최근 전 세계적으로 건강과 아름다움에 대한 관심이 높아지면서, 천연물에서 추출한 영양, 식품 및 화장품에 대한 수요가 지속적으로 성장하고 있으며 먹는 화장품 및 식품 분야에서 다양하게 활용되고 있다 [1]. 동백나무 (Camellia japonica)는 동백나무과 (Theaceae) 동백속 (Camellia)에 속하는 상록교목으로, 남해안과 섬에 주로 분포하며 온화한 기후인 전남지역이 전국 식재 면적의 67%를 차지하고있다 [2]. 동백나무에 관하여 다양한 연구가 보고되었는데, 약리학적 효과로는 혈전용해, 지열, 소염 등의 효과가 있다고 보고되었다 [3]. 이러한 약리학적 효과를 보이는 카멜린 (camellin), 오이게놀 (eugenol), 플라보노이드 (flavonoid), 페닐프로파노이드 (phenylpropanoid), 피페콜산 (pipecolic acid), 트리테르페노이드 (triterpenoids), 스테로이드 (steroid), 탄닌 (tannin), 벤저노이드 (benzenoid) 등 많은 화합물이 보고되었다 [4]. 또한 최근 연구에서는 동백나무의 다양한 부위에서 연구가 활발히 진행되었는데, 잎에서 분리된 새로운 화합물인 camellianoside와 함께 rutin, hyperoside, isoquercitrin을 분리하여 각각의 항산화 활성이 보고되었다 [5]. 또한 동백나무 줄기에서 10종의 triterpenoid 화합물을 분리하여 세포독성 효과를 보고하였으며 [6], 또 다른 연구에서는 동백 꽃봉오리 추출물이 지혈제로 사용되며 분리한 화합물 중 camellioside A, B, C, D는 위를 보호하는 효과가 있다고 보고 되었다 [7]. 이와 같이 다양한 생리활성 물질들이 동백나무에서 발견되었고, 다양한 성분들의 효능을 증가시키고 추출하기 위해 여러 방법이 다양한 추출 방법 및 열처리 기술이 사용되고 있다.

덖음 공정은 찻잎, 곡식, 약재 등을 첨가물 없이 볶아서 익히는 것으로 나무 생잎의 수분, 풋내, 쓴맛과 같은 불필요한 향미를 감소시켜 새로운 향미와 맛을 부여한다고 알려져 있다 [8]. 기존의 연구에서 동백나무 잎을 덖음 처리했을 때 폴리페놀 (polyphenol) 화합물이 다른 화합물로 열분해되면서 polyphenol의 함량이 증가하고, tannin의 함량이 감소하여 쓴맛이 감소하고 풍미는 증가하였다 [4]. 다양한 열처리 공정 중 덖음 처리는 마이아르 (maillard)반응을 통해 특별한 향과 색감, 그리고 항산화 물질을 생성하여 높은 항산화 활성을 가진다는 연구 결과가 있다 [9]. 기존의 연구에서 Kim 등은 무처리군과 덖음 (3, 5, 7분) 무말랭이 차의 항산화 활성을 비교하였는데 덖음 시간이 늘어날수록 높은 활성이 나타남을 보고하였다 [8]. 또한 추출 용매를 달리한 동백나무 덖음 잎에 대해 70% EtOH 추출물이 항산화 및 피부질환 유발균에 비교적 높은 활성을 가진다고 보고하였다 [10]. 동백 겨우살이에서 추출한 메탄올과 에탄올 추출물이 라이페이스 (lipase)와 알파-글루코시데이스 (α-glucosidase)를 억제하는 활성을 보여, 항비만 효과가 있다는 연구 결과가 보고되었다 [11]. 그러나 현재 다양한 열처리 공정 방식에 따른 동백나무 잎 추출물의 항산화 및 항비만 등의 생리활성 연구는 전무한 상태이며, 특히 열을 가했을 때 유효성분 함량 변화에 대한 연구는 이뤄지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 동백나무 잎에 대해 열처리하지 않은 추출물과 열처리를 거친 추출물의 항산화 및 항비만 활성을 비교하고 HPLC 및 LC-MS/MS 분석을 통해 다양한 유효성분의 함량 변화를 검증함으로써, 동백나무 잎의 기능성 화장품 및 식품 소재로의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.

