Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 2022; 37(3): 112-122
Published online September 30, 2022 https://doi.org/10.7841/ksbbj.2022.37.3.112
Copyright © Korean Society for Biotechnology and Bioengineering.
Minsoo Kim1 and Jang Won Choi2*
1Division of Applied Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea
2Department of Bioindustry, Daegu University, Gyeongsan 38453, Korea
Correspondence to:Tel: +82-53-851-6756, Fax: +82-53-850-6939
E-mail: chjawo@daegu.ac.kr
Gamma-aminobutyric acid (GABA) can be converted from monosodium glutamate (MSG) by glutamate decarboxylase (GAD). GABA is known to be a four-carbon non-protein amino acid existing in the human brain and eye. Recent studies have shown that GABA is effective in accelerating hypotension and anxiety relief, along with acting as a diuretic, antidiabetic, and antidepressant in humans and other mammals. Since the low activity of cell preparations has been a major limitation to commercial enzyme synthesis, it is worthwhile to look for methods to obtain a affordable recombinant enzyme with high GABA synthesizing activity. In order to maximize production of GABA using the culture broth without purification in Bacillus subtilis, the gene (gadB) first was obtained from chromosome of Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) expressing the GAD with appropriate amount. The primer set with restriction enzyme sites and His-tag was designed by referring to the DNA sequence of glutamate decarboxylase enrolled in GenBank (DQ871217.2), amplified and cloned into pGemTeasy vector. The right clone was screened and characterized by DNA sequencung analysis. As a result, the DNA sequence was different from that of GenBank in codons encoding 4 amino acids (Tyr189, Gly282, Ser301, and Met425) by point mutations, which were changedto Cys189, Asp282, Gly301, and Thr425, respectively. To secret the GAD in culture medium, the recombinant vector (pRBASGadB, 7.83 kb) containing the gadB gene was constructed using pRBAS secretion vector with alkaline protease promoter (aprE-P, 0.45 kb) and signal sequence (aprS, 87 bp) and then transferred into Bacillus subtilis LKS87. The secretion levels of GAD were analyzed by SDS-PAGE and western-blot and the level in B. subtilis LKS87 harboring the pRBAS-GadB vector was increased to approximately 10-12% of total secreted proteins. The conversion of MSG (monosodiumglutamate) to GABA was measured by paper chromatography using the culture broth and PBS-eluted cell pellet. As a result, the culture broth shows 16% GABA conversion rate from MSG, whereas the pellet shows higher conversion (~43%), indicating that the expressed GAD was not sufficiently secreting into the culture broth caused by the inefficient processing of aprS signal sequence or presence of self signal sequence of the GAD gene. By measuring the ABTS+ scavenging ability, it was confirmed that the GABA converted by GAD showed higher antioxidant activity (55%) than that (50%) of ascorbic acid used as positive control. The survival recovery rate of STZ-treated RINm5F cells was increased to 28.2% by the GABA treatment and also, production of nitric oxide (NO) was drastically reduced with 78.7% in STZ-treated RINm5F cells, suggesting that the GABA possess antidiabetic and antioxidant activities. Finally, although GABA is showing various biological activities, it might be needed to optimize secretion efficiency for industrial applications.
