확인하였으며, 이를 기반으로 이후 실험을 진행하였다.

Figure 3. The LFH effects on the expression of apoptosis regulatory proteins. HCT116 cells were treated with the indicated concentrations of LFH for 24 h. The expression of p-Akt, p-Mdm2, p-AMPK, p53, Bcl-2, Bak, Bax, Pro-caspase 3, Cleaved-caspase 3, and β-actin were analyzed by Western blot analysis (each experiment, n = 3).

3.4. Akt, Mdm2 inhibitor 처리에 따른 HCT116 대장암세포의 세포증식억제 효과 및 신호전달 단백질 발현에 미치는 영향

본 연구에서는 앞선 Western blotting의 결과를 바탕으로 LFH가 Akt와 Mdm2를 경유하는 신호 경로를 통해 apoptosis를 유도한다는 가설을 세우게 되었다. 이를 기반하여 apoptosis가 일어나는 신호 경로를 확인하기 위해 각각 Akt와 Mdm2의 활성을 억제하는 LY294002 (20 μM)와 Nutlin-3 (20 μM)를 처리하여 MTT assay와 Western blotting을 진행하였다 [11,17]. 먼저 각각의 inhibitor를 단독 또는 LFH (90 μg/ml)와 병행하여 24시간 동안 처리한 후 MTT assay를 진행한 결과, LFH를 단독으로 처리하였을 때 68%, LY294002를 단독으로 처리하였을 때는 Akt의 활성이 억제되어 76.4%의 세포 증식률을 나타내었고, Nutlin-3를 단독으로 처리하였을 때는 Mdm2의 활성이 억제되어 55.8%의 세포 증식률을 나타내었다. 또한 LFH와 LY294002를 병행 처리하였을 때 44.8%, LFH와 Nutlin-3를 병행 처리하였을 때 22%의 세포 증식률을 나타내었다. 이로 인해 Akt와 Mdm2가 HCT116 대장암세포의 증식 및 생장에 영향을 미치는 것을 알 수 있으며, LFH도 inhibitor와 비슷한 세포증식억제 효과를 나타냄을 확인하였다 (Fig. 4(a)). 다음으로 Akt, Mdm2 inhibitor와 LFH의 처리에 따른 apoptosis 관련 신호전달 단백질들의 발현 영향을 알아보기 위해 HCT116 대장암세포에 LFH, LY294002, Nutlin-3를 동일한 농도로 24시간 동안 처리하여 Western blotting을 실시하였다. 그 결과, LY294002와 Nutlin-3를 처리하였을 때 세포 증식에 관여하는 protein인 p-Akt와 p-Mdm2 그리고 apoptosis 유도를 억제하는 anti-apoptotic protein인 Bcl-2와 Pro-caspase 3의 감소, apoptosis를 유도하는 pro-apoptotic protein인 p-AMPK, p53, Bak, Bax, Cleaved-caspase 3의 증가를 확인하였다 (Fig. 4(b)). 따라서 LFH는 HCT116 대장암세포에서 Akt와 Mdm2를 억제하여 이를 경유하는 신호 전달 경로, 즉 Akt/Mdm2 pathway를 통해 apoptosis가 유도된다는 가설을 입증하였다.

Figure 4. The effects on cell proliferation and the control of the signal protein via inhibition of Akt/Mdm2. Cells treated LY294002 and LFH in HCT116 cells. Cells were treated with 20 μM LY294002, 20 μM Nutlin-3 and 90 μg/ml LFH for 24 h. (a) Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **p < 0.01 and *** p < 0.001 compared to control. (b) The Cells were treated with 20 μM LY294002, 20 μM Nutlin-3 and 90 μg/ml LFH for 24 h. The expression of p-Akt, p- Mdm2, p-AMPK, p53, Bcl-2, Bak, Bax, Pro-caspase 3, Cleavedcaspase 3 and β-actin were analyzed by Western blot analysis (each experiment, n = 3).

본 연구에서는 HCT116 대장암세포에 LFH를 처리함으로 인한 항암 효과가 apoptosis 유도에 의한 것임을 확인하고자 하였다. MTT assay를 통해 정상세포인 Fibroblast 섬유아세포에 LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 처리하였을 때 세포독성이 없어 세포증식에 영향을 주지 않는 것을 확인하였으며, HCT116 대장암세포에 LFH를 농도별 (30, 90, 150 μg/ml)로 처리하였을 때 농도 및 시간 의존적으로 세포증식이 억제되는 것을 확인하였다. 이를 통해 LFH가 HCT116 대장암세포에 특이적으로 세포 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이를 기반으로 LFH에 의한 HCT116 대장암세포의 세포증식 억제 효과가 necrosis에 의한 것이 아닌 apoptosis 유도에 의한 것임을 확인하기 위해 HCT116 대장암세포에 LFH를 농도별로 처리 후 Annexin V & Dead Cell assay를 통해 농도의존적으로 apoptosis 유발 빈도가 증가함을 확인하였다. 추가적으로 apoptosis 유도 효과를 확인하기 위해 Hoechst 33342 assay를 통해 농도 의존적으로 apoptotic body의 형성과 apoptosis 진행에 따른 fluorescence 값이 감소함을 확인하였다. 또한 LFH에 의한 apoptosis 관련 신호전달 단백질의 발현 영향을 확인하기 위해 LFH를 농도별로 처리 후 Western blotting을 실시하였으며, anti-apoptotic protein인 p-Akt, p-Mdm2, Bcl-2, Pro-caspase 3의 감소와 pro-apoptotic protein인 p-AMPK, p53, Bak, Bax, Cleaved-caspase 3의 증가 경향을 확인하였다. 마지막으로 LFH가 Akt와 Mdm2를 경유하는 신호경로를 통해 apoptosis를 유도한다는 가설을 세워 실험을 진행하였는데, Akt와 Mdm의 저해제인 LY294002와 Nutlin-3를 처리하여 HCT116 대장암세포의 세포 증식 억제 효과와 Akt/Mdm2 pathway의 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과, LFH가 Akt와 Mdm2를 억제하고, 이들을 통하는 단백질들의 발현량을 조절함으로써 apoptosis를 유도한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 LFH의 HCT116 대장암 세포에 대한 항암효과를 확인하였으나, 아직 LFH의 항암 성분에 대한 연구는 미비한 실정이다. 그러므로 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등을 활용하여 잠재적인 항암 성분의 분리 및 탐색에 대한 추가 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.

본 연구는 2021년도 ㈜포바이오코리아의 용역사업 지원에 의해 수행되었음