2.1. 동백나무 잎 추출물 제조

본 연구에 사용된 동백 나무 잎은 전라남도 완도 수목원에서 채취하였으며 세척 후 3일동안 서늘한 곳에서 건조하여 사용하였다. 동백나무 잎 추출물의 활성을 확인하기 위해 생잎 건조 추출물 (CJL), 잎 찜 추출물 (CJLH1), 덖음 1차 추출물 (CJLH2), 덖음 2차 추출물 (CJLH3), 대용량 덖음 잎 추출물 (CJLH4) 로 제조하여 실험을 진행하였다. 건조된 동백 나무잎을 분쇄하여 생잎 건조 분말로 사용하였다. 채취한 동백나무 잎을 autoclave를 이용하여 100°C, 0.06 MPa에서 60분 동안 찐 후 3일동안 서늘한 곳에서 건조 및 분쇄 후 잎 찜 분말로 사용하였다. 동백 나무 잎 찜을 frying pan을 이용하여 240°C에서 5분간 덖는 과정을 1회, 2회로 진행한 후 분쇄하여 1차 및 덖음 2차 분말로 사용하였다. 대용량 덖음 잎은 전라남도 산림자원연구소에서 제공받았다. 동백 나무 잎을 세척 및 세절하여 30°C에서 3일동안 건조한 후 299°C에서 10분간 덖어주었다. 그 후, 건조 및 분쇄하여 대용량 덖음 잎 분말로 사용하였다. 제조된 각 분말 50 g을 증류수 300 mL에 첨가한 후 autoclave를 이용하여 100°C, 0.06 MPa에서 10분 동안 추출하였다. 각 추출물은 여과지 (Whatman filter paper 0.45 μM)를 이용하여 여과한 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다. 수득률은 다음 식으로 구해졌다.

2.2. 항산화 활성

2.2.1. DPPH free radical 소거능 측정

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 비교적 안정한 free radical로 항산화 작용을 하는 물질과 만나게 되면 전자를 내어주면서 환원이 일어나게 된다. 이 과정에서 보라색을 띠는 DPPH 시약이 노란색으로 변하게 되는데 육안으로 확인할 수 있고 측정 방법이 간단하다. DPPH radical 소거능은 Blois의 방법을 참고하여 측정하였다 [12]. 동백나무 잎 추출물(CJL, CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4)을 50-200 μg/mL 농도로 제조한 후 각 농도 별 시료 200 μL와 0.25 mM DPPH 시약 800 μL를 혼합하였다. 암실에서 15분 동안 반응시킨 후, UVVIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 소거능은 다음 식으로 구해졌다.

Figure 1. Isolation diagram of Camellia japonica leaves extracts with different heat treatments. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4).

2.2.2. ABTS radical 소거능 측정

ABTS는 그 자체로는 radical을 띄지 않고 산화되어 ABTS radical을 만든다. ABTS radical이 항산화 작용을 하는 물질과 만나게 되면 radical이 소멸되면서 짙은 청록색에서 투명한 색이 되는데 DPPH와 마찬가지로 측정 방법이 간단하여 널리 이용된다. ABTS radical 소거능은 Lee의 방법을 참고하여 측정하였다 [13]. ABTS radical을 형성하기 위해 7 mM ABTS 농도로 제조한 시약과 2 mM potassium peroxodisulfate 농도로 제조한 시약을 1 : 1 비율로 혼합 후 17시간 동안 암실에서 반응하였다. 이후 ABTS 시약을 PBS (pH 7.4)를 이용하여 4배 희석한 ABTS 시약을 사용하였다. 동백나무 잎 추출물(CJL, CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4)을 50-500 μg/mL 농도로 제조한 후 각 농도 별 시료 200 μL와 ABTS 시약 1000 μL를 혼합하였다. 암실에서 15분 동안 반응시킨 후, UV-VIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 730 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 소거능은 다음 식으로 구해졌다.

2.2.3. Nitrite 소거능 측정

본 실험은 nitrite (NO₂^-)가 griess 시약인 sulfanilamide 와 N-1-naphylethylenediamine dihydrochloride가 반응하게 되면 보라색을 띤 아조 화합물이 형성된다. Nitrite 소거능 측정은 Kato의 방법을 참고하여 측정하였다 [14]. 동백나무 잎 추출물(CJL, CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4)을 50-250 μg/mL 농도로 제조하였다. 각 농도 별 시료 200 μL와 1 mM NaNO2, 0.1 M HCl를 순서대로 혼합한 후 water bath를 이용하여 37°C에서 1시간동안 반응시켰다. 이후 반응액 500 μL, 2% acetic acid 1.5 mL, griess reagent 500 μL를 혼합하여 15분동안 상온에서 반응시킨 후 UV-VIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 소거능은 다음 식으로 구해졌다.

2.2.4. Ferrous metal ions (Fe²⁺) 킬레이팅 측정

Fe²⁺는 ROS의 산화적 손상을 주는 금속 이온 중 하나로 킬레이트제 ferrozine과 반응하게 되면 Fe-(Ferrozine₃^4-)를 형성하게 되고 Fe²⁺와 같은 금속의 반응성을 감소시켜 비활성 상태로 만든다 [15]. Ferrous metal ions 킬레이팅 측정은 Pellegrini의 방법을 참고하여 측정하였다 [16]. 동백나무 잎 추출물 (CJL, CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4)을 5 mg/mL 농도로 제조한 후 제조된 시료 400 μL, 2 mM FeCl₂ 50 μL, 5 mM Ferrozine 200 μL, EtOH 3.35 mL를 순서대로 혼합하였다. 상온에서 10분 동안 반응시킨 후 UV-VIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.3. 총 폴리페놀 함량 측정

Polyphenol은 다양한 화학 구조의 2차 식물 대사산물로써 페놀(phenol) group에 치환된 2개 이상의 하이드록실기(-OH)가 다른 화합물과 쉽게 결합하여 항산화, 항염 및 항암 등 생리활성에 효과를 보인다 [17]. 총 폴리페놀 함량(Total polyphenol content, TPC)은 Folin-Ciocalteu 방법을 참고하여 측정하였다 [18]. 추출물의 농도는 1 mg/mL로 제조한 후 제조된 시료 500 μL, 0.2 M Folin-Ciocaltue’s phenol 시약 500 μL, 2% sodium carbonate (w/v)를 순서대로 혼합하였다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 UV-VIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별로 희석한 gallic acid와 tannic acid를 표준물질로 사용하여 검량 곡선을 작성한 후 gallic acid equivalent (GAE) mg/g와 tannic acid equivalent (TAE) mg/g을 검량 곡선을 이용하여 환산하였다.

