Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal

pISSN 1225-7117 eISSN 2288-8268

Article

Home All Articles View

Research Paper

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2022; 37(3): 112-122

Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2022.37.3.112

Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.

고초균에서 유산균 균주의 글루탐산 탈탄산효소의 발현 및 분비: GABA 생성에 의한 생물학적 활성

Secretional Expression of Glutamate Decarboxylase Gene derived from Streptococcus thermophilus in Bacillus Subtilis: Its Biological Activities by GABA Production

Minsoo Kim1 and Jang Won Choi2*

1Division of Applied Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea
2Department of Bioindustry, Daegu University, Gyeongsan 38453, Korea

Correspondence to:Tel: +82-53-851-6756, Fax: +82-53-850-6939
E-mail: chjawo@daegu.ac.kr

Received: March 17, 2022; Revised: May 16, 2022; Accepted: May 18, 2022

Gamma-aminobutyric acid (GABA) can be converted from monosodium glutamate (MSG) by glutamate decarboxylase (GAD). GABA is known to be a four-carbon non-protein amino acid existing in the human brain and eye. Recent studies have shown that GABA is effective in accelerating hypotension and anxiety relief, along with acting as a diuretic, antidiabetic, and antidepressant in humans and other mammals. Since the low activity of cell preparations has been a major limitation to commercial enzyme synthesis, it is worthwhile to look for methods to obtain a affordable recombinant enzyme with high GABA synthesizing activity. In order to maximize production of GABA using the culture broth without purification in Bacillus subtilis, the gene (gadB) first was obtained from chromosome of Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) expressing the GAD with appropriate amount. The primer set with restriction enzyme sites and His-tag was designed by referring to the DNA sequence of glutamate decarboxylase enrolled in GenBank (DQ871217.2), amplified and cloned into pGemTeasy vector. The right clone was screened and characterized by DNA sequencung analysis. As a result, the DNA sequence was different from that of GenBank in codons encoding 4 amino acids (Tyr189, Gly282, Ser301, and Met425) by point mutations, which were changedto Cys189, Asp282, Gly301, and Thr425, respectively. To secret the GAD in culture medium, the recombinant vector (pRBASGadB, 7.83 kb) containing the gadB gene was constructed using pRBAS secretion vector with alkaline protease promoter (aprE-P, 0.45 kb) and signal sequence (aprS, 87 bp) and then transferred into Bacillus subtilis LKS87. The secretion levels of GAD were analyzed by SDS-PAGE and western-blot and the level in B. subtilis LKS87 harboring the pRBAS-GadB vector was increased to approximately 10-12% of total secreted proteins. The conversion of MSG (monosodiumglutamate) to GABA was measured by paper chromatography using the culture broth and PBS-eluted cell pellet. As a result, the culture broth shows 16% GABA conversion rate from MSG, whereas the pellet shows higher conversion (~43%), indicating that the expressed GAD was not sufficiently secreting into the culture broth caused by the inefficient processing of aprS signal sequence or presence of self signal sequence of the GAD gene. By measuring the ABTS+ scavenging ability, it was confirmed that the GABA converted by GAD showed higher antioxidant activity (55%) than that (50%) of ascorbic acid used as positive control. The survival recovery rate of STZ-treated RINm5F cells was increased to 28.2% by the GABA treatment and also, production of nitric oxide (NO) was drastically reduced with 78.7% in STZ-treated RINm5F cells, suggesting that the GABA possess antidiabetic and antioxidant activities. Finally, although GABA is showing various biological activities, it might be needed to optimize secretion efficiency for industrial applications.

Keywords: antidiabetic activity, gamma-aminobutyric acid (GABA), glutamate decarboxylase, secretion, Streptococcus thermophilus

현대인들의 불규칙적이고 부적절한 식습관과 환경오염 문제, 생활수준의 급속적인 발전 및 스트레스 증가 등의 문제들로 인해 다양한 기능성 성분에 대한 관심의 증가로 건강 보조 식품이 활발하게 소비되고 있다. GABA (γ-amino butyric acid)는 아세틸콜린이라 불리는 신경전달 물질 증가, 뇌기능촉진 등의 생리작용뿐만 아니라, 혈압과 맥박 조절, 항산화작용, 이뇨작용, 성장호르몬 분비 조절, 통증과 불안 완화에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [1]. GABA는 인간의 뇌와 눈에서 풍부하게 발현되는 4탄소 비단백질 아미노산이며, 동물에서 고혈압과 이뇨 작용을 하는 주요 억제성 신경전달물질로서 작용한다. 또한 GABA는 식품 및 의약품의 생리활성 성분의 잠재력으로 인해 이완을 촉진하고 신경 긴장을 완화하는 기능성 식품의 성분으로 활용되었으며 [2-4]. 최근연구에 따르면 GABA는 췌장에서 인슐린의 강력한 분비 촉진제이기도 하여 당뇨병을 효과적으로 예방한다고 보고되었다 [5]. 화학적으로 합성된 GABA를 식품에 직접 적용하는 것은 잠재적으로 해로울 수 있기 때문에 생물학적으로 생산된 GABA의 대량 생산에 의해 식품 적용에 대하여 많은 관심을 받았다 [6]. 생물학적활성을 갖는 GABA는 세 가지 독립적인 과정에 의해 생산될 수 있다. 첫 번째는 고유한 또는 재조합 주입 GABA 합성 경로를 보유하는 미생물의 발효에 의해 포도당과 같은 재생 가능한 탄소원에서 GABA를 직접 합성하는 것이다. 그러나 이 전략으로는 GABA의 높은 수준의 생산이 성공하지 못했다. 둘째, 정제된 monosodium glutamate (MSG) 또는 glutamic acid를 GABA로 효소적 전환에 사용할 수 있다 [7]. Glutamate decarboxylase (GAD)를 사용하여 MSG로부터 GABA의 효소적 합성은 GABA의 높은 전환 수율 및 반응 완충액에서 GABA의 낮은 오염과 같은 몇 가지 이점이 있다. 셋째, GAD대신 MSG를 GABA로 전환할 수 있는 천연 및 재조합 미생물을 MSG를 출발 물질로 사용하여 GABA 생산을 위한 생체 촉매로 사용할 수 있다. 또한 최근 연구에 따르면 GABA는 일부 유산균(LAB)에 의해L-glutamate로부터 효율적으로 생성될 수 있다고 보고되었다 [8,9]. GAD는 PLP (pyridoxal 5’ -phosphate) 의존성 효소로 L-glutamate의 GABA로의 비가역적인 α-탈탄산 반응을 촉매하며 원핵 및 진핵생물에 널리 분포되어 있다 [10]. 대장균 염색체는 GAD의 두 가지 생화학적으로 동일한 형태인 gadA와 gadB를 암호화하는 별개의 유전자를 포함하며, GAD에 대한 결정 구조와 기능에 대하여 분석 및 연구되었다 [11,12]. GABA는 GAD의 촉매작용에 의해 L-glutamate가비가역적 탈탄산화 반응에 의해서 생합성 되는 매커니즘을 가지고 있으며, 유산균 (LAB)을 포함한 미생물 및 동식물에서도 발견된다 [13]. GABA 생성 미생물에서 GAD operon은전사 조절자 (gadR), glutamate decarboxylase (gadA 또는/및gadB) 및 glutamate/GABA antiporter (gadC)로 구성되어 있다[14], 또한 프로바이오틱으로 판매되는 유산균, Streptococcus thermophilus의 경우에서도 glutamate decarboxylase (gadB) 및 glutamate/GABA antipoter (gadC)를 암호화하는 GABA생합성을 담당하는 유전자가 이 균주의 게놈에서 확인되었다 [15]. GABA에 대한 상업적 수요 증가로 인해 합성을 위한 다양한 화학적 및 생물학적 방법이 연구되었고, GABA의생합성은 간단한 반응의 매커니즘, 고효율 효소 합성, 간편한 반응 조건 및 환경 적합성의 장점을 지닌다. 다양한 미생물로부터 정제된 천연 및 재조합 GAD는 이전에 GABA를생산하는데 사용되었으나 이러한 시스템에서 GABA를 회수하려면 복잡한 정제 단계가 필요하기 때문에 미생물 세포에 의한 GABA의 생합성은 효소 분리 및 정제에 대한 요구 사항을 제거하고 최종 제품 생산을 위하여 정제 과정을 단순화해야한다. 대표적 그람 양성균인 고초균 (Bacillus subtilis)은 성장 속도가 빠르고 유전적인 체계가 잘 확립되어 있으며, 유전자 조작이 용이하고 넓은 범위의 코돈 사용빈도를 갖는다. 또한 안전성이 입증된 generally regarded as safe (GRAS) 균주로 알려져 있다. 일반적인 발효과정에서 보듯이 B. subtilis는 자체적으로 효율적인 protein secretion system을 가지고 있어 활성적인 많은 양의 유용 단백질을 발효액으로 분비하는 잇점이 있으며, 또한 단백질 회수 및 분리가 용이하므로 외래 단백질 생산의 주요 host cell로 많이 사용되고 있다 [16-19].