Keywords: antidiabetic activity, gamma-aminobutyric acid (GABA), glutamate decarboxylase, secretion, Streptococcus thermophilus
현대인들의 불규칙적이고 부적절한 식습관과 환경오염 문제, 생활수준의 급속적인 발전 및 스트레스 증가 등의 문제들로 인해 다양한 기능성 성분에 대한 관심의 증가로 건강 보조 식품이 활발하게 소비되고 있다. GABA (γ-amino butyric acid)는 아세틸콜린이라 불리는 신경전달 물질 증가, 뇌기능촉진 등의 생리작용뿐만 아니라, 혈압과 맥박 조절, 항산화작용, 이뇨작용, 성장호르몬 분비 조절, 통증과 불안 완화에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [1]. GABA는 인간의 뇌와 눈에서 풍부하게 발현되는 4탄소 비단백질 아미노산이며, 동물에서 고혈압과 이뇨 작용을 하는 주요 억제성 신경전달물질로서 작용한다. 또한 GABA는 식품 및 의약품의 생리활성 성분의 잠재력으로 인해 이완을 촉진하고 신경 긴장을 완화하는 기능성 식품의 성분으로 활용되었으며 [2-4]. 최근연구에 따르면 GABA는 췌장에서 인슐린의 강력한 분비 촉진제이기도 하여 당뇨병을 효과적으로 예방한다고 보고되었다 [5]. 화학적으로 합성된 GABA를 식품에 직접 적용하는 것은 잠재적으로 해로울 수 있기 때문에 생물학적으로 생산된 GABA의 대량 생산에 의해 식품 적용에 대하여 많은 관심을 받았다 [6]. 생물학적활성을 갖는 GABA는 세 가지 독립적인 과정에 의해 생산될 수 있다. 첫 번째는 고유한 또는 재조합 주입 GABA 합성 경로를 보유하는 미생물의 발효에 의해 포도당과 같은 재생 가능한 탄소원에서 GABA를 직접 합성하는 것이다. 그러나 이 전략으로는 GABA의 높은 수준의 생산이 성공하지 못했다. 둘째, 정제된 monosodium glutamate (MSG) 또는 glutamic acid를 GABA로 효소적 전환에 사용할 수 있다 [7]. Glutamate decarboxylase (GAD)를 사용하여 MSG로부터 GABA의 효소적 합성은 GABA의 높은 전환 수율 및 반응 완충액에서 GABA의 낮은 오염과 같은 몇 가지 이점이 있다. 셋째, GAD대신 MSG를 GABA로 전환할 수 있는 천연 및 재조합 미생물을 MSG를 출발 물질로 사용하여 GABA 생산을 위한 생체 촉매로 사용할 수 있다. 또한 최근 연구에 따르면 GABA는 일부 유산균(LAB)에 의해L-glutamate로부터 효율적으로 생성될 수 있다고 보고되었다 [8,9]. GAD는 PLP (pyridoxal 5’ -phosphate) 의존성 효소로 L-glutamate의 GABA로의 비가역적인 α-탈탄산 반응을 촉매하며 원핵 및 진핵생물에 널리 분포되어 있다 [10]. 대장균 염색체는 GAD의 두 가지 생화학적으로 동일한 형태인
따라서 본 연구에서는 GABA 원료를 충분히 확보하고 분비시스템을 통한 정제과정의 단순화를 위하여 우선적으로S. thermophilus 균주에서
제한효소는 TAKARA (Shiga, Japan) 및 Elpisbio (Daejeon, Korea)로부터, T4 DNA ligase는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, USA), EmeraldAmp® GT PCR Master Mix는 TAKARA (Shiga, Japan)로부터, oligomer는 Genotech (Daegeon, Korea)사로부터 합성하여 사용하였다. Tryptone, yeast extract, 및 Bacto-agar와 같은 배지 성분은 Merck (Lutterworth, Germany)사로부터 구입하였고, Pyridoxa 5′-phosphate (PLP) monohydrate는 TCI (Tokyo, Japan)로부터, L-Glutamic acid monosodium(MSG)와 γ-aminobutyric acid (GABA standard)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터, Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), membrane Immobilon-PPVDF는 Millipore (Bedford, MA, USA), Wizprep agarose gel purification kit는 Wizbiosolutions (Locohills, NM, USA), pGEM Teasy cloning kit는 Promega (Madison, Wisconsin, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 1차 및 2차 항체는 Genscript (New Jersey, USA) 및 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사로부터 구입하였으며, 나머지 시약들은 분석용 수준급을 사용하였다.