2.4. 총 플라보노이드 함량 측정

Polyphenol의 일종인 flavonoid는 아글리콘 (aglycone)과 당 (sugar)이 결합되어 있는 배당체 (glycoside)로 항산화, 항균 및 항염증 등 생리 활성에 효과를 보인다 [19]. 총 플라보노이드 함량 (Total flavonoid content, TFC)은 Jo 의 방법을 참고하여 측정하였다[20]. 추출물의 농도는 1 mg/mL로 제조한 후 제조된 시료 500 μL, methanol 1.5 mL, 1 M potassium acetate 100 μL, 증류수 1.4 mL를 순서대로 혼합하였다. 상온에서 40분 동안 반응시킨 후 UV-VIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별로 희석한 quercetin과 rutin을 표준물질로 사용하여 검량 곡선을 작성한 후 quercetin equivalent (QUE) mg/g와 rutin equivalent (RE) mg/g을 환산하였다.

2.5. 효소 활성 저해

2.5.1. α-Glucosidase 활성 저해 측정

탄수화물을 섭취하게 되면 소화 과정에서 다당류가 알파-아밀레이스 (α-amylase)에 의해 분해되고, α-glucosidase는 이를 단당류 (monosaccharide)로 분해하여 혈당을 증가시키는데, 이를 억제하는 것은 지방 축적을 막는데 효과를 보인다 [21]. α-Glucosidase 저해능은 Eom의 방법을 참고하여 측정하였다 [22]. 각 추출물의 농도는 10-150 μg/mL 농도로 제조한 후 각 농도 별 시료 100 μL와 1 unit/mL α-glucosidase 25 μL를 혼합한 후 water bath를 이용하여 37°C에서 10분동안 반응시켰다. 이후 5 mM ρ-nitrophenyl α-D-glucopyranoside 50 μL를 혼합하여 37°C에서 10분동안 반응시킨 후, UV-VIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.5.2. Lipase 활성 저해 측정

Lipase는 지방세포 내 중성지방 (triglyceride, TG)을 글리세롤 (glycerol)과 지방산 (fatty acid)으로 가수분해하는 효소로서 이를 억제하면 지방의 소화와 흡수가 줄어들어 비만 및 당뇨에 효과를 보인다 [23]. Lipase 저해능은 Kim의 방법을 참고하여 측정하였다 [24]. Pancreatic lipase 1.5 mg에 100 mM Tris-HCl/5 mM CaCl2 (pH 6.8) 1 mL를 혼합하여 enzyme buffer를 제조하였다. 각 추출물의 농도는 5 -20 mg/mL 농도로 제조한 후 각 농도 별 시료 100 μL와 enzyme buffer 100 μL를 혼합한 후 37°C에서 15분동안 반응시켰다. 이후 10 mM p-NPB 50 μL를 혼합하여 37°C에서 30분동안 반응시킨 후, UV-VIS Spectrophotometer (UV-1240, Shimadzu, Japan)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.6. HPLC를 이용한 유효 성분 함량 분석

본 실험은 동백나무 생잎과 열을 가하는 조건을 다르게 했을 때의 동백나무 잎 추출물의 유효 성분을 정량분석을 하기 위하여 HPLC (SPD-20A, SHIMADZU CO., Japan)를 이용하여 분석을 진행하였다. 표준물질을 100-1000 μg/mL 농도로 제조한 후 검량 곡선을 작성하여 당량을 환산하였고 추출물은 1,000 μg/mL 농도로 제조하였다. 0.45 μm syringe filter로 여과한 20 μL의 시료를 C18 column (Shimpack GIS-ODS, 4.6 × 250 mm, 5.0 μm, Shimadzu Co., Japan)을 사용하여 280 nm 파장에서 1.0 mL/min 유속으로 분석하였다. 이동상으로는 water (0.1% phosphoric acid) (A), acetonitrile (B)를 사용하였고, 이동상(B)를 기준으로 0-10 min : B (8-8%), 10-14 min : B (8-16%), 14-20 min : B (16-16%), 20-25 min : B (16-19%), 25-30 min : B (19-22%), 30-40 min : B (22-100%), 40-45 min : B (100-100%)로 분석하였다. Polyphenol 표준물질 로 gallic acid, catechin, (-)-epicatechin, rutin, tannic acid, quercetin, kaempferol, 4-hydroxybenzoic acid를 사용하였고, 비타민(vitamin) 표준물질로 thiamine hydrochloride, nicotinamide, niacin, L-ascorbic acid, folic acid, B12를 사용하였다.