따라서 본 연구에서는 GABA 원료를 충분히 확보하고 분비시스템을 통한 정제과정의 단순화를 위하여 우선적으로S. thermophilus 균주에서 gadB 유전자를 클로닝하고 그 유전자에 His-tag 서열을 도입한 다음, pRBAS secretion vector [20]로 cloning하여 고초균에서 분비를 시도하였다. 배양조건에 따른 분비 최적화를 통하여 생산된 GAD (from S. thermophilus)를 사용하여 GABA로 전환하고, paper chromatography에 의한GABA 전환율 [21], insulinoma 세포인 RINm5F cell [22]에서 세포증식 및 streptozotocin (STZ)에 의한 손상된 세포의 복구능 (MTT assay), 항산화활성 및 nitric oxide (NO) 생성률 등을 조사하어 GABA의 생물학적 활성을 검정하였다.

2.1. 재료 및 시약

제한효소는 TAKARA (Shiga, Japan) 및 Elpisbio (Daejeon, Korea)로부터, T4 DNA ligase는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, USA), EmeraldAmp® GT PCR Master Mix는 TAKARA (Shiga, Japan)로부터, oligomer는 Genotech (Daegeon, Korea)사로부터 합성하여 사용하였다. Tryptone, yeast extract, 및 Bacto-agar와 같은 배지 성분은 Merck (Lutterworth, Germany)사로부터 구입하였고, Pyridoxa 5′-phosphate (PLP) monohydrate는 TCI (Tokyo, Japan)로부터, L-Glutamic acid monosodium(MSG)와 γ-aminobutyric acid (GABA standard)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터, Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), membrane Immobilon-PPVDF는 Millipore (Bedford, MA, USA), Wizprep agarose gel purification kit는 Wizbiosolutions (Locohills, NM, USA), pGEM Teasy cloning kit는 Promega (Madison, Wisconsin, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 1차 및 2차 항체는 Genscript (New Jersey, USA) 및 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사로부터 구입하였으며, 나머지 시약들은 분석용 수준급을 사용하였다.

2.2. Bacterial strains, plasmid 및 medium

PCR 산물의 클로닝에 의한 plasmid 증폭 및 형질전환을 위한 기본 숙주로 E. coli XL1-Blue MRF’ (F‘, proAB, lacIqZ△M15, thi, recA, gyrA, relA, supE, Tn10) (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하였으며, GAD 유전자원 확보를 위하여 Streptococcus thermophilus 균주는 일반 김치에서 분리하여 동정 후 사용하였다. 재조합 vector가 도입된 대장균 형질전환체는 37°C, 항생제 ampicillin (50 μg/mL)이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 배지 [23]에서 배양하였고, 유전자원 확보를 위한 Streptococcus thermophilus 균주의 배양은 37°C, MRS 배지 [24]에서 배양 후 염색체 DNA를 추출하였다. PCR 산물 클로닝을 위하여 pGEM-Teasy vector (Promega, Wisconsin, USA)를 사용하였고, 고초균에서 발현 및 분비용벡터는 알칼리성 단백질분해효소 (alkaline protease) 유전자 (aprE)의 promoter (aprE-P)와 signal sequence (aprS)를 함유하는pRBAS vector [20]를 사용하였으며 분비균주로는 Bacillus subtilis LKS87 (nprR2, nprE18, aprA3, amyE) 균주 [25]를 사용하였다. 재조합벡터가 포함된 고초균 (Bacillus subtilis harboring pRBAS-GadB)은 kanamycin (50 μg/mL)을 첨가한 LB 배지를 37°C에서 전 배양 후, kanamycin (50 μg/mL)이 첨가된 PY [26] 배지에서 0.5-1% 접종 후 30°C에 배양하였다. 생물학적 활성측정 (세포 생존복구율 및 항당뇨효과)을 위한 동물세포는 insulinoma 세포인 RINm5F [22] 세포를 사용하여 분석하였다.

