최근 웰빙, 건강, 기대수명에 대한 관심이 높아지면서 건강한 노화와 깨끗한 피부에 대한 관심도 높아지고 있으며, 다양한 천연자원 유래 성분들은 화장품의 기능성 원료로 사용되고 있다. 화장품의 다양한 기능 중 항산화 활성은 피부의 자외선 방어 메커니즘에 중요한 요소이며, 피부가 자외선과 공기에 노출되면 분자와의 반응을 통해 라디칼(radical) 및 비라디칼 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다 [1]. 자외선의 노출로 발생한 ROS는 항산화 물질을 파괴하고 지질 과산화, 단백질 산화, DNA 산화, 사슬 절단, 콜라겐(collagen)과 히알루론산(hyaluronic acid)의 비정상적인 교차 결합으로 주름과 멜라닌 생성을 유발하여 피부 노화를 촉진한다 [2-4]. 따라서, 과도한 자외선은 피부 방어 시스템을 방해할 수 있으므로, 피부 건강에 유해한 ROS의 과잉 생성을 억제할 수 있는 적절한 항산화제가 필요하다 [5].

붉가시나무(Quercus acuta Thunb.)는 상록활엽교목으로 우리나라 서해안, 남해안, 울릉도 및 제주도 등지에 자생하는 난대수종으로 탄소 흡수량 및 저장량이 높아 지구 온난화 및 기후 변화에 대처할 수 있는 기후변화 대응 수종이다. 붉가시나무는 다량의 폴리페놀(polyphenol) 및 플라보노이드(flavonoid) 성분을 함유하고 있어 항산화 활성 및 지질 산화 억제능이 매우 뛰어난 수종으로 알려져 있으며, 특히 붉가시나무 잎에는 친수성 성분중의 하나인 갈릭산(gallic acid)이 다량 함유되어 있다 [6]. 또한 카테킨(catechin), 및 클로로겐산(chlorogenic acid), 이소퀘르시트(isoquercitrin), 탁시폴(taxifolin), 과 같은 성분들이 다량 함유되어 있어 HSV-1 감염에 대한 바이러스 억제 효과가 있으며, HSV-1 감염 후 ROS 발현을 억제하고 NF-κB 활성 억제를 통해 염증성 사이토카인 발현이 억제 되었음이 증명되었다 [7]. 또 다른 연구에서는 붉가시나무 잎 메탄올(methanol) 추출물 및 에틸아세테이트(ethyl acetate) 추출물의 메티실린 내성 황색 포도상구균(MRSA), 황색포도상구균(KCTC1928) 및 대장균(KCTC1923)에 대해서 항균 활성 및 항생제 내성 세균 감염의 치료효과를 검증하였다 [8].

이와 같이 기존의 붉가시나무에 대한 연구는 주로 잎을 대상으로 항산화 활성, 항균 활성, 항염증 활성에 대해 주로 연구 되었으며, 잎과 가지 추출물의 폴리페놀 함량 분석 및 주름 개선에 관한 연구는 진행된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 붉가시나무 잎과 가지 추출물의 폴리페놀 함량 분석 및 항산화 활성, 주름 개선 효과를 검증하였으며, 콜라겐 분해의 주요 유전자 발현 비교를 통해 주름개선 기능성 화장품소재로 활용하고자 한다.

2.1. 시약 및 기기

본 연구에서 사용된 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), gallic acid, 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), potassium persulfate, quercetin, Folin-Ciocaltue’s phenol reagent, sodium carbonate, aluminum chloride, potassium acetate, calcium chloride (CaCl₂), 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg trifluoroacetate salt, collagenase (from Clostridium histolyticum), pancreatic solution, N-succinyl-(LAla)3-p-nitroanilide, hyaluronidase, dimethyl sulfoxide (DMSO), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), penicillin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Ethanol, methanol은 대정화금에서 구매하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Gibco (Thermo Fisher Scientific Inc., USA)에서 구입하여 사용하였다. 항산화 활성 및 효소 활성 측정을 위하여 Synergy HT사의 HT multi-detection microplate reader (BIO-TEX, Winooski, VT, USA)를 사용하였으며, 붉가시나무 추출물의 활성성분 분석을 위해 Shimadzu사의 AB SCIEX 4000 Q Trap LC/MS/MS System (Shimadzu LC 20A System)을 사용하여 분석하였다.