2.7. LC-MS/MS를 이용한 유효 성분 함량 분석

본 실험은 동백나무 잎 추출물의 유효 성분을 동정하기 위하여 HPLC-MS/MS (AB SCIEX 4000 Q Trap LC/MS/MS System, Shimadzu LC 20A System)를 이용하여 10종의 polyphenol을 분석하였다. 10 μL의 시료를 C18 column (Gemini 3 μm, C18 110A 50 mm × 2.0 mm)을 사용하여 column oven 40°C, autosampler 15°C에서 분석하였다. Turbo Ion Spray를 이용하여 음이온 모드와 양이온 모드에서 분석하였고, 이동상으로는 water (0.1% formic acid) (A), acetonitrile (0.1% formic acid) (B)를 사용하였다. 음이온 모드는 이동상(B)를 기준으로 0-0.5 min: B (20-20%), 0.5-2 min : B (20-80%), 2-2.5 min : B (80-80%), 2.5-2.6 min : B (80-20%), 2.6-6 min : B (20-20%) 와 0-3 min : B (30-30%) 등용매 조건으로 분석하였고 양이온 모드는 0-0.2 min : B (30-60%), 0.2-2 min : B (60-60%), 2-2.1 min : B (60-30%), 2.1-4 min : B (30-30%)로 분석하였다.

2.8. 통계처리

본 실험에서 얻어진 모든 결과값은 3회 이상의 반복 실험을 통하여 실험 결과값의 평균±표준오차로 나타내었다. 이에 대한 통계적 분석은 R-Studio program을 사용하여 Least Significant Difference Test (LSD test)방법으로 통계분석을 실시하였으며, 각 추출물 사이의 유의성을 판단하였다.

3.1. 동백 나무 잎 추출물 수율

본 연구에서는 동백나무 생잎과 열을 가하는 조건을 달리한 동백나무 잎을 열수 추출물로 제조한 후 동결건조하였고, 각 추출물의 수득률은 Table 1에 나타내었다. 생잎 건조 추출물 10.92%, 잎 찜 추출물 10.80%, 덖음 1차 추출물 10.24%, 덖음 2차 추출물 13.74%, 대용량 추출물 12.18%로 확인되었다. CJLH3가 가장 높은 수득률을 보였고 CJLH4가 두번째로 높은 함량을 보였다. 이는 덖음 공정으로 인해 분자량이 큰 polyphenol이 비교적 작은 단위로 분해되어 추출 과정에서의 용출이 용이해졌다고 판단된다.

Table 1 Yield results of Camellia japonica leaves extracts with different heat treatments. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4). CJLH3 showed the highest yield compared to other extracts

Sample	Weight (g)	Yield (%)
CJL	5.46	10.92
CJLH1	5.4	10.80
CJLH2	5.12	10.24
CJLH3	6.87	13.74
CJLH4	6.091	12.18

3.2. 항산화 활성 측정 결과

3.2.1. DPPH radical 소거능 측정 결과

본 실험에서는 동백나무 잎 추출물의 DPPH free radical 소거능을 확인하고 시료 농도에 따라 free radical이 50% 환원되는 농도를 IC₅₀값으로 나타내었다 (Fig. 2, Table 2). DPPH radical 소거능 실험 결과 모든 추출물의 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가하였다. IC₅₀값은 CJL이 120.39 μg/mL로 가장 높은 활성을 나타내었으며 덖음 잎 추출물은 비교적 낮은 활성을 보임을 확인하였다. 기존의 연구에서 Yang 등은 동백덖음 열수 추출물에서의 DPPH IC₅₀값을 443.17 μg/mL으로 보고하였는데 [10], 본 실험에서의 덖음 추출물인 CJLH2, CJLH3, CJLH4가 더 높은 활성을 보임을 확인하였다. 본 실험결과 DPPH radical 소거능은 동백나무 잎을 덖음 처리함에 따라 항산화 활성에 영향을 주는 것을 확인하였으며, 동백나무 잎에 함유되어 있는 polyphenol이외에 vitamin 또한 열처리로 인해 소실되어 항산화 활성에 영향을 미친 것으로 판단된다.

Figure 2. Antioxidant activity results of Camellia japonica leaves with different heat treatments. (A) DPPH free radical scavenging activity; (B) ABTS radical scavenging activity; (C) Nitrite scavenging activity; (D) Ferrous metal ions (Fe²⁺) chelating activity. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4). In (A), (B), and (C), CJL showed the highest scavenging activity compared to other extract. In (D), CJLH3 showed the highest scavenging activity compared to other extracts.