2.3. GAD 유전자 확보 및 재조합 발현 분비벡터 구축

유산균의 glutamate decarboxylase유전자 (gadB)를 확보하기 위하여 S. thermophilus 균주를 MRS 배지 [24]에 접종 후 37°C에서 overnight 배양한 다음 세포를 수거하여 염색체 DNA를 Johansen and Kibenich (1992) [27]의 방법에 따라 분리하였다. 즉 배양액 1.5 mL로부터 수거한 균체를 −20°C에서 1시간 이상 얼렸다가 녹인 후, TES buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 6.7% sucrose)로 washing한 후, STET buffer (25% sucrose, 5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, lysozyme 30 mg/ml) 374 μL에 현탁하여 15분간 37°C에서 배양하였다. 상기 배양액에 20% SDS 40 μL를 첨가하여 혼합한 후 37°C에서 30분간 반응시키고 65°C에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액에 TE 완충용액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) 100 μL를 첨가한 후 페놀처리로 단백질을 제거하고, 2배의 에탄올을 첨가하여 원심분리에 의해 염색체 DNA를 분리하였다. S. thermophilus 균주의 염색체로부터 gadB 유전자를 증폭시키기 위하여 이미 보고된 S. thermophilus Y2 (GenBank DQ871217.2) nucleotide 서열을 참고하여 제한효소 부위 및 His-tag 암호화 부위가 첨가된 specific primer set [Forward primer (EcoRI) 5'GGGGAATTCAATGAGAAGCTATTCAGAGAG3', Reverse primer (SmaI) 5’ CCCCCCGGGTTAATGGTGATGGTGATGGTGATGATGGAAGCCACTGCG 3’]를 설계하여 합성한 후, 추출 분리한 염색체 DNA를 주형으로하여 PCR을 하여 얻어진 1.4 kb 크기의 단편을 pGEM-T easy vector (T-gadB)에 cloning하여 대장균에서 screening후 서열분석을 하여 유전자원으로 사용하였다. GadB의 유전자가 도입된 분비벡터를 구축하기 위해, T-gadB vector (4.4 kb)를 EcoRI과 SmaI으로 잘라 1,4 kb DNA 단편을 agarose gel로부터 확보하고, 같은 제한효소로 자른 pRBAS vector와 ligation 한 뒤, E. coli XL1-Blue MRF '로 형질전환하여 올바른 형질전환체를 선별한 다음 최종적으로 염기서열을 분석하여 이를 pRBAS-GadB(7.83 kb)로 명명하였다.

2.4. 고초균 형질전환 및 단백질 발현 분비 분석

최종적으로 확인된 pRBAS-GadB (7.83 kb) 재조합 vector는 SPMM-I (Spizizen's minimal medium)과 SPMM-II 배지를 사용하는 Sadaie and Kada [28] 방법에 의해 고초균 (B. subtilis LKS87)으로 형질전환하였고, kanamycin (50 μg/mL)이 들어간 LB 고체배지에서 형질전환체를 선별하여 GAD 단백질 발현 및 분비를 위하여 사용하였다. 얻어진 배양액을 직접적으로 또는 에탄올 침전에 의해 농축하여 2 x sample buffer(0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 10% glycerol, and 0.1% bromophenol blue)에 현탁하여 100°C에서 10분 가열 후 12% SDS-PAGE (sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) [29]에 의해 분획한 다음, Trans-Blot SD apparatus (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 gel상의 단백질들을 PVDF membrane으로 이동시키고, TBST (10mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)에 skim milk를 5% 농도로 첨가하여 4°C에서 blocking 시켰다. 그 후, 1차 항체인 rabbit polyclonal anti-His-tag antibody (Genscript, 1:1,000 dilution, New Jersey, USA)로 1시간동안 반응시킨 다음, 결합되지 않은 1차 항체는 TBST 용액으로 세척하여 제거하고 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated antirabbit IgG secondary antibody (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)로 1시간동안 반응한 후, ECLTM Western blotting detection system (Amersham Pharmacia Biotech, California, USA)을 이용하여 X-ray 필름에 감광하였다. 그 blot을 스캔하여 ChemiImagerTM (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, USA)로 단백질의 농도를 간접적으로 비교 측정하였으며, 배양액내에 분비된 전체 단백질의 직접적인 정량은 BSA (bovine serum albumin)를 standard로 하여 Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [30]를 사용하여 정량 하였다.

2.5. Paper chromatography (PC) 분석

GABA 및 MSG의 정성 분석을 위해 3M paper를 10 × 15 cm의 크기로 잘라서 사용하였고, GABA 함량과 MSG 잔존량 비교를 위한 standard로 L-Glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 50 mg/ml와 GABA standard (100 mg/ml)를 사용하였다. 전개 용매는 L-butanol : acetic acid : distilled water를 4:1:2 (v/v) 의 비율로 혼합하여 사용하였다. GAD 분비 고초균을 100 ml MRS 배지에 접종 후, 30°C incubator에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리에 의해 배양액과 pellet을 수거하고, cell pellet은 washing 후 PBS를 포함하는 lysis buffer로 파쇄 후 상층액을 취하고 L-glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 150 mg/mL)와 pyridoxal 5′-phosphate (PLP) monohydrate (0.15 mM)를 넣고 pH가 4.0-5.0이 되도록 맞춰준 후, 37°C incubator (80 rpm)에서 24시간동안 교반하였다. 발효액과 standard 용액을 3 MM paper의 아래 부분에서 1 cm 정도 되는 위치에 2 μL를 점적하였고 (3 반복), 간격은 10-15 mm를 유지하였다. 점적 후 paper의 sample을 건조한 다음 전개하였고, 전개가 끝난 paper는 감압건조기에서 건조한 다음 발색 시약인 ninhydrin 용액 (0.1-0.5%)을 뿌리고, 90-100°C 건조기에서 5-10분 동안 발색 시켜 발효액과 standard의 MSG로부터 전환된 GABA spot을 확인하였다 [21].

2.6. ABTS+ 소거능에 의한 항산화활성 측정

ABTS+ [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)는 과황산칼륨 (potassium persulfate)에 의해 전자를 손실하여 짙은 청녹색을 나타내지만, 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 색이 옅어지는 과정을 통하여 항산화능을 측정하는 원리이다. ABTS+ radical 소거활성 측정 [31, 32]은 최종 농도 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate stock을 혼합하여 실온하에서 암 반응이 완료되고 흡광도가 안정될 때까지 4-16 시간 동안 반응하여 ABTS+를 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.05이 되게 하였다. 희석된 시료20 μL를 반응 용액 180 μL에 넣어 1분 동안 반응한 뒤 흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 소거 활성(ABTS+)은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50%로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC50 값으로 나타냈으며 이때, 상대 활성의 비교를 위해 ascorbic acid를 대조군으로 사용하였으며, 항산화 효과는 ABTS scavenging effect = [(ODcontrol − ODsample)/ODcontrol] × 100% 수식을 사용하여 농도에 따른 흡광도 감소를 측정하여 계산하였다.