PCR 산물의 클로닝에 의한 plasmid 증폭 및 형질전환을 위한 기본 숙주로
유산균의 glutamate decarboxylase유전자 (
최종적으로 확인된 pRBAS-GadB (7.83 kb) 재조합 vector는 SPMM-I (Spizizen's minimal medium)과 SPMM-II 배지를 사용하는 Sadaie and Kada [28] 방법에 의해 고초균 (
GABA 및 MSG의 정성 분석을 위해 3M paper를 10 × 15 cm의 크기로 잘라서 사용하였고, GABA 함량과 MSG 잔존량 비교를 위한 standard로 L-Glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 50 mg/ml와 GABA standard (100 mg/ml)를 사용하였다. 전개 용매는 L-butanol : acetic acid : distilled water를 4:1:2 (v/v) 의 비율로 혼합하여 사용하였다. GAD 분비 고초균을 100 ml MRS 배지에 접종 후, 30°C incubator에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리에 의해 배양액과 pellet을 수거하고, cell pellet은 washing 후 PBS를 포함하는 lysis buffer로 파쇄 후 상층액을 취하고 L-glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 150 mg/mL)와 pyridoxal 5′-phosphate (PLP) monohydrate (0.15 mM)를 넣고 pH가 4.0-5.0이 되도록 맞춰준 후, 37°C incubator (80 rpm)에서 24시간동안 교반하였다. 발효액과 standard 용액을 3 MM paper의 아래 부분에서 1 cm 정도 되는 위치에 2 μL를 점적하였고 (3 반복), 간격은 10-15 mm를 유지하였다. 점적 후 paper의 sample을 건조한 다음 전개하였고, 전개가 끝난 paper는 감압건조기에서 건조한 다음 발색 시약인 ninhydrin 용액 (0.1-0.5%)을 뿌리고, 90-100°C 건조기에서 5-10분 동안 발색 시켜 발효액과 standard의 MSG로부터 전환된 GABA spot을 확인하였다 [21].
ABTS+ [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)는 과황산칼륨 (potassium persulfate)에 의해 전자를 손실하여 짙은 청녹색을 나타내지만, 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 색이 옅어지는 과정을 통하여 항산화능을 측정하는 원리이다. ABTS+ radical 소거활성 측정 [31, 32]은 최종 농도 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate stock을 혼합하여 실온하에서 암 반응이 완료되고 흡광도가 안정될 때까지 4-16 시간 동안 반응하여 ABTS+를 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.05이 되게 하였다. 희석된 시료20 μL를 반응 용액 180 μL에 넣어 1분 동안 반응한 뒤 흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 소거 활성(ABTS+)은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50%로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC50 값으로 나타냈으며 이때, 상대 활성의 비교를 위해 ascorbic acid를 대조군으로 사용하였으며, 항산화 효과는 ABTS scavenging effect = [(ODcontrol − ODsample)/ODcontrol] × 100% 수식을 사용하여 농도에 따른 흡광도 감소를 측정하여 계산하였다.
Insulinoma 세포주로서 RINm5F세포 [22]는 쥐 췌장 세포종에서 유래되었고 American type culture collection (ATCC, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포배지는 fetal calf serum(10%), penicillin (100 unit/mL), streptomycin (100 μg/mL)을 첨가한 RPMI-1640을 사용하였고 96 well plate 및 petri dish에서 배양하였다. 세포수를 측정하기 위하여 trypsin EDTA를 넣고 37°C에서 20분간 배양한 다음, scratch로 세포를 떼어내고 3,000 rpm에서 원심분리 한 후 상등액을 제거한 후, 신선한 배지를 넣고 현탁하여 hemocytometer (Thermo fisher scientific, Inc. Waltham, MA USA)를 이용하여 세포수를 측정하고 실험에 맞게 세포수를 조절하여 분획 후 사용하였다. 항당뇨효과는 streptozotocin (STZ)을 처리하여 type I 당뇨를 유발시키고, 세포증식 및 viability측정에 의해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)가 formazan으로 환원되는 것을 이용한 MTT assay를 통해 세포의 생존복구율을 측정하였다 [33,34]. 즉, 배양된 당뇨세포주 (RINm5F cell)를 96 well plate에 2 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양한 후 대조군을 제외하고 각 well에 STZ (2 mM)를 처리하고 30분간 방치하였으며, STZ가 포함된 배지를 제거해준 다음, 각 well에 대조군과 함께 시료(농도별)를 포함하는 새로운 RPMI-1640을 넣고 24시간동안 배양하였다. 배양한 세포에 1 × PBS에 녹인 MTT (5 mg/mL) 용액 50 μL를 각 well에 넣고, 5% CO2 incubator에서 4시간 동안 반응시킨다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고, 각 well마다 100 μL의 DMSO를 첨가하여 microplate reader를 사용하여 생성된 formazan crystal을 흡광도 570 nm에서 측정하였다. 세포 생존율은 시료를 처리하지 않고 무처리군 (세포만 배양)의 생존율 100%를 기준으로 세포생존율 (cell viability, %)을 상대적으로 계산하였다.