Table 2 Antioxidant activity results of Camellia japonica leaves with different heat treatments. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4)

Sample	DPPH IC50 (μg/mL)	ABTS IC50 (μg/mL)	Nitrite IC50 (μg/mL)	Ferrous metal ions chelating activity (%)
CJL	120.39 ± 0.11 b	254.65 ± 3.25 b	121.09 ± 1.22 c	13.33 ± 1.39 ab
CJLH1	180.17 ± 1.20 ab	359.01 ± 3.43 ab	141.45 ± 1.40 b	4.77 ± 1.86 b
CJLH2	173.47 ± 4.43 ab	337.01 ± 1.48 ab	144.49 ± 0.62 ab	7.94 ± 0.90 b
CJLH3	165.45 ± 2.49 ab	341.64 ± 1.74 ab	149.25 ± 1.10 ab	24.89 ± 2.21 a
CJLH4	212.07 ± 6.55 a	396.34 ± 5.50 a	182.48 ± 2.33 ab	13.33 ± 1.93 ab
Gallic acid	16.85 ± 0.31 c	32.92 ± 0.40 c	24.09 ± 0.30 c	-

The statistical analysis of each group was performed through LSD test in R. “a-c” was used to distinguish the statistical significance of each data. p-value < 0.05

3.2.2. ABTS radical 소거능 측정 결과

본 실험에서는 동백나무 잎 추출물의 ABTS radical 소거능을 확인하고 그에 따른 IC₅₀ 값으로 나타내었다 (Fig. 2, Table 2). ABTS radical 소거능 실험 결과 모든 추출물의 항산화 활성은 농도 의존적으로 증가하였다. IC₅₀값은 DPPH radical 소거능 측정 결과와 마찬가지로 CJL이 254.65 μg/mL로 가장 우수한 활성을 나타내었으며 CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4은 각각 359.01 μg/mL, 337.01 μg/mL, 341.64 μg/mL, 396.34 μg/mL으로 확인되었다. 기존의 연구에서 Yang 등은 동백 덖음 열수 추출물에서의 ABTS IC₅₀값을 463.03 μg/mL으로 보고하였는데 [10], 본 연구에서의 덖음 추출물인 CJLH2, CJLH3, CJLH4가 더 높은 활성을 보임을 확인하였다. 또한 DPPH radical 소거능 측정은 친수성 물질만 측정할 수 있는 반면, ABTS radical 소거능 측정은 친수성과 친유성 화합물을 동시에 측정할 수 있다 [25]. 본 연구는 열수 추출물을 사용했기 때문에 친수성 물질의 항산화 활성 검증에 비교적 유리한 DPPH 소거능 활성이 높게 나온 것으로 판단된다.

3.2.3. Nitrite 소거능 측정

본 실험에서는 동백나무 잎 추출물의 nitrite (NO₂^-) 소거능을 확인하고 시료 농도에 따라 nitrite (NO₂^-)가 50% 소거되는 농도를 IC₅₀값으로 나타내었다 (Fig. 2, Table 2). IC₅₀값은 CJL이 121.09 μg/mL로 가장 우수한 활성을 나타내었으며 CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4은 각각 141.45 μg/mL, 144.79 μg/mL, 149.25 μg/mL, 182.48 μg/mL으로 확인되었다. 기존의 연구에서 Kim등은 동백나무 잎의 아질산염 소거능이 농도 의존적이었으며 천연 산패 방지제로써의 가능성을 보고하였다 [26]. 또 Cooney 등은 polyphenol 화합물이 nitrite (NO₂^-)의 나이트로화 반응을 억제한다고 보고하였다 [27].

3.2.4. Ferrous metal ions (Fe²⁺) 킬레이팅 측정

본 실험에서는 동백나무 잎 추출물을 5 mg/mL 농도로 제조하여 ferrous metal ions (Fe²⁺) 킬레이팅 효과를 확인하였다(Fig. 2, Table 2). 실험 결과 CJL, CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4의 활성은 각각 13.33%, 4.77%, 7.94%, 24.89%, 13.33%로 확인되었고 그 중 CJLH3의 활성이 가장 높은 것을 확인하였다. 기존의 연구에서 Kim은 동백나무 겨우살이 잎의 메탄올 추출물에서 더 높은 ferrous metal ions (Fe²⁺) 킬레이팅 효과를 보였으며 추출 용매 유형과 수확 시간에 의존성이 높음을 보고하였다 [28]. 또한 -OH, -SH, -COOH, -C=O, -S, -O, -NR2의 작용기가 두 개 이상 존재할 경우 Fe²⁺, Cu+와 같은 금속이온을 효과적으로 킬레이트 하기 때문에 유기산 및 polyphenol 화합물이 radical 형성을 억제함으로써 지질 산화를 방지하는 데 효과가 있다고 알려져 있다 [29]. 본 연구에서의 동백나무 잎 열수 추출물은 높은 농도에 비해 낮은 활성을 나타냈는데 추출물이 함유한 화합물의 작용기 차이로 인한 것으로 판단되며 추출 용매에 따른 추가적인 실험이 사료된다.

3.3. 총 폴리페놀 함량 측정 결과

본 실험에서는 열을 가하는 방식을 달리한 동백나무 잎 추출물의 TPC를 표준물질 gallic acid와 tannic acid를 이용하여 확인하였다 (Table 3). 표준물질의 검량 곡선을 이용하여 확인한 결과, CJL의 TPC는 190.51 GAE mg/g, 230.99 TAE mg/g으로 가장 우수한 함량으로 확인되었고 CJLH1은 142.14 GAE mg/g, 175.37 TAE mg/g으로 CJLH2은 144.00 GAE mg/g, 172.90 TAE mg/g으로 CJLH3은 139.11 GAE mg/g, 164.30 TAE mg/g으로 CJLH4은 119.40 GAE mg/g, 149.07 TAE mg/g으로 확인되었다. 기존의 연구에서 동백나무 덖음 잎 열수 추출물의 총 polyphenol 함량은 89.75 GAE mg/g으로 보고되었고 본 실험에서의 열처리된 추출물은 기존의 연구 결과보다 높은 polyphenol 함량이 확인되었다 [10]. Kim 등은 무처리군과 덖음 무말랭이 차와 비교하여 덖음의 시간이 증가함에 따라 총 polyphenol 함량이 증가하였다 [8].