2.7. 동물세포 배양 및 세포 생존율 측정 (MTT assay)

Insulinoma 세포주로서 RINm5F세포 [22]는 쥐 췌장 세포종에서 유래되었고 American type culture collection (ATCC, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포배지는 fetal calf serum(10%), penicillin (100 unit/mL), streptomycin (100 μg/mL)을 첨가한 RPMI-1640을 사용하였고 96 well plate 및 petri dish에서 배양하였다. 세포수를 측정하기 위하여 trypsin EDTA를 넣고 37°C에서 20분간 배양한 다음, scratch로 세포를 떼어내고 3,000 rpm에서 원심분리 한 후 상등액을 제거한 후, 신선한 배지를 넣고 현탁하여 hemocytometer (Thermo fisher scientific, Inc. Waltham, MA USA)를 이용하여 세포수를 측정하고 실험에 맞게 세포수를 조절하여 분획 후 사용하였다. 항당뇨효과는 streptozotocin (STZ)을 처리하여 type I 당뇨를 유발시키고, 세포증식 및 viability측정에 의해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)가 formazan으로 환원되는 것을 이용한 MTT assay를 통해 세포의 생존복구율을 측정하였다 [33,34]. 즉, 배양된 당뇨세포주 (RINm5F cell)를 96 well plate에 2 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양한 후 대조군을 제외하고 각 well에 STZ (2 mM)를 처리하고 30분간 방치하였으며, STZ가 포함된 배지를 제거해준 다음, 각 well에 대조군과 함께 시료(농도별)를 포함하는 새로운 RPMI-1640을 넣고 24시간동안 배양하였다. 배양한 세포에 1 × PBS에 녹인 MTT (5 mg/mL) 용액 50 μL를 각 well에 넣고, 5% CO2 incubator에서 4시간 동안 반응시킨다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고, 각 well마다 100 μL의 DMSO를 첨가하여 microplate reader를 사용하여 생성된 formazan crystal을 흡광도 570 nm에서 측정하였다. 세포 생존율은 시료를 처리하지 않고 무처리군 (세포만 배양)의 생존율 100%를 기준으로 세포생존율 (cell viability, %)을 상대적으로 계산하였다.

2.8. Nitric oxide (NO) 생성량 측정

Nitric oxide (NO)의 농도는 Griess Reagent System을 이용한 마이크로 분석 방법에 의해 배양액 내의 nitrite 농도를 측정하였다 [35]. RINm5F 세포를 2 × 104 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주 후 하루 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하고, STZ (2 mM) 처리 후 30분 동안 37°C에서 두었다가 배지를 제거하였다. 그 다음, 대조군과 함께 시료를 농도별로 처리한 후, 하루동안 37°C에서 배양한 다음 배양 상등액 100 μL를 취하여 새로운 96 well plate에 넣고 여기에 같은 양의 Griess 시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphtyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)을 첨가하여 10분동안 실온에서 반응 후, 540 nm에서 microplate reader를 사용하여 측정하였고, 산화질소 함량은 아질산나트륨을 표준으로 비교하여 측정하였다 [36].

2.9. 통계적 분석

결과는 통계적 유의성에 대한 사회 과학 (SPSS) 프로그램의 통계 패키지를 이용하여 분산 (ANOVA) 시험의 한 경로로 분석하였다. 모든 데이터는 평균 ±표준 편차 값으로 표현된다. 모든 분석에서 0.05보다 작은 P값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

3.1. 유산균으로부터 glutamate decarboxylase 유전자 (gadB) 확보

기존의 알려져 있는 Streptococcus thermophilus Y2균주의 gadB 유전자 (GenBank accession number, DQ871217.2) 서열[37]을 참조하여 제한효소부위와 reverse primer에 His-tag(6His)이 도입된 primer set를 디자인하여 Streptococcus thermophilus 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭한 결과 약 1.4 kb 크기의 DNA 단편을 얻었고, pGEMTeasy vector로 클로닝하여 염기서열 분석하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 glutamate decarboxylase는 459 아미노산으로 구성되어 있고 예상 분자량은 52.6 kDa이며, CDS (coding sequence)는 1,377 nucleotide로 구성되어 있다. GenBanK에 등재된 Streptococcus thermophilus Y2 균주의 GAD단백질 (DQ871217.2)의 아미노산 서열과 비교해 볼때 전체 구성 아미노산들 중에서 4개의 아미노산에서 코돈중 하나의 염기가 바껴 아미노산이 변화가 일어났지만, 즉 Tyr189이 Cys189로, Gly282이 Asp282로, Ser301이 Gly301으로, Met425이 Thr425으로, 여러 균주의 아미노산 서열들의 multiple alignment [37]에서 비교해 볼 때 보존서열이 아니므로 효소 활성에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 판단된다. 이렇게 증폭되고 확인된 gadB 유전자는 고초균 분비벡터로 도입하여 고초균에서 배양액으로 분비를 시도하였다.

Figure 2. DNA sequence of the amplified gadB gene using specific primer set in frame. The gene is encoded by 459 amino acids. Four amino acids were changed to Cys189, Asp282, Gly301, and Thr425, compared to GenBank sequence of Streptococcus thermophilus Y2 (DQ871217.2)

3.2. Glutamate decarboxylase 유전자 (gadB)를 포함하는 분비벡터 구축

대장균에서 glutamate decarboxylase 유전자들의 발현은 단백질 생성과 함께 굴절체 (inclusion body)를 형성하므로 효소 활성을 위해 굴절체 회수, 변성, air oxidation, 및 chromatography 과정을 통하여 정제한 다음 사용하므로 시간과 노동력, 정제비용이 많이 소모되므로 산업적 응용에는 적합하지 않다. 따라서 배양액에 직접 효소를 분비하여 직접적으로 glutamate를 GABA로 전환시키는 것이 효소 생산 및 전환수율 향상에 효율적이라 판단하여 고초균에서 분비능이 확인된 pRBAS 분비벡터 [20,38]에 gadB 유전자를 직접적으로 클로닝하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 gadB 유전자가 클로닝되어 있는 T-GadB (4.4 kb) 벡터를 EcoRI과 SmaI으로 처리하여 1.4 kb으로 DNA 단편을 추출한 다음, pRBAS벡터 (6.43 kb)를 같은효소로 자른 다음 elution하여 직선형의 벡터로 ligation하여 대장균에 형질전환과 screening과정을 거쳐 pRBASGadB 재조합벡터(7.83 kb)를 구축하였다. 다른 여러 단백질의 활성 형태의 분비가 확인된 분비벡터 pRBAS [20,38]는 alkaline protease promoter (aprE-P, 0.45 kb), signal sequence(aprS, 87 bp) 및 리보솜결합서열 (GGAGAGGG)을 갖는 벡터로서 alkaline protease 신호서열에 frame이 맞도록 gadB 유전자가 결합되었는지 여부는 DNA 염기 분석에 의해 재차 확인한 다음, 대장균에서 증폭하여 Bacillus subtilis 형질전환을 위하여 사용하였다.