2.2. 붉가시나무 잎, 가지 추출물 제조

본 연구에 사용된 붉가시나무(Quercus acuta Thunb.) 잎과 가지는 전라남도 산림자원연구소에서 채취하였으며, 세척 및 건조하여 분쇄 후 분말로 사용하였다. 건조된 붉가시나무 원물을 잎과 가지로 분류하여 분쇄하였다. 증류수, 70% ethanol (EtOH), 100% ethanol을 사용하여 추출물을 제조하였다. 열수 추출물은 잎, 가지 분말 100 g과 증류수 1,000 mL를 침지시킨 후 autoclave를 이용하여 10분동안 100℃에서 추출을 진행하였다. 70% EtOH, 100% EtOH 추출물은 잎, 가지 분말 100 g을 각 용매 1,000 mL에 실온에서 일주일동안 침지 추출하였다. 각 추출물은 여과지(Whatman No. 2)로 여과한 후 회전감압농축기(rotary vacuum evaporator)로 농축 후 시료로 사용하였다. 수율 = (농축된 추출물의 무게(g) / 붉가시나무 잎, 가지 건조물의 무게(g)) × 100 식을 이용하여 계산하였으며, 농축된 추출물들은 Fig. 1에 나타낸 것으로 명명하여 실험을 진행하였다.

Figure 1. Isolation diagram of Quercus acuta leaves and branches extracts.

2.3. 항산화 활성

2.3.1. DPPH 자유 라디칼(free radical) 소거능 측정

DPPH 자유 라디칼 소거능은 Blois의 방법을 참고하여 붉가시나무 추출물의 라디칼 소거능을 측정하였다 [9]. 붉가시나무 추출물(QAL1-3, QAB1-3)을 50-750 μg/mL 농도로 제조한 후 시료 200 μL와 0.5 mM DPPH 시약 800 μL를 혼합하여 15분동안 암실에서 반응시켰다. 이후 HT multi-detection microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 gallic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였고, 붉가시나무 잎, 가지추출물의 DPPH에 대한 소거능 (IC₅₀)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.

2.3.2. ABTS radical 소거능 측정

ABTS radical 소거능은 Jeong 등의 방법을 참고하여 측정하였다 [10]. 7 mM의 ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate를 1:1로 혼합하여 15시간 동안 암소에서 반응을 유도하였다. 이후 ABTS 시약을 PBS (pH 7.4)를 이용하여 5배 희석한 ABTS 시약을 제조하였다. 붉가시나무 추출물을 50-300 μg/mL로 필요에 따라 희석한 후 시료 200 μL와 ABTS 시약 1000 μL를 혼합하여 암실에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 HT multi-detection microplate reader (Synergy HT, BIOTEX, Winooski, VT, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 quercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였고, 추출물의 ABTS에 대한 소거능(IC₅₀)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.

2.4. 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량 분석은 Folin-Ciocalteu 방법을 변형하여 측정하였다 [11]. 추출물의 농도는 500 μg/mL로 제조한 후 제조된 추출물 시료 500 μL, 0.2 M Folin-Ciocaltue’s phenol 시약 500 μL, 2% sodium carbonate (w/v) 500 μL를 순차적으로 혼합하였다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 HT multidetection microplate reader를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별로 희석한 gallic acid를 표준물질로 사용하여 검량 곡선을 작성한 후 gallic acid (GAE) mg/g 당량을 검량 곡선을 이용하여 환산하였다.

2.5. 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 Jo의 방법을 참고하여 측정하였다 [12]. 추출물의 농도는 500 μg/mL 로 제조한 후 제조된 시료 500 μL, methanol 1.5 mL, 10% aluminium chloride 100 μL, 1 M potassium acetate 100 μL, 증류수 1.4 mL를 순서대로 혼합하였다. 상온에서 40분 동안 반응시킨 후 HT multidetection microplate reader를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도별로 희석한 quercetin을 표준물질로 사용하여 검량 곡선을 작성한 후 quercetin equivalent (QUE) mg/g 당량을 환산하였다.