Table 3 Total polyphenol contents (TPC) and total flavonoid contents (TFC) of several extracts from Camellia japonica leaves with different heat treatments. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4)

Sample	TPC (GAE mg/g)	TPC (TAE mg/g)	TFC (QUE mg/g)	TFC (RE mg/g)
CJL	190.51 ± 0.52 a	230.99 ± 1.33 a	25.31 ± 0.15 a	35.99 ± 1.02 a
CJLH1	142.14 ± 0.79 b	175.37 ± 3.37 b	22.58 ± 0.30 b	38.49 ± 2.33 a
CJLH2	144.00 ± 1.90 b	172.90 ± 1.60 bc	23.73 ± 0.59 ab	39.12 ± 3.18 a
CJLH3	139.11 ± 0.94 bc	160.30 ± 1.17 bc	22.58 ± 0.15 b	33.92 ± 0.29 a
CJLH4	119.40 ± 0.41 c	149.07 ± 1.59 c	19.00 ± 0.15 c	26.85 ± 0.29 a

The statistical analysis of each group was performed through LSD test in R. “a-c” was used to distinguish the statistical significance of each data. p-value < 0.05

3.4. 총 플라보노이드 함량 측정 결과

본 실험에서는 열을 가하는 방식을 달리한 동백나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량을 표준물질 quercetin과 rutin을 이용하여 확인하였다 (Table 3). 표준물질의 검량 곡선을 이용하여 총 플라보노이드 함량을 확인한 결과, CJL은 25.31 QUE mg/g, 35.99 RE mg/g으로 CJLH2은 22.58 QUE mg/g, 38.49 RE mg/g으로 CJLH3은 23.73 QUE mg/g, 39.12 RE mg/g으로 CJLH4은 22.58 QUE mg/g, 33.92 RE mg/g으로 CJLH5은 19.00 QUE mg/g, 26.85 RE mg/g으로 확인되었다. 기존의 연구에서 동백나무 덖음 잎 열수 추출물의 총 플라보노이드 함량은 32.76 QUE mg/g으로 보고되었고 [10] 본 실험에서의 덖음 잎 추출물과 약 10.00 QUE mg/g 차이가 나는 것을 확인하였다. 본 연구는 가장 높은 함량을 보이는 CJL의 35.99 RE mg/g과 가장 낮은 함량인 CJLH4의 26.85 RE mg/g을 비교했을 때, 각 추출물에 함유된 플라보노이드의 함량이 비슷하다고 판단된다.

3.5. 효소 활성 저해 측정 결과

3.5.1. α-Glucosidase 활성 저해 측정 결과

본 실험에서는 동백나무 잎 추출물 시료 농도에 따라 α-glucosidase를 50% 저해하는 농도를 IC₅₀값으로 나타내었다(Fig. 3, Table 4). IC₅₀값은 CJL이 65.73 μg/mL로 가장 우수한 활성을 나타내었으며 CJLH1, CJLH2, CJLH3, CJLH4은 각각 81.22 μg/mL, 82.73 μg/mL, 96.13 μg/mL, 111.24 μg/mL으로 확인되었다. 또한 acarbose는 α-glucosidase 저해제 중 하나로, 동백나무 추출물의 양성 대조군으로 사용되었는데 동백나무 추출물의 IC₅₀값이 acarbose보다 더 효과적인 것을 확인하였다. 기존의 연구에서 Park 등은 용매에 따른 동백나무 겨우살이 추출물의 α-glucosidase 활성 저해를 비교하였는데 열수 추출물의 IC₅₀값이 6.10 μg/mL으로 높은 활성이 나타남을 보고하였다 [11]. 또한 Liu 등은 -OH, -SH, -COOH, -C=O, -O, -NR2의 작용기가 α-glucosidase 활성을 억제한다고 보고하였다 [30]. 이러한 작용기로 인해 본 연구에서의 α-glucosidase 저해에 높은 활성을 보인 반면, ferrous metal ions (Fe²⁺) 킬레이팅 측정에서는 낮은 활성을 보였다. Ferrous metal ions (Fe²⁺) 킬레이팅 활성은 금속 이온에 의해 활성화된 효소를 비활성화시키지만 α-glucosidase 활성 억제는 다당류 분해 효소의 활성을 억제하는 것으로 서로 다른 다른 반응 기작이다.

Figure 3. Enzyme inhibition activity results of Camellia japonica leaves with different heat treatments. (A) α-Glucosidase inhibition activity. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4). CJL showed the highest scavenging activity compared to other extracts. ; (B) Lipase inhibition activity. CJLH2 showed the highest scavenging activity compared to other extracts.