Figure 1. Construction of the secretion vector, pRBAS-GadB containing glutamate decarboxylase gene of Streptococcus thermophilus.

3.3. 고초균 형질전환체서 GAD의 분비 발현 및 단백질 분석

재조합 분비벡터 (pRBAS-GadB, 7.83 kb)는 Sadaie and Kada[28] 방법에 의해 고초균으로 도입되었으며, kanamycin(50 μg/mL)을 첨가한 LB 고체배지에서 형질전환체를 선별한 후, plasmid를 분리하여 PCR에 의해 도입되어진 gadB 유전자를 다시 확인하였다. 확인된 형질전환체들 중 2종을 선별하여 LB배지에서 시간별 (12 h~48 h)로 배양 한 다음, 발효액을 수집하여 SDS-PAGE 및 His-tag에 대한 항체를 사용하여 western blot에 의해 분비된 glutamate decarboxylase를 확인하였다. Fig. 3에서 보듯이 2종류 형질전환체의 경우 비슷한 분비 정도를 보였고 (10~12% of total secreted proteins), 배양시간에 따른 균체 증가에 의한 전체 분비된 단백질은 증가하였지만, 분비된 GAD가 차지하는 비율은 거의 비슷한 수준으로 분비되었다. 또한 GAD의 분자량은 459 아미노산으로 구성되어 52.6 kDa으로 예상되지만, aprS 신호서열과 결합시 GAD의 개시코돈 Met이 제거되고, 연결부위에 EcoRI 제한효소부위에서 유래된 GAA (Glu) 및 TTC (Phe) 2개의 아미노산이 첨가되어 460개의 아미노산으로 구성되며 또한 C-말단에 6개의 Histidine이 첨가되므로 최종적으로는 466개의 아미노산으로 구성되어 GAD의 분자량은 53.4 kDa 정도로 예상할 수가 있다. 또한 C-말단의 추가된 6개의 Histidine에 대한 일차 항체를 사용하여 항원항체 반응 결과, Fig. 3B에서 보듯이 분비 효율적인 면에서 최적화 실험 [39]이 추가로 진행되어야 할 필요성은 보이지만 활성적인 GAD가 분비되었다는 것을 간접적으로 확인하였다.

Figure 3. Protein analyis of the secreted GAD in B. subtilis LKS87 harboring pRBAS-GadB by SDS-PAGE(A) and western blot (B). The cells were incubated in PY medium at 30°C according to time intervals. The arrow indicate the position of GAD. M, MW marker; lane 1, pRBAS (negative control); lane 2, pRBAS-GadBHis-1, 12 h; lane 3, pRBAS-GadBHis-2, 12 h; lane 4, pRBAS-GadBHis-1, 24 h; lane 5, pRBAS-GadBHis-2, 24 h; lane 6, pRBAS-GadBHis-1, 48 h; lane 7, pRBAS-GadBHis-2, 48 h.

3.4. 배양액에 분비된 GAD의 생물학적 활성

3.4.1. Paper chromatography에 의한 GABA 전환

배양액에 분비된 GAD 효소의 glutamate 기질에 대한 GABA 전환을 측정하기 위하여 paper chromatography (Fig. 4)를 수행하여 확인하였다. 재조합 분비벡터의 promoter는 유도발현이 아닌 일정한 수준으로 발현 분비 (constitutive expression)되므로 단백질 분비가 확인된 형질전환체를 사용하여 LB 배지에서 24시간 배양한 다음, 배양액과 cell pellet을 수거하여 GABA 생성을 분석하였다. 컨트롤로 GABA 함량과 MSG 잔존량 비교를 위하여 GABA standard (100mg/mL) 및 L-Glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 50 mg/mL)를 사용하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 배양액의 경우 기질로 사용한 MSG를 약 16% 정도 GABA로 전환시켰으며, cell pellet을 파쇄하여 PBS buffer로 용출하여 분석하였을 때는 약 43% 정도의 GABA 전환을 보였다. 이와 같은 결과는 다른 단백질에서 100% 거의 분비 효율성이 확인된 신호서열 (aprS)의 분비 효율성의 문제 보다는 [20,38], 사용한 유전자 (gadB)내에 존재할 수도 있는 자체 신호서열의 존재에 의한 processing 부위의 변화에 의한 분비율 저하에 기인할 수도 있으며, 또한 GAD효소 활성이 복합배지내 다른성분들에 의해 방해를 받을 수도 있다고 판단된다. 따라서 다른 신호서열 pelB 및 torA [40]의 사용, 추정의 자체 신호서열 제거에 의한 재조합 벡터의 재구성 및 최소배지를 사용한 발현 분비의 최적화 또한 부분 정제에 의한 purity 향상에 의해 해결될 수 있을 것이라 판단된다.

Figure 4. Confirmation of GABA conversion efficiency using paper chromatography. lane 1, GABA standard (0.5 g/10 ml); lane 2, Glutamate (MSG, 100 mg/ml); lane 3, GABA from GAD of Streptococcus thermophilus. GABA conversion ratios were investigated for culture broth and PBS-eluted cell pellet, respectively.

3.4.2. ABTS+ 라디칼 소거에 의한 항산화 활성 측정

ABTS+ radical [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS+]은 상당히 안정하며 산화촉진제를 필요로 하지 않고 유기상 및 수용상에서 항산화활성을 모두 적용할 수가 있는 가능한 측정 방법이다. 또한 과황산칼륨 (potassium persulfate)에 의해 전자를 손실해 짙은 청녹색을 띄지만, 항산화 물질의 전자공여능으로 색이 옅어지는 과정을 통해 항산화능을 측정하는 방법이다 [31,32]. Fig. 5에서 보는 바와 같이 GAD 생성 배양액으로 부터 형성된 GABA (1, 317 μg/mL) 생성물과 positive control로 사용한 ascorbic acid (20 μg/mL) 시료를 각각 20 μL씩 사용하여 3반복에 의해 ABTS+ 라디칼소거 활성을 측정한 결과, GABA 시료의 경우 55%, ascorbic acid의 경우 50%로 나타났다. 수치상으로 보면 GABA의 항산화활성이 높아 보이지만 최종적으로 사용한 GABA농도의 경우 26.3 μg이고, ascorbic acid의 경우 0.4 μg이므로 항산화활성의 효율적인 면에서는 ascorbic acid보다 떨어지나 항산화활성은 확인되었다고 보여지며 또한 GAD활성 촉진을 위한 효소 cofactor인 PLP농도별 투여에 의한 GABA 생성의 질적인 향상 [41] 및 생성 GABA 용액의 부분 정제 필요성이 있다고 판단된다.