2.6. LC-MS/MS를 이용한 유효 성분 함량 분석

붉가시나무 추출물의 유효성분을 정량분석하기 위해 HPLC-MS/MS (AB SCIEX 4000 Q Trap LC/MS/MS System, Shimadzu LC 20A System)를 이용하여 57종의 폴리페놀을 분석하였다. 주입량 10 μL의 시료를 C₁₈ column (Gemini 3 μm, C₁₈ 110A 50 mm×2.0 mm)을 사용하여 column oven (40°C)조건에서 autosampler (15°C)를 이용하여 분석하였다. Turbo Ion Spray를 이용하여 음이온 모드와 양이온 모드에서 분석하였고, 이동상으로는 water (0.1% formic acid) (A), acetonitrile (0.1% formic acid) (B)를 사용하였다. 분석능 향상을 위해 이동상 B를 기준으로 분석시간에 따른 각 이동상의 혼합비율은 다음과 같이 분석하였다: 0-2.0 min : B (5-40%), 2.0-3.0 min : B (40-80%), 3.0-5.0 min : B (80-80%), 5.0-5.1 min : B (80-5%), 5.1-8.0 min : B (5-5%).

2.7. Collagenase, elastase and hyaluronidase 저해활성(inhibitory activity) 측정

2.7.1. Collagenase 저해활성 측정

QAL3, QAB3의 collagenase 저해 활성을 확인하기 위해 Choi 방법에 따라 진행하였다 [13]. 0.1M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여 4-phenylazobenzyloxycarbinyl-Pro-Leu-Gly-Pro-DArg (0.3 mg/mL)를 용해시킨 기질액 0.5mL 및 농도별로 제조된 붉가시나무 잎, 가지 추출물 0.2 mL의 혼합액에 200 unit/mL로 제조한 collagenase type 1 효소 용액 0.3 mL를 첨가하였다. 첨가된 용액은 20분간 실온에서 반응시킨 후 5% citric acid 0.5 mL를 넣어 반응을 정지시키고, ethyl acetate 1 mL를 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해 활성은 샘플 용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

2.7.2. Elastase 저해 활성 측정

붉가시나무 잎, 가지 추출물의 Elastase 저해 활성을 확인하기 위하여 Choi의 방법을 변형하여 실험을 진행하였다 [13]. 추출물 500 μL에 pancreatic solution (Type Ⅰ, 0.6 unit/mL) 용액 250 μL를 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(LAla)3-p-nitroanilide (1 mg/mL)를 500 μL를 첨가하였다. 용액은 30분간 37°C에서 반응시키고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해 활성은 샘플 용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

2.7.3. Hyaluronidase 저해 활성 측정

붉가시나무 잎, 가지 추출물의 hyaluronidase 저해 활성을 확인하기 위하여 Hwang 등의 방법을 변형하여 실험을 진행하였다 [14]. 붉가시나무 시료를 0.1 M acetate buffer (pH 3.5)에 녹인 hyaluronidase (10 mg/mL) 6 μL를 붉가시추출물 6 μL를 혼합 시킨 후 37°C 항온수조에서 20분 간 반응 시켰다. Hyaluronidase를 활성화시키기 위해 혼합액에 12.5 mM CaCl₂ 6 μL를 가한 후 37°C 항온수조에서 20분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 0.1 M acetate buffer (pH 3.5)에 녹인 기질용액 hyaluronate (6 mg/mL) 12 μL를 반응액에 첨가하여 37°C 항온수조에서 40분간 반응시켰다. 기질-효소 반응 정지를 위해 0.4N NaOH 6 μL와 0.4 M potassium tetraborate 6 μL를 반응액에 가하여 100℃ 에서 3분간 반응시킨 후, 상온에서 완전히 냉각시켰다. 기질-효소 혼합액에 발색제인 DMAB solution 180 μL를 가한 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광값을 측정하였다. Hyaluronidase 저해 활성은 샘플 용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

2.8. 세포배양

HaCaT cell을 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 1% penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, USA)를 첨가하여 배지로 사용하였다. 동물세포배양기(Sanyo CO₂ Incubator, MCO-18AC, SANYO Electric Co., Ltd., OSA, JP)에서 5% CO₂, 37°C를 유지하며 배양을 진행하였다. 세포가 바닥 면적의 90% 정도까지 자란 상태에서 계대배양하여 실험을 진행하였다.

2.9. 세포독성평가

Cell suspension을 12 well에 1×10⁵ cells/mL 농도로 1 mL씩 분주하고, 배양기에서 24시간 동안 안정화를 시켰다. 붉가시나무 잎, 가지 추출물을 농도 별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. Choi의 방법에 따라 0.2 mg/mL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 well 당 1 mL씩 넣어 30분 동안 배양기에 방치하였다 [15]. 이후 상등액을 제거하고 Dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 well 당 300 μL씩 가하고 1분간 shaking하여 formazan을 완전히 용해시켰다. ELISA Bio-Tek instrument Inc (Winooski, VT, USA)을 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.