Table 4 Enzyme inhibition activity results of Camellia japonica leaves with different heat treatments. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4)

Sample	α-Glucosidase inhibition IC50 (μg/mL)	Lipase inhibition IC50 (μg/mL)
CJL	65.73 ± 1.33 b	14,108.42 ± 191.15 ab
CJLH1	81.22 ± 1.83 b	12,900.14 ± 313.14 b
CJLH2	82.73 ± 0.37 b	12,660.11 ± 208.92 b
CJLH3	96.13 ± 2.05 b	21,099.92 ± 1599.07 a
CJLH4	111.24 ± 1.03 b	14,210.40 ± 198.06 ab
Acarbose	1,528.09 ± 36.23 a	-
Gallic acid	-	1,882.68 ± 4.42 c

The statistical analysis of each group was performed through LSD test in R. “a-c” was used to distinguish the statistical significance of each data. p-value < 0.05

3.5.2. Lipase 활성 저해 측정 결과

본 실험에서는 동백나무 잎 추출물 시료 농도에 따라 lipase를 50% 저해하는 농도를 IC₅₀값으로 나타내었다 (Fig. 3, Table 4). IC₅₀값은 CJL2가 12,660.11 μg/mL로 가장 높은 활성을 나타내었으며 CJL, CJLH1, CJLH3, CJLH4은 각각 1,408.42 μg/mL, 12,900.14 μg/mL, 21,099.92 μg/mL, 14,210.40 μg/mL으로 확인되었다. 기존의 연구에서 Park 등은 동백나무 겨우살이 에탄올 및 열수 추출물의 500 μg/mL 농도에서 저해능이 59.2%, 20.6%으로 보고하였다 [11]. 또한 Jeon 등은 차나무 (Camellia sinensis)과인 녹차, 홍차 잎 추출물에서의 IC₅₀ 값은 320 μg/mL, 1,270 μg/mL으로 보고하였다 [31]. 본 실험에서의 동백나무 잎 추출물의 lipase 활성 저해능이 비교적 낮음을 확인하였고 중성지방 (triglyceride, TG)의 억제할 가능성이 낮은 것으로 판단된다. 기존 연구 결과를 고려하여 비교적 활성이 좋은 유기용매 추출물의 저해능을 측정하여 비교해 볼 필요성이 있다.

3.5. HPLC를 이용한 폴리페놀 함량 분석

열처리하지 않은 추출물과 열처리 공정 방식을 달리한 동백나무 추출물에 함유된 유효성분을 확인하고 polyphenol과 vitamin의 함량을 비교하기 위해 HPLC 분석을 진행하였다(Fig. 4, Table 5). 그 결과 CJL에서의 polyphenol 함량과 vitamin의 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다. 분석된 polyphenol 중에서 CJL에서 catechin의 함량이 16,032.5 μg/g으로 가장 높은 것으로 확인되었고 가장 낮은 함량인 CJLH4는 1,255.15 μg/g으로 약 12배의 함량 차이를 보인다. vitamin에서는 L-ascorbic acid의 함량이 2044.45 μg/g으로 다른 표준물질보다 높은 함량으로 확인되었고 CJLH3, CJLH4에서 확인되지 않았다. HPLC를 이용한 정량 분석을 통해 CJL이 polyphenol과 vitamin의 함량이 비교적 높은 것을 확인하였으며, DPPH, ABTS 및 TPC, TFC의 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. 기존의 연구에서는 tannic acid가 열처리될 때 gallic acid로 일부 분해되어 100°C까지는 gallic acid의 함량이 증가하지만, 그 이후의 높은 온도에서는 gallic acid 또한 분해되었다[32]. 본 연구에서는 열처리된 추출물일수록 gallic acid의 함량이 증가한 것을 확인하였다. 그러나 각 추출물에 함유된 tannic acid의 함량 차이 때문에 tannic acid의 함량도 높게 측정되었으며, 이로 인해 gallic acid도 더 많이 분해된 것으로 판단된다. 또한, 높은 온도를 이용한 덖음 공정으로 인해 생리활성에 영향을 미치는 화합물들이 분해될 가능성이 있으므로, 보다 정확한 결과를 위해 다양한 온도에서 실험을 검증할 필요가 있다.

Figure 4. HPLC profile of Camellia japonica leaves extracts with different heat treatments and standard mixture using diode array detection at 280 nm(A) Camellia japonica leaves extract (CJL); (B) Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); (C) Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); (D) Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); (E) Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4); (F) standard mixture. Numbers indicate the following: (1) Thiamine hydrochloride; (2) L-ascorbic acid; (3) Niacin; (4) Gallic acid; (5) (+)-Catechin; (6) B12; (7) (-)-Epicatechin; (8) Folic acid; (9) Tannic acid; (10) Rutin; (11) Quercetin; (12) Kaempferol; (13) 4-Hydroxbenzoic acid.