Figure 5. Antioxidant activity of GABA by GAD from S. thermophilus. The activity of culture broth was analysed using ABTS+ radical scavenging methods with ascorbic acid as standard. Each determination was made in triplicate, and the data are expressed as means ± SD.

3.4.3. GABA 투여에 의한 당뇨세포주 생존복구율 및 nitric oxide생성량의 변화

당뇨세포주인 insulinoma RINm5F [22]에 STZ (streptozotocin)을 처리하여 type I 당뇨 모델을 유발하고, negative control로서 MSG (Monosodium Glutamate) 및 positive control로서 GABA standard를 대조군으로 하여 GAD에 의해 전환된 GABA를 부분 정제후 처리하여 생존 복구율을 측정하였다. 즉, RINm5F cells을 96 well plate에 분주하여 (2 × 104 cells/mL) 하루 배양하고, 세포들이 50%정도 사멸되는 농도로 STZ(2 mM)을 30분간 처리하여 세척후, 농도별로 시료를 처리하여 배양한 다음 MTT assay에 의해 세포들의 생존복구율을 측정하였다. 즉, 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성 기질 (노란색) MTT가 불용성 기질 (보라색) formazan으로 환원되는 매커니즘을 이용한 방법인 MTT assay는 생성된 formazan의 흡광도는 대사가 왕성하거나 살아있는 세포의 농도를 반영한다. Fig. 6에서 보는바와 같이, STZ와 시료를 처리하지 않은 무처리군의 생존율을 100%로 기준을 잡고 처리군들의 세포 생존률을 상대적으로 계산한 결과 negative control로 사용한 MSG의 경우 거의 생존률이 복구되질 않았지만, positive control로 사용한 GABA standard의 경우 20 μL (100 μg) 이상의 농도로 처리하였을때 34.4% 정도의 세포 생존율이 복구 되었으며, 거의 같은농도로 처리한 부분정제한 GABA (by GAD from S. thermophilus)의 경우에도 28.2% 정도 생존율이 복구되는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 GABA가 비록 세포 수준이지만 제1형 당뇨 세포주에서 당뇨 개선에 영향을 주는 것으로 보이며, 이를 입증하는 연구로서 GABA는 췌장내 랑겔한스섬의 베타세포를 유지하고 베타세포 신생에 중요한 역활을 하며 인슐린 분비를 조절하고 제1형 및 2형 당뇨에 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다 [42,43].

Figure 6. Effect of GABA (by GAD from S. thermophilus) on survival recovery rate of STZ-treated RINm5F cells. (A) Negative control (MSG, 10 mg/ml), (B) GABA standard (5 mg/ml), (C) GABA from GAD of S. thermophilus. Values are mean ± SD of triple determinations.

3.4.4. GABA 투여에 의한 Nitric oxide (NO)의 변화

Nitric oxide (NO)는 glutamate의 뇌세포내 농도 및 glutamic acid decarboxylase, transaminase의 활성에 큰 영향을 주는 것으로 보고되었다 [44]. 췌장 베타세포에서 미토콘드리아의 오작동과 염색체 DNA의 손상을 초래하며, STZ로 인한 당뇨병의 요인들은 알킬화 (alkylation)와는 관련이 없지만 NO donor로 잠재적인 역할을 한다고 알려져 있고 또한 세포에서 세포자살 (apoptosis)를 일으키는 것으로 알려져 있다 [45, 46]. 재료 및 방법에서 기술한 방법에 의해 실험을 수행한 결과 negative control로 사용한 MSG의 경우 NO 생성이 억제되질 않았지만, positive control로 사용한 GABA standard의 경우 30 μL (150 μg) 농도로 처리하였을때 STZ만 처리 하였을 때보다 71.7% 정도의 NO 생성이 억제되었으며, 거의 같은농도로 처리한 부분정제한 GABA (by GAD from S. thermophilus)의 경우에도 78.7% 정도 NO 생성율이 저하된 것으로 나타났다 (Fig. 7). 이와같은 결과는 GABA가 제1형 당뇨의 유발요인인 NO 생성을 억제하므로서 손상된 당뇨세포주의 생존을 복구 시킬수 있다는 것을 보여 주며, 항당뇨 효과까지 있다는 가능성을 나타내는 것이다 [47]. 결론적으로 고초균에서 발현 분비된 GAD (from Streptococcus thermophilus)의 생물학적 활성, 즉 당뇨세포주의 세포 생존복구율 향상, 항산화활성 증가 및 항당뇨효과의 개선 가능성을 보였지만, 아직 배양조건에 의한 분비효율의 최적화, 분비서열의 교체, 분비된 GAD의 효소활성 증가에 따른 GABA 생성 전환율의 증진에 관련된 추가적인 실험에 의해 보완될 필요는 있다.

Figure 7. Effect of GABA (by GAD from S. thermophilus) on nitrite generation in STZ-treated RINm5F cells. Values are mean ± SD of triple determinations. (A) Negative control (MSG, 10 mg/ml), (B) GABA standard (5 mg/ml), (C) GABA from GAD of S. thermophilus.