2.10. RNA Isolation and RT-PCR Analysis

TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 총 RNA 추출물을 얻었다. cDNA를 합성하기 위해 전체 RNA (2 g)를 올리고-dT18 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. 합성된 cDNA는 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 갖춘 고용량 cDNA 합성 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 증폭하였다. PCR 증폭산물은 2% 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드(Sigma, St. Louis)로 염색하여 분리하고 겔 이미지 분석기(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 이미지화했다. 다음과 같이 PCR 프라이머 서열이 사용되었다: human MMP3 sense 5’-AACCTGTCCCTCCAGAACCT-3’ and antisense 5’-GGAAGAGATGGCCAAAATGA-3’; human MMP9 sense 5’-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3’ and antisense 5’-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3’; human GAPDH sense 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ and antisense 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’. GAPDH는 표준화를 위한 참조 유전자로 사용되었다.

2.11. 통계처리

모든 결과에 대한 값은 3 회 반복 실험 후 통계처리를 진행하였다. 실험 결과 값들은 평균±표준편차로 나타내었다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 SPSS 27 (SPSS Inc., Chicago, IL) software를 Turkey의 방법으로 one-way ANOVA 분석을 실시하였으며, p < 0.05 이하 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

3.1. 붉가시나무 잎, 가지 추출물의 수율

붉가시나무 잎과 가지를 추출 용매에 따라 열수(QAL1, QAB1), 70% EtOH (QAL2, QAB2), 100% EtOH (QAL3, QAB3) 추출물로 제조하였고, 각 추출물의 수율은 Table 1에 나타내었다. 붉가시 잎, 가지 추출물 제조 결과, QAL2의 수율이 22.37%로 가장 높았으며, 붉가시나무 잎 추출물의 수율이 높은 것으로 확인되었다. 붉가시나무 잎과 가지는 추출용매에 따라 추출물의 수율이 다른것으로 확인되었는데 70% EtOH를 사용한 추출물이 높은 수율로 확인되었다. 70% EtOH은 친수성과 소수성 물질 모두 추출되어 70% EtOH 추출물의 수율이 가장 높은 것으로 판단된다 [16].

Table 1 Yield of Q. acuta Thunb. leaf and branch extracts

Sample	Weight (g)	Yield (%)
QAL1	10.96	10.96
QAL2	22.37	22.37
QAL3	16.34	16.34
QAB1	13.69	13.69
QAB2	14.57	14.57
QAB3	11.66	11.66

3.2. 항산화 활성 측정 결과

3.2.1. DPPH 라디칼 소거능 측정 결과

본 실험에서는 붉가시나무 추출물의 DPPH free radical 소거능을 확인하고 그에 따른 IC₅₀값을 Fig. 2와 Table 2에 나타내었다. IC₅₀값은 QAB3가 250.34 μg/mL로 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 각 추출물의 라디칼 소거능은 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. Kim 등은 붉가시나무 잎 열수 추출물과 에탄올 열수추출물에서 DPPH IC₅₀ 값을 73.67 μg/mL, 59.01 μg/mL으로 보고하였다 [8]. 또한 Yoon 등은 붉가시나무 잎 EtOAc 추출물에서의 DPPH IC₅₀ 값을 10.6 μg/mL 으로 보고하였다 [17]. 본 연구 결과와 비교했을 때, 에탄올 추출물의 DPPH free radical 소거능이 더 높은 것이 일치하였다.

Figure 2. Antioxidant activities of Q. acuta Thunb. leaf and branch extracts. (A) DPPH free radical scavenging activity; (B) ABTS radical scavenging activity.

Table 2 Antioxidant activity, total polyphenol contents (TPC), and total flavonoid contents (TFC) of several extracts from Q. acuta Thunb. leaf and branch

Sample	DPPH IC50 (μg/mL)	ABTS IC50 (μg/mL)	TPC (GAE mg/g)	TFC (QUE mg/g)
QAL1	409.90 ± 2.84f	247.86 ± 1.74g	97.85 ± 0.25f	14.69 ± 0.52f
QAL2	286.65 ± 0.99c	163.63 ± 2.53e	112.90 ± 0.25d	17.02 ± 0.30e
QAL3	255.30 ± 2.04b	132.91 ± 4.68c	140.61 ± 0.22b	32.49 ± 0.52c
QAB1	340.70 ±2.57e	199.31 ± 0.81f	120.93 ± 0.76e	22.11 ± 0.30d
QAB2	296.59 ±3.54d	150.60 ± 1.89d	122.49 ± 0.56c	35.88 ± 0.30b
QAB3	250.34 ± 2.64b	117.54 ± 5.72b	159.99 ± 0.97a	56.87 ± 0.60a
Gallic acid	30.83 ± 0.45a	-	-	-
Quercetin	-	26.24 ± 0.95a	-	-

The statistical analysis of each group was performed through Duncan's multiple range test in SPSS 26 program. “a-g” was used to distinguish the statistical significance of each data. p-value < 0.05.