Nitric oxide (NO)의 농도는 Griess Reagent System을 이용한 마이크로 분석 방법에 의해 배양액 내의 nitrite 농도를 측정하였다 [35]. RINm5F 세포를 2 × 104 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주 후 하루 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하고, STZ (2 mM) 처리 후 30분 동안 37°C에서 두었다가 배지를 제거하였다. 그 다음, 대조군과 함께 시료를 농도별로 처리한 후, 하루동안 37°C에서 배양한 다음 배양 상등액 100 μL를 취하여 새로운 96 well plate에 넣고 여기에 같은 양의 Griess 시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphtyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)을 첨가하여 10분동안 실온에서 반응 후, 540 nm에서 microplate reader를 사용하여 측정하였고, 산화질소 함량은 아질산나트륨을 표준으로 비교하여 측정하였다 [36].
결과는 통계적 유의성에 대한 사회 과학 (SPSS) 프로그램의 통계 패키지를 이용하여 분산 (ANOVA) 시험의 한 경로로 분석하였다. 모든 데이터는 평균 ±표준 편차 값으로 표현된다. 모든 분석에서 0.05보다 작은 P값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
기존의 알려져 있는
대장균에서 glutamate decarboxylase 유전자들의 발현은 단백질 생성과 함께 굴절체 (inclusion body)를 형성하므로 효소 활성을 위해 굴절체 회수, 변성, air oxidation, 및 chromatography 과정을 통하여 정제한 다음 사용하므로 시간과 노동력, 정제비용이 많이 소모되므로 산업적 응용에는 적합하지 않다. 따라서 배양액에 직접 효소를 분비하여 직접적으로 glutamate를 GABA로 전환시키는 것이 효소 생산 및 전환수율 향상에 효율적이라 판단하여 고초균에서 분비능이 확인된 pRBAS 분비벡터 [20,38]에
재조합 분비벡터 (pRBAS-GadB, 7.83 kb)는 Sadaie and Kada[28] 방법에 의해 고초균으로 도입되었으며, kanamycin(50 μg/mL)을 첨가한 LB 고체배지에서 형질전환체를 선별한 후, plasmid를 분리하여 PCR에 의해 도입되어진
배양액에 분비된 GAD 효소의 glutamate 기질에 대한 GABA 전환을 측정하기 위하여 paper chromatography (Fig. 4)를 수행하여 확인하였다. 재조합 분비벡터의 promoter는 유도발현이 아닌 일정한 수준으로 발현 분비 (constitutive expression)되므로 단백질 분비가 확인된 형질전환체를 사용하여 LB 배지에서 24시간 배양한 다음, 배양액과 cell pellet을 수거하여 GABA 생성을 분석하였다. 컨트롤로 GABA 함량과 MSG 잔존량 비교를 위하여 GABA standard (100mg/mL) 및 L-Glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 50 mg/mL)를 사용하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 배양액의 경우 기질로 사용한 MSG를 약 16% 정도 GABA로 전환시켰으며, cell pellet을 파쇄하여 PBS buffer로 용출하여 분석하였을 때는 약 43% 정도의 GABA 전환을 보였다. 이와 같은 결과는 다른 단백질에서 100% 거의 분비 효율성이 확인된 신호서열 (