Streptococcus thermophilus (S. thermophilus)는 glutamate decarboxylase (gadB)와 glutamate/GABA antiporter (gadC) 관련 유전자를 지니며, S. thermophilus 염색체부터 gadB 유전자의 클로닝, GAD의 단백질 발현 및 분비, GABA 생성능과 생물학적 활성을 확인하기 위해 primer set 합성과 함께 PCR에 의해 유전자를 증폭하였다. 유전자 gadB의 CDS (coding sequence)는 1,377 nucleotide로 구성되어 459 아미노산에 대하여 암호화하며 예상 분자량은 52.6 kDa이다. 배양액에 효소를 분비하여 직접적으로 glutamate를 GABA로 전환시키는 것이 효소 생산 및 전환 수율 향상을 위하여 효율적이므로 고초균에서 분비능이 확인되고, alkaline protease promoter (aprE-P, 0.45 kb), signal sequence (aprS, 87 bp) 및 리보솜결합서열 (GGAGAGGG)을 갖는 pRBAS 분비벡터에 서열 분석에 의해 확인된 gadB 유전자를 직접적으로 클로닝하여 pRBAS-GadB 재조합벡터(7.83 kb)를 구축하고 Bacillus subtilis LKS87에 형질전환하여 재조합벡터를 함유하는 형질전환체를 확보하였다. 재조합체를 LB배지에서 시간별(12 h~48 h)로 배양 한 다음, 발효액을 수집하여 SDS-PAGE 및 His-tag에 대한 항체를 사용하여 western blot에 의해 분비된 glutamate decarboxylase를 확인하였으며 분비 정도는 전체분비단백질 중 10~12% 정도였으며 배양시간에 따른 균체 증가에 의한 전체 분비된 단백질은 증가하였지만, 분비된 GAD가 차지하는 비율은 배양시간 및 형질전환체에 따라 비슷한 수준으로 분비되었다. 분비 효율적인 면에서 최적화 실험이 추가로 진행되어야 할 필요성은 있지만 활성적인 GAD가 분비되었다는 것을 간접적으로 확인하였다. GAD효소에 의한 GABA 생성율을 paper chromatography에 의해 측정한 결과 GAD가 분비된 배양액의 경우 기질로 사용한 MSG (Monosodium glutamate)를 약 16% 정도 GABA로 전환시켰으며, cell pellet을 파쇄하여 PBS buffer로 용출하여 분석하였을 때는 약 43% 정도의 GABA로 전환을 보였다. 이는 아직 분비되지 않고 세포내에 남아있는 GAD가 존재하는 것을 의미하며 신호 서열 (aprS)의 교체 및 추정의 GAD 자체 분비서열 제거에 의한 분비효율이 개선될 필요성을 보이는 것이다. GAD에 의해 전환된 GABA의 생물학적 활성은, ABTS+ 라디칼을 소거하는 항산화 활성이 약 55%로, 일반적으로 알려진 ascorbic acid (50%)보다 좀 더 향상된것으로 나타났으며, 당뇨세포주의 제1형 당뇨모델에서 28.2% 정도의 세포 생존복구율을 보였고, 또한STZ 처리에 의해 생성된 NO (일산화질소) 가스 생성을 78.7% 정도 억제하므로서 항당뇨 효과의 가능성을 보였다. 그러나 아직 분비 효율의 최적화에 의한 발현 및 분비율 증가와 분비된 효소활성 증진을 위한 개선이 필요하며 또한 산업적 응용 가능성을 확장하기 위하여 가축 및 반려동물의 항스트레스 제제인 GABA를 함유하는 사료첨가제 개발도 앞으로 중점적으로 연구해야 할 과제로 남는다.