3.2.2. ABTS 라디칼 소거능 측정 결과

본 실험에서는 붉가시나무 추출물의 DPPH free radical 소거능을 확인하고 그에 따른 IC₅₀값을 Fig. 2와 Table 2에 나타내었다. 본 실험에서의 QAB3 추출물의 IC₅₀값은 117.54 μg/mL으로 값이 가장 낮았으며, 높은 항산화 활성을 가지는 것을 확인하였고 각 추출물의 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였다. 붉가시나무 잎과 가지를 비교했을 때 가지 추출물에서의 소거능이 더 높은 것을 확인하였고 DPPH radical 소거능 실험 결과와 일치한다. ABTS cation radical은 친수성 및 소수성 물질의 항산화 능력을 측정할 수 있어 DPPH radical에 비해 비교적 높은 소거능을 보인다 [18]. Hong 등은 붉가시나무 열매 열수 추출물을 HaCaT cells를 통해 ABTS 라디칼 소거능을 확인하였는데 5-50 μg/mL 농도에서 높은 소거능을 보이는 것을 보고하였다 [19]. 본 연구결과와 비교하였을 때 붉가시나무 추출물은 잎, 가지 모두 높은 활성을 가지는 것과 유사하다.

3.3. 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 측정 결과

본 실험에서는 추출 용매를 달리한 붉가시나무 추출물의 총 폴리페놀 함량은 표준물질 gallic acid 를 사용하여 확인한 결과를 Table 2에 나타내었다. 표준물질의 검량 곡선을 이용하여 확인한 결과, QAB3가 239.36 GAE mg/g으로 가장 높은 함량으로 확인되었고 항산화 실험 결과와 유사한 것으로 확인되었다. 총 플라보노이드 함량은 표준물질을 quercetin을 사용하여 확인하였다. 총 플라보노이드 함량 측정결과 14.69-56.87 QUE mg/g이였으며, QAB3의 함량이 56.87 QUE mg/g 로 가장 높은 함량으로 확인되었다. Kim 등은 잎 열수 추출물과 에탄올 추출물에서의 총 폴리페놀 함량이 74.21 GAE mg/g과 85.20 GAE mg/g으로 보고하였다 [8]. 또한 Yoon 등은 잎 EtOAc 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 126.00 GAE mg/g으로 보고하였다 [17]. Hyun 등은 제주도에 자생하는 식물자원을 연구하였는데 제주도에 자생하는 붉가시나무 70% methanol 추출물의 총 폴리페놀의 함량은 236.00 mg GAE/g으로 보고하였다 [20]. 본 연구결과가 기존 연구들보다 총 폴리페놀 함량이 더 높은 것으로 확인되었다. 그리고 붉가시나무 잎 추출물보다 가지 추출물의 총 폴리페놀 함량이 높았으며, 열수추출물보다 에탄올 추출물의 함량이 더 높은 것을 확인하였다.