Table 5 Polyphenol and vitamin compounds identified in Camellia japonica leaves solvent extracts quantified by HPLC. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4)

No.	Sample	CJL	CJLH1	CJLH2	CJLH3	CJLH4
1	Thiamine hydrochloride	-	-	-	-	-
2	L-ascorbic acid	2044.45 ± 93.03	1193.99 ± 68.19	1031.34 ± 730.19	-　-
3	Niacin	-	-	-	-	-
4	Gallic acid	372.79 ± 37.73	1406.91 ± 105.98	1559.67 ± 121.58	731.663 ± 47.51	2058.92 ± 105.29
5	(+)-Catechin	16032.5 ± 735.82	5857.84 ± 256.69	4916.9 ± 229.35	3431.45 ± 372.62	1255.15 ± 12.26
6	B12	-	-	-	-	-
7	(-)-Epicatechin	3497.89 ± 77.16	5462.87 ± 235.06	4671.02 ± 128.60	6416.49 ± 271.95	1090.07 ± 23.52
8	Folic acid	-	-	-	-	-
9	Tannic Acid	64.19	99.95 ± 1.55	81.79 ± 21.26	136.37 ± 9.92	171.46 ± 82.65
10	Rutin	5193.93 ± 190.62	4792.55 ± 158.76	4873.35 ± 550.21	6878.45 ± 428.59	1651.06 ± 53.17
11	Quercetin	154.27 ± 13.02	184.84 ± 16.89	164.42 ± 10.05	361.36 ± 281.95	26.54 ± 6.49
12	Kaempferol	-	-	-	-	-
13	4-Hydroxy benzoic acid	160.53 ± 4.72	249.56 ± 60.19	154.80 ± 12.43	170.13 ± 49.49	162.66 ± 10.29

3.6. LC-MS/MS를 이용한 유효 성분 함량 분석

HPLC 결과를 바탕으로 보다 더 정확한 유효성분 함량 분석을 위해 각 추출물에 함유된 polyphenol의 함량을 LC-MS/MS를 통하여 정량 분석하였다 (Fig. 5, Table 6). 분석된 polyphenol 중에서 catechin의 함량이 가장 높았으며 두 번째로 rutin이 높음을 확인하였다. 이는 동백나무 안의 유효성분 함량 순을 비교하였을 때 HPLC 분석 결과와 일치하는 것을 확인하였다. 하지만 CJL에서 tannic acid는 확인되지 않았으며, HPLC 분석 결과에서 언급한 것과 마찬가지로 각 추출물 간의 tannic acid 함량 차이와 온도 실험 등 추가적인 검증이 필요하다. 또한 polyphenol과 vitamin을 동시에 분석한 HPLC와는 달리, polyphenol만을 분석한 LC-MS/MS 분석 결과에서 CJLH3 추출물이 가장 높은 polyphenol 함량을 가지고 있음을 확인하였다.

Figure 5. Component analysis of Camellia japonica leaves extracts with different heat treatments by HPLC MS/MS. (A) Camellia japonica leaves extract (CJL); (B) Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); (C) Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); (D) Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); (E) Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4).

Table 6 Polyphenol compounds identified in Camellia japonica leaves with different heat treatments quantified by LC-MS/MS. Camellia japonica leaves extract (CJL); Steamed leaves extract from Camellia japonica leaves (CJLH1); Heat-treated leaves extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH2); Twice heat-treated extract from steamed Camellia japonica leaves (CJLH3); Mass heat-treated Camellia japonica leaves extract (CJLH4)

No.	Sample	CJL	CJLH1	CJLH2	CJLH3	CJLH4
1	4-Hydroxy benzoic acid	21.81	32.29	27.86	15.05	72.22
2	Coumaric acid	9.18	12.54	18.62	17.12	29.16
3	Rutin	2912.06	2956.59	3010.37	4597.18	682.93
4	Naringein	1.65	1.23	0.85	2.01	0.97
5	Nicotinic acid	-	-	-	-	23.53
6	Gallic acid	220.01	1227.59	1388.80	559.61	1953.26
7	Protocatechuic acid	825.10	816.62	926.27	101.37	865.04
8	Naringin	22.12	23.69	24.52	9.33	13.14
9	Catechin	4634.59	5654.61	4654.71	6195.48	1629.42
10	Tannic acid	-	1.15	4.25	2.49	111.00

본 연구는 동백나무 잎을 다양한 열처리 공정 방식으로 사용하여 생잎 건조 (CJL), 잎 찜 (CJLH1), 덖음 1차 (CJLH2), 덖음 2차 (CJLH3), 대용량 덖음 잎 추출물 (CJLH4)을 제조 후 항산화 및 항비만 활성을 평가하고, HPLC 및 LC-MS/MS를 통해 추출물에 함유된 유효성분의 함량 변화를 확인하였다. 동백나무 잎을 열처리함으로써 polyphenol 함량은 증가되고, 동시에 vitamin은 열분해 및 소실되어 다양한 생리 활성에 영향을 미친 것으로 보인다. 동백나무 잎은 다양한 생리 활성에 효과를 보이는 화합물들을 함유하고 있어 기능성 화장품 원료로써 이용 가능성이 높다고 판단된다. 동백나무 덖음잎의 경우 맛과 풍미를 증가시키고 지방 축적과 같은 효소저해 활성이 매우 뛰어나 식품 소재로서의 이용 가치가 높은 것으로 판단된다.

본 연구는 산림청 (한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업 (2022443B10-2222-0101)과 2020년도 정부 (교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업입니다 (No. 2020R1I1A1A01073631).