  1. Cho, S. C., D. H. Kim, C. S. Park, J. H. Koh, Y. R. Pyun, and M. C. Kook (2012) Production of GABA-rich tomato paste by Lactobacillus sp. fermentation. Kor. J. Food & Nutr. 25: 26-31.
    CrossRef
  2. Roberts, E. and S. Frankel (1951) Glutamic acid decarboxylase in brain. J. Biol. Chem. 188: 789-795.
    CrossRef
  3. Stanton, H. C. (1963) Mode of action of gamma aminobutyric acid on the cardiovascular system. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 143: 195-204.
  4. Kim, S. H., B. H. Shin, Y. H. Kim, S. W. Nam, and S. Y, and S. Y. Jeon (2007) Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2. Biotechnol. Bioproc. Eng. 12: 707-712.
    CrossRef
  5. Wang, Q., Y. Xin, F. Zhang, Z. Feng, J. Fu, L. Luo, and Z. Yin (2011) Enhanced γ-aminobutyric acid-forming activity of recombinant glutamate decarboxylase (gadA) from E. coli. World J. Microbiol. Biotechnol. 27: 693-700.
    CrossRef
  6. Park, I. J., E. Y. Kim, W. Noh, Y. H. Oh, H. Y. Kim, B. K. Song, K. M. Cho, S. H. Hong, S. H. Lee, and J. G. Jegal (2013) Synthesis of nylon 4 from gamma-aminobutyrate (GABA) produced by recombinant Escherichia coli. Bioprocess Biosyst. Eng. 36: 885-892.
    Pubmed CrossRef
  7. Wang, Q., Y. Xin, F. Zhang, Z. Feng, J. Fu, L. Luo, and Z. Yin (2011) Enhanced γ-aminobutyric acid-forming activity of recombinant glutamate decarboxylase (gadA) from Escherichia coli. World J. Microbiol. Biotechnol. 27: 693-700.
    CrossRef
  8. Li, H., T. Qiu, G. Huang, and Y. Cao (2010) Production of gammaaminobutyric acid by Lactobacillus brevis NCL912 using fedbatch fermentation. Microb. Cell Fact. 9: 85-92.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  9. Huang, J., L-H. Mei, H. Wu, and D. Lin (2007) Biosynthesis of γ-aminobutyric acid (GABA) using immobilized whole cells of Lactobacillus brevis. World J. Microbiol. Biotechnol. 23: 865-871.
    CrossRef
  10. Ueno, H (2000) Enzymatic and structural aspects on glutamate decarboxylase. J. Mol. Catal. 10: 67-79.
    CrossRef
  11. de Biase, D., A. Tramonti, F. Bossa, and P. Visca (1999) The response to stationary-phase stress conditions in Escherichia coli: role and regulation of the glutamic acid decarboxylase system. Mol. Microbiol. 32: 1198-1211.
    Pubmed CrossRef
  12. Capitani, G., D. De Biase, C. Aurizi, H. Gut, F. Bossa, and M. G. Grutter (2003) Crystal structure and functional analysis of Escherichia coli glutamate decarboxylase. EMBO J. 22: 4027-4037.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Zhang, C., J. Lu, L. Chen, F. Lu, and Z. Lu (2014) Biosynthesis of γ-aminobutyric acid by a recombinant Bacillus subtilis strain expressing the glutamate decarboxylase gene derived from Streptococcus salivarius ssp. thermophilus Y2. Process Biochem. 49: 1851-1857.
    CrossRef
  14. Wu, Q. and N. P. Shah (2018) Restoration of GABA production machinery in Lactobacillus brevis by accessible carbohydrates, anaerobiosis and early acidification. Food Microbiol. 69: 151-158.
    Pubmed CrossRef
  15. Daniel, M. L., S. Arboleya, R. P. Ross, and C. Stanton (2017) Complete genome sequence of the gamma-aminobutyric acid-producing strain Streptococcus thermophilus APC151. Genome Announcements. 5: 205-217.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  16. Park, K. I (2007). Secretion of the Periserrula leucophryna ferritin in Bacillus subtilis and Its optimization. Master thesis, Graduate School of Daegu University.
  17. Schallmey, M., A. Singh, and O. P. Ward (2004). Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50: 1-17.
    Pubmed CrossRef
  18. Westers, L., H. Westers, and W. J. Quax (2004). Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim. Biophys. Acta. 1694: 299-310.
    Pubmed CrossRef
  19. Nijland, R and O. P. Kuipers (2008). Optimization of protein secretion by Bacillus subtilis. Recent Pat. Biotechnol. 2: 79-87.
    Pubmed CrossRef
  20. Choi, J. W (2016) Secretion of ferritin protein of Periserrula leucophryna in Bacillus subtilis and its feed efficiency. KSBB. J. 31: 105-112.
    CrossRef
  21. Li, H., T. Qiu, Y. Cao, J. Yang, and Z. Huang (2009). Pre-staining paper chromatography method for quantification of γ-aminobutyric acid. J. of Chromatography A. 1216: 5057-5060.
    Pubmed CrossRef
  22. Gazdar, A. F., W. L. Chick, H. K. Oie, H. L. Sims, D. L. King, G. C. Weir, and V. Lauris (1980) Continuous, clonal, Insulin- and somatostatin-secreting cell lines established from a transplantable rat islet cell tumor. Proc Natl Acad Sci USA. 77: 3519-3523.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  23. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed, pp. 1.25-1.28. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.
  24. de Man, J. C., M. Rogosa, and M. E. Sharpe (1960). A medium for the cultivationof Lactobacilli. J. of Applied Bacteriol. 23: 130-135.
    CrossRef
  25. Kim, S. I., J. W. Choi, and S. Y. Lee (1997) Effects of pleiotrophic mutations, degUh and spoOA, on the production of foreign proteins using the heterologous secretion system of Bacillus subtilis. Mol. Cells. 7: 158-164.
  26. Lee, M. H., J. J. Song, Y. H. Choi, S. P. Hong, E. H. Rha, K. Kim, S. G. Lee, S. C. Lee, H. Poo, Y. B. Seo, and M. H. Sung (2003) High-level expression and secretion of Bacillus pumilus lipase B26 in Bacillus subtilis chungkookjang. J. Microbiol. Biotechnol. 13: 892-896.
  27. Johansen, E. and A. Kibenich (1992) Characterization of Leuconostoc isolates from commercial mixed strain mesophilic starter cultures. J. Dairy Sci. 75: 1186-1191.
    CrossRef
  28. Sadaie, Y. and T. Kada (1983) Formation of competent Bacillus subtilis cells. J. Bacteriol. 153: 813-821.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  29. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.
    Pubmed CrossRef
  30. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
    CrossRef
  31. Kwon, S. Y., K. Whang, and S. P. Lee (2017). Anti-inflammatory effects and GABA production of old antler and Auricularia auricula-judae extract fermented by Lactobacillus plantarum. Kor. J. Food Preserv. 24: 274-281.
    CrossRef
  32. Sang, V. T., L. P. Uyen, and N. D. Hung (2018). The increased gamma-aminobutyric acid content by optimizing fermentation conditions of bacteria from kimchi and investigation of its biological activities. Eurasia J. Biosci. 12: 369-376.
  33. Turk, J., J. A. Corbett, S. Lamanadham, A. Bohrer, and M. L. Mcdaniel (1993) Biochemical evidence for nitric oxide formation from streptozotocin in isolated pancreatic islets. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197: 1458-1464.
    Pubmed CrossRef
  34. Jung, G. D., J. Y. Yang, E. S. Song, and J. W. Park (2001) Stimulation of melanogenesis by glycyrrhizin in B16 melanoma cells. Exp. Mol. Med. 33: 131-135.
    Pubmed CrossRef
  35. Xie, Q. W., H. J. Cho, R. A. Mumford, K. M. Seiderek, T. D. Lee, and A. Ding (1992) Cloning and characterization of inducible nitric oxide synthase from mouse macrophages. Science. 256: 225-228.
    Pubmed CrossRef
  36. Ignarro, L. J., G. M. Buga, K. S. Wood, R. E. Byrns, and G. Chaushury (1987) Endothelium derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 9265-9269.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  37. Lin, Q., S. Yang, F. Lu, Z. Lu, X. Bie, Y. Jiao, and X. Z. (2009) Cloning and expression of glutamate decarboxylase from Streptococcus thermophilus Y2. J. Gen. Appl. Microbiol. 55: 305-310.
    Pubmed CrossRef
  38. Jeong, S. and J. W. Choi (2017) The secretional optimization of oligopeptide with His-Pro repeats in Bacillus subtilis and its antidiabetic effects. KSBB. J. 32: 71-82.
    CrossRef
  39. Kim, E. J and J. H. Lee(2014) Effects and optimization of gammaamino butyric acid (GABA) Production process using glutamate decarboxylase (GAD). KSBB. J. 29: 426-431.
    CrossRef
  40. Zhao, A., X. Hu, Y. Li, C. Chen, and X. Wang (2016) Extracellular expression of glutamate decarboxylase B in Escherichia coli to improve gamma-aminobutyric acid production. AMB Expr. 6: 55-67.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  41. Wang, Q., Y. Xin, F. Zhang, Z. Feng, J. Fu, L. Luo, and Z. Yin (2011). Enhanced gamma-aminobutyric acid-forming activity of recombinant glutamate decarboxylase (gadA) from Escherichia coli. World J. Microbiol. Biotechnol. 27: 693-700.
    CrossRef
  42. Espes, D., H. Liljeback, H. Hill, A. Elksnis, J. C. Corbaian, and P. O. Carlson (2021). GABA induces a hormonal counterregulatory response in subjects with long standing type I diabetes. BMJ Open Diab. Res. Care. 9: 1-5.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  43. Korol, S. V., Z. Jin, Y. Yang, A. K. Bhandage, A. Tengholm, N. R. Gandasi, S. Barg, D. Espes, P. O. Carlsson, D. Laver, and B. Birnir (2018). Functional characterization of native high affinity GABAA receptors in human pancreativ β cells. EBioMedicine. 30: 273-282.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  44. Vanaja, P. and A. R. Jayakumar (2000). A role of nitric oxide as an inhibitor of γ -aminobutyric aid transaminase in rat brain. Brain Res. Bull. 51: 43-46.
    CrossRef
  45. Turk, J., J. A. Corbett, S. Lamanadham, A. Bohrer, and M. L. Mcdaniel (1993). Biochemical evidence for nitric oxide formation from streptozotocin in isolated pancreatic islets. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197: 1458-1464.
    Pubmed CrossRef
  46. Kaneto, H., J. Fuji, H. G. Seo, K. Suzuki, T. Matsoka, M. Nakamura, H. Tatsumi, Y. Yamamsaki, T. Kamada, and N. Taniguchi (1995). Apoptotic cell death triggered by nitric oxide in pancreatic cells. Diabetes. 44: 733-738.
    Pubmed CrossRef
  47. Pitocco,D., F. Zaccardi, E. D. Stasio, F. Romitelli, S. A. Santini, C. Zuppi, and G. Ghirlanda (2010). Oxidative stress, nitric oxide, and diabetes. Rev Diabet Stud. 7: 15-25
    Pubmed KoreaMed CrossRef