3.4. LC-MS/MS를 이용한 유효 성분 함량 분석

붉가시나무 추출물의 유효성분을 분석하기 위하여 LC-MS/MS를 통하여 정량 분석을 진행하였고, 분석 결과는 Table 3에 나타내었다. 분석 결과, 폴리페놀인 catechin의 함량이 상대적으로 높은 것을 확인하였고, QAL3에서 15,400 μg/g으로 가장 높은 함량을 가지는 것을 확인하였다. 총 함량 분석 결과, QAL3, QAL2, QAL1, QAB3, QAB2, QAB1 순으로 함량이 높은 것을 확인하였고 잎 추출물에서의 총 함량이 높았다. 붉가시나무 잎 추출물과 가지 추출물은 용매별로 함량 차이가 발생되는 것을 확인하였다. 잎과 가지를 이루는 폴리페놀의 종류에 차이가 있었는데 fumaric acid 같은 경우 잎 추출물에서는 확인되지 않았고, 가지추출물에서만 확인되었다[8]. 또 pyrogallol 물질은 붉가시나무 잎과 가지 모두 열수 추출물에서만 확인되었다. 이와 같은 실험결과를 통해 붉가시나무 잎과 가지 부위에 따라 추출되는 폴리페놀 함량이 다르며, 추출 용매에 따라 추출되는 폴리페놀이 달라지는 것을 확인하였다. Kim 등은 붉가시나무 잎 열수 추출물과 에탄올 추출물의 catechin, (-)-epicatechin, taxifolin의 함량을 보고하였는데 그 중 catechin 함량이 15,710 μg/g, 19,250 μg/g 함량을 가지는 것을 확인하였다 [8]. 본 연구에서의 결과와 비교했을 때, 잎 열수 추출물(QAL1)의 함량과 에탄올 추출물(QAL3)에서의 catechin 함량과 거의 일치하는 것을 확인하였다. 또한 Kim 등은 붉가시나무의 줄기 추출물에서 catechin, chlorogenic acid, taxifolin 등의 화합물을 보고하였다 [7].

Table 3 Active ingredient identified in Q. acuta Thunb. leaf and branch extracts by LC-MS/MS (μg/g)

No.	Sample	QAL1	QAL2	QAL3	QAB1	QAB2	QAB3
1	Allopurinol	-	13.30	10.80	24.40	10.00	9.92
2	Apigenin	26.60	114.00	15.20	-　4.96	7.37
3	Caffeic acid	-	11.50	-	0.56	1.23	1.57
4	Catechin	7,690.00	12,000.00	15,400.00	7,320.00	9,400.00	11,300.00
6	p-Coumaric acid	13.00	29.40	6.50	4.48	8.34	0.77
7	Epicatechin	231.00	348.00	463.00	234.00	271.00	335.00
8	Epicatechin gallate	-	5.36	-	4.51	35.30	26.30
9	Ethyl gallate	1.59	33.10	99.10	-　39.30	154.00
10	t-Ferulic acid	15.90	17.30	8.46	13.40	5.38	8.51
11	Fumaric acid	-	-	-	20.50	15.60	2.31
12	Gallic acid	137.00	24.30	7.57	91.80	23.80	10.40
13	Genistein	9.72	38.20	4.35	-	-	1.31
14	Gentisic acid	86.70	163.00	4.86	8.01	4.91	29.40
15	4-Hydroxybenzoic acid	-	9.66	6.07	7.80	4.48	3.87
16	Hyperoside	1,930.00	3,670.00	3,700.00	133.00	279.00	332.00
17	Luteolin	60.50	159.00	759.00	10.40	23.50	152.00
18	Naringenin	2.71	5.00	3.45	0.52	1.60	2.88
19	Nicotinic acid	25.80	18.80	5.82	-	5.15	11.80
20	Protocatechuic acid	40.30	24.60	48.31	41.30	23.90	48.40
21	Pyrogallol	66.60	-	-　11.70	-	-
22	Quercetin	75.00	156.00	313.00	-　-	76.60
23	Riboflavin	1.95	1.87	-	0.50	-	0.44
24	Salicylic acid	82.60	65.50	21.70	138.00	91.50	170.00
25	Shikimic acid	135.00	114.00	146.00	133.00	184.00	159.00
26	Syringic acid	27.80	10.60	8.31	58.90	26.30	61.00
27	Tannic acid	353.00	430.00	1,370.00	250.00	724.00	1,520.00
28	Taxifolin	14.20	42.80	44.10	9.63	68.90	101.00
29	Ursolic acid	8.42	215.00	265.00	-	821.00	830.00
30	Vanillic acid	15.20	39.10	18.40	59.80	35.80	37.00
Total		11,050.59	17,759.39	22,729.00	8,576.21	12,108.95	15,392.85

3.5. Collagenase, elastase and hyaluronidase 저해 활성 측정 결과

3.5.1. Collagenase 저해활성

Collagenase는 콜라겐을 분해하는 작용을 하며 주름개선 효과를 확인하는 주요 효소로 알려져 있다 [21]. 본 연구에서는 항산화 활성이 가장 높았던 붉가시나무 잎, 가지 100% EtOH 추출물(QAL3, QAB3)의 collagenase 저해 활성을 측정하기 위해 QAL3, QAB3을 50-1,000 μg/mL로 제조하여 실험을 진행하였다. 대조군으로 collagenase 저해제로 알려져 있는 oleic acid을 사용하였으며, QAL3, QAB3의 저해 활성을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. QAL3, QAB3의 collagenase 저해결과 IC₅₀값은 각각 440.40, 390.40 μg/mL로 측정되었으며, 양성대조군으로 사용한 oleic acid의 IC₅₀값은 89.52 μg/mL로 나타났다(Table 4). 양성대조군보다는 낮지만 붉가시 나무잎, 가지 추출물이 collagenase에 우수한 저해 활성을 가지는 것으로 확인되었다.