ABTS+ radical [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS+]은 상당히 안정하며 산화촉진제를 필요로 하지 않고 유기상 및 수용상에서 항산화활성을 모두 적용할 수가 있는 가능한 측정 방법이다. 또한 과황산칼륨 (potassium persulfate)에 의해 전자를 손실해 짙은 청녹색을 띄지만, 항산화 물질의 전자공여능으로 색이 옅어지는 과정을 통해 항산화능을 측정하는 방법이다 [31,32]. Fig. 5에서 보는 바와 같이 GAD 생성 배양액으로 부터 형성된 GABA (1, 317 μg/mL) 생성물과 positive control로 사용한 ascorbic acid (20 μg/mL) 시료를 각각 20 μL씩 사용하여 3반복에 의해 ABTS+ 라디칼소거 활성을 측정한 결과, GABA 시료의 경우 55%, ascorbic acid의 경우 50%로 나타났다. 수치상으로 보면 GABA의 항산화활성이 높아 보이지만 최종적으로 사용한 GABA농도의 경우 26.3 μg이고, ascorbic acid의 경우 0.4 μg이므로 항산화활성의 효율적인 면에서는 ascorbic acid보다 떨어지나 항산화활성은 확인되었다고 보여지며 또한 GAD활성 촉진을 위한 효소 cofactor인 PLP농도별 투여에 의한 GABA 생성의 질적인 향상 [41] 및 생성 GABA 용액의 부분 정제 필요성이 있다고 판단된다.
당뇨세포주인 insulinoma RINm5F [22]에 STZ (streptozotocin)을 처리하여 type I 당뇨 모델을 유발하고, negative control로서 MSG (Monosodium Glutamate) 및 positive control로서 GABA standard를 대조군으로 하여 GAD에 의해 전환된 GABA를 부분 정제후 처리하여 생존 복구율을 측정하였다. 즉, RINm5F cells을 96 well plate에 분주하여 (2 × 104 cells/mL) 하루 배양하고, 세포들이 50%정도 사멸되는 농도로 STZ(2 mM)을 30분간 처리하여 세척후, 농도별로 시료를 처리하여 배양한 다음 MTT assay에 의해 세포들의 생존복구율을 측정하였다. 즉, 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 수용성 기질 (노란색) MTT가 불용성 기질 (보라색) formazan으로 환원되는 매커니즘을 이용한 방법인 MTT assay는 생성된 formazan의 흡광도는 대사가 왕성하거나 살아있는 세포의 농도를 반영한다. Fig. 6에서 보는바와 같이, STZ와 시료를 처리하지 않은 무처리군의 생존율을 100%로 기준을 잡고 처리군들의 세포 생존률을 상대적으로 계산한 결과 negative control로 사용한 MSG의 경우 거의 생존률이 복구되질 않았지만, positive control로 사용한 GABA standard의 경우 20 μL (100 μg) 이상의 농도로 처리하였을때 34.4% 정도의 세포 생존율이 복구 되었으며, 거의 같은농도로 처리한 부분정제한 GABA (by GAD from
Nitric oxide (NO)는 glutamate의 뇌세포내 농도 및 glutamic acid decarboxylase, transaminase의 활성에 큰 영향을 주는 것으로 보고되었다 [44]. 췌장 베타세포에서 미토콘드리아의 오작동과 염색체 DNA의 손상을 초래하며, STZ로 인한 당뇨병의 요인들은 알킬화 (alkylation)와는 관련이 없지만 NO donor로 잠재적인 역할을 한다고 알려져 있고 또한 세포에서 세포자살 (apoptosis)를 일으키는 것으로 알려져 있다 [45, 46]. 재료 및 방법에서 기술한 방법에 의해 실험을 수행한 결과 negative control로 사용한 MSG의 경우 NO 생성이 억제되질 않았지만, positive control로 사용한 GABA standard의 경우 30 μL (150 μg) 농도로 처리하였을때 STZ만 처리 하였을 때보다 71.7% 정도의 NO 생성이 억제되었으며, 거의 같은농도로 처리한 부분정제한 GABA (by GAD from
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