Figure 3. Collagenase, elastase, and hyaluronidase inhibitory activity of Q. acuta Thunb. leaf and branch extracts. (A) Collagenase inhibition activity; (B) Elastase inhibition activity; (C) Hyaluronidase inhibition activity.

Table 4 Enzyme inhibitory activity (collagenase, elastase, hyaluronidase) of Q. acuta Thunb. leaf and branch extracts

Sample	Collagenase IC50 (μg/mL)	Elastase IC50 (μg/mL)	Hyaluronidase IC50 (μg/mL)
QAL3	440.40 ± 8.86c	381.99 ± 4.67c	374.75 ± 5.59c
QAB3	390.40 ± 7.41b	309.44 ± 11.91b	307.98 ± 3.16b
Oleic acid	89.52 ± 2.85a	89.56 ± 3.07a	70.21 ± 0.43a

The statistical analysis of each group was performed through Duncan's multiple range test in SPSS 26 program. “a-c” was used to distinguish the statistical significance of each data. p-value < 0.05.

3.5.2. Elastase 저해활성

본 연구에서는 붉가시나무 잎, 가지 100% EtOH 추출물(QAL3, QAB3)의 elastase 저해 활성을 측정하기 위해 QAL3, QAB3을 50-1000 μg/mL로 처리하여 실험을 진행하였다. 대조군으로는 oleic acid을 사용하였으며, QAL3, QAB3의 저해활성을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. QAL3, QAB3의 elastase 저해결과 IC₅₀값은 각각 381.99, 309.44 μg/mL으로 측정되었으며, 양성대조군으로 사용한 oleic acid의 IC₅₀값은 89.56 μg/mL 로 나타났다(Table 4). 양성대조군보다는 낮지만 붉가시 나무 잎, 가지 추출물이 elastase에 우수한 저해 활성을 가지는 것으로 확인되었다.

3.5.3. Hyaluronidase 저해활성

붉가시나무 잎, 가지 100% EtOH 추출물(QAL3, QAB3)의 hyaluronidase 저해 활성을 측정하기 위해 QAL3, QAB3을 50-1000 μg/mL로 처리하여 실험을 진행하였다. 대조군으로는 oleic acid을 사용하였으며, QAL3, QAB3의 저해 활성을 측정한 결과는 Fig. 3과 Table 4에 나타내었다. QAL3, QAB3의 hyaluronidase 저해결과 IC₅₀값은 각각 374.75, 307.98 μg/mL 으로 측정되었으며, 양성대조군으로 사용한 oleic acid의 IC₅₀값은 70.21 μg/mL 로 나타났다. 기존의 연구에서 붉가시나무와 같은 참나무과에 속하는 떡갈나무(Quercus dentata) 줄기 추출물의 hyaluronidase의 저해활성을 확인한 결과 2 mg/mL농도에서 37.27%로 낮은 활성으로 확인되었다 [14]. 본 연구결과에서는 1 mg/mL 농도에서 90% 이상의 활성으로 확인되었다. 붉가시나무 잎, 가지 추출물이 우수한 보습효능을 가는지는 것으로 확인되었다.

3.6. 세포독성 평가 (MTT assay)

붉가시나무 잎, 가지 100% EtOH 추출물의 세포 독성을 측정하기 위해 각각 25, 50, 100 μg/mL 농도범위에서 세포 독성을 측정하였고 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 25-100 μg/mL에서 24시간이 지난 후 세포독성이 나타나지 않았다. 이와 같은 결과는 기존의 연구에서 붉가시나무 열매 추출물을 처리했을 때, 100 μg/mL 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았던 연구 결과와 유사한 것으로 확인되었다 [19].

Figure 4. Cytotoxic effects of Q. acuta Thunb. leaf and branch extracts in HaCaT cells were determined by MTT assays. (A) QAL3; (B) QAB3.

3.7. RT-PCR analysis

메탈로프로테아제(metalloprotease (MMPs))는 아연(Zn)을 포함하고 있는 엔도펩타아제(endopeptidase) 계열의 프로테아제(protease)이다. MMP는 extracelluar matrix (ECM)단백질을 degradation 시키며, 세포 표면의 receptor를 분해시킨다. MMP family 는 10종류 이상이 있으며, 특히 MMP-9는 gelastinase로써, collagen을 분해할 수 있으며, MMP-9 의 증가는 광노화를 유도한다 [22]. MMP-3는 stromelysin 1이라고도 하며, 기저막의 type collagen을 분해하며 zymogen인 proMMP-1을 활성화시킨다 [23]. MMP 중 MMP-3는 스트로멜리신1(stromelysin 1)으로 기저막의 type IV collagen을 분해하며 zymogen인 proMMP-1을 활성화한다고 알려져 있다[24]. 본 연구는 HaCaT 세포주에서 H2O2 처리한 뒤 MMP-3와 MMP-9의 mRNA 발현 정도를 측정하였고 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 실험 결과 붉가시나무 잎과 가지 추출물 농도 의존적으로 발현량이 감소하였다. 기존의 연구에서 붉가시나무 잎을 대상으로 99.9% 메탄올 추출물의 HSV-1에 대한 항바이러스 효과에 대해 연구를 진행하였으며, RT-PCR 결과 붉가시나무 추출물은 ROS 발현을 억제하고 NF-kB 활성 억제를 통해 염증성 사이토카인 발현을 억제한다는 것을 확인하였다. 주요 성분은 카테킨(catechin), 클로로겐산(chlorogenic acid), 프락신(praxin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 탁시폴린(taxufoiln)으로 확인되었다 [7]. 또 다른 연구에서는 붉가시나무 줄기 추출물의 소교세포에서 세포의 신호 조절 키아나제인 p38과 c-Jun N 말단 키나아제(MAPK)로 알려진 인산화를 억제함을 증명하였다 [25]. 이와 같이 기존의 연구는 주로 염증 억제에 관한 연구가 대부분이며, 본 연구에서는 붉가시나무 잎, 가지 추출물을 대상으로 기존의 연구에서 증명되지 않았던 MMP-3와 MMP-9의 mRNA 발현 감소를 확인하여 주름 개선에 효과적인 물질임을 증명하였다. 이와 같은 결과는 붉가시나무 잎과 가지 추출물의 주름개선 기능성 화장품 원료 및 이너뷰티 소재로써 활용 가능성이 있음을 시사한다.

Figure 5. RT-PCR analysis of Q. acuta Thunb. leaf and branch extracts in HaCaT cells. (A) QAL3; (B) QAB3.

본 연구는 전라남도 자생 난대성 수종인 붉가시나무 잎, 가지 추출물을 활용하여 항산화 활성 및 주름개선 효과에 대해서 검증을 하였다. 추출 용매는 열수, 70% EtOH, 100% EtOH를 사용하여 진행을 하였으며, 추출 수율은 잎, 가지 모두 70% EtOH의 수율이 가장 높은 것으로 확인되었다. 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정 실험에서는 붉가시나무 잎 추출물보다 가지 추출물의 함량이 높았으며, 100% EtOH 추출물의 함량이 가장 높게 측정되었다. 항산화 실험결과 DPPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능 모두 잎 추출물보다 가지 추출물의 활성이 높게 나타났으며, LCMS/MS 실험결과 catechin, taxifoline과 같은 소수성 물질의 함량이 높은 것으로 확인되었다. 주름개선 효과와 직접 관련된 효소인 collagenase, elastase, hyaluronidase 저해 활성 실험에서도 붉가시나무 잎 추출물보다 가지 추출물의 저해 활성이 높게 나타났다. HaCaT 세포주를 활용한 세포독성 실험에서 독성을 나타내지 않는 농도는 100 μg/mL 이하로 확인되었으며, 콜라겐 합성에 관련이 있는 MMP-3, MMP-9의 PT-PCR 실험 결과 농도 의존적으로 mRNA의 발현이 감소하였다.

이와 같은 결과는 붉가시나무 가지 추출물이 피부 노화방지 및 주름 개선에 효과적인 천연 자원이며, 주름개선 기능성 원료로써의 사용 가능성을 시사한다.

본 연구는 산림청(한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업 ‘(2023509A00-2323-AB01)’의 지원에 의하여 이루어진 것